保护动物免于慢病毒相关疾病的组合物和方法

专利名称：保护动物免于慢病毒相关疾病的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及一种新的猫免疫缺损病毒(FIV)毒株和该病毒各种突变形式。公开了可用于保护动物免于与慢病毒相关的疾病的组合物和方法。
猫中的猫免疫缺损病毒(FIV)感染导致与人被人免疫缺损病毒-1(HIV-1)感染导致的症状类似的疾病症状。疾病过程由短暂的急性期(8-10周)开始，接着是延长的无症状期(持续数周至数年)和最终的症状期(Ishida等，1990日本兽医科学杂志52645-648)。血浆中的病毒负载被证实与被感染猫的疾病期相关并可被用来预测加速FIV感染的疾病进程(Diehl等，1996，病毒学杂志，702503-2507)。
从结构上来讲，FIV原病毒包含两个长的末端重复(LTRs)，基因组的一个末端一个(Talbott等，1989，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA865743-5747)。具有三个大的开放读框(Gag(群抗原)；Pol(聚合酶)；和ENV(被膜))和编码调节蛋白的三个小的开放读框(Rev(病毒体表达的调节物，与存在于所有病毒转录物中的“RRE”元件结合并促进其从核转移至感染的宿主细胞的细胞质中的蛋白)；Vif(病毒体感染性因子)；和ORF(2)(开放读框2))。FIV的Gag前体多肽被加工成三种成熟的结构蛋白基质蛋白(MA)、壳体蛋白(CA)和核壳蛋白(NC)。Pol基因编码四种酶蛋白蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)、脱氧尿苷三磷酸酶(DU)和整合酶(IN)。最后，ENV前体多肽被加工成两个被膜蛋白表面蛋白(SU)和跨膜(TM)蛋白。
现已努力来开发一种安全有效的FIV疫苗。Matteucci发现接种了常规固定细胞疫苗的猫被保护免于同源病毒的攻击，尽管在接种后明显不存在中和抗体。发现保护为短期的且难于强化(Matteucci等，1996，病毒学杂志70617-622；Matteucci等，1997，病毒学杂志718368-8376)。这些结果可能与Verschoor的相反，在给予固定细胞疫苗后他未观察到保护作用(Verschoor等，1995，兽医免疫学与免疫病理学46139-149)。
测试的另一种类型的常规疫苗由完整灭活的FIV病毒组成。Yamamoto报道大于90％的被给予了这种类型的疫苗的猫基本显示完全的抗同源攻击的保护和轻微的抗异源病毒的保护(Yamamoto等，1993，病毒学杂志67601-605)。在接种的猫中诱导抗FIV的体液和细胞免疫性，并观察到高水平的抗ENV、抗核心和病毒中和(VN)抗体。相反，接种了掺入到免疫刺激复合物(ISCOMs)中的灭活的完整FIV的猫未保护动物免于同源攻击(Hosie等，1992，兽医免疫学与免疫病理学35191-197)。
另一种疫苗开发方法涉及使用包含重组核心蛋白、合成V3肽和重组ENV蛋白的亚单位疫苗(Elyar等，1997，疫苗151437-1444)。虽然通过该疫苗诱导显著水平的抗体，但没有鉴定出可保护猫抗同源FIV攻击的抗体(Huisman等，1998，疫苗16181-187；Flynn等，1997，病毒学杂志717586-7592；Tijhaar等，1997，疫苗15587-596)。结果表明使用亚单位类型的疫苗获得抗FIV的保护性免疫可能是困难的。
最近，Cuisinier报道了针对用于FIV的DNA疫苗进行的试验(Cuisinier等，1997，疫苗151085-1094)。对猫接种携带FIV结构基因的质粒，包括ENV和p10。虽然观察到强的体液免疫应答，但所有猫最终死于同源攻击。
本发明部分基于在本文称为FIV-141的一种新的猫免疫缺损病毒毒株的分离和鉴定。病毒的全部基因组序列已被确定，并不同于所有其它已知的FIV序列。编码FIV-141的质粒被保藏为ATCCNo.203001。A.基于FIV-141病毒的组合物和方法在第一个方面，本发明涉及具有对应于SEQ ID NO1的基因组序列的基本纯化的FIV-141病毒，被该病毒感染的宿主细胞以及在宿主细胞中产生的子代病毒。术语“基本纯化的”指FIV-141已从所有其它病毒毒株，尤其是从FIV所有其它毒株中分离。可用于培养病毒的宿主细胞包括外周血单核细胞(PBMCs)。可使用如下所述的标准方法分离子代病毒。
FIV-141病毒和被该病毒感染的宿主细胞可被用来感染动物，用于诱导产生优先与一种或多种FIV毒株反应的抗体。如本文所采用的，抗体的“优先结合”指对FIV具有比任何其它病毒或非FIV蛋白高至少100倍的亲和性。可在任何通常用于此目的的动物中产生抗体(如小鼠、兔、山羊或绵羊)，但优选在家猫中制备抗体。当病毒被用来诱导抗体产生时，如果需要，可在感染之前将其灭活。灭活方法可包括将病毒用福尔马林、低聚甲醛、苯酚、乳丙酸、紫外线、加热、补骨脂、内酯铂复合物、臭氧或其它杀病毒剂处理。当表达FIV-141的宿主细胞被用来诱导抗体产生时，可在感染前固定细胞。通常，这包括如本文所描述的将细胞用低聚甲醛处理，但也可以常用其它方法。针对FIV-141制备的抗体本身被包括在本发明范围中，并可使用现有技术熟知的方法纯化(参见例如Harlow等，1988，抗体实验室手册，冷泉港实验室，N.Y.)。
另一方面，本发明涉及含有灭活的FIV-141病毒的全病毒疫苗。可通过以足以诱导抗随后的FIV-141感染的保护性免疫的量和持续时间给予该疫苗来诱导猫中的免疫应答。通常，经胃肠外以例如2-8周的间隔进行两次或多次接种来施用疫苗。本发明还包括固定细胞疫苗，其由被FIV-141病毒感染的宿主细胞组成。该疫苗的施用遵循用于全病毒疫苗所使用的相同的常规方法。本领域熟知的标准方法可用于优化免疫接种程序。B.基于FIV-141基因组核酸的组合物和方法在另一个方面，本发明涉及具有对应于SEQ ID NO1的序列的基本纯化的核酸分子(DNA或RNA)。如本文所采用的，“基本纯化的”指所需产物基本上不含污染的细胞成分。“基本纯化的”核酸通常含有至少85％的样品，优选更高的百分数。污染物可能包括蛋白、碳水化合物或脂类。用于确定核酸纯度的一种方法为在如聚丙烯酰胺或琼脂糖介质中将制备物进行电泳。通过染色后单一带的出现来证实纯度。用于评价纯度的其它方法包括色谱和分析离心。可使用FIV-141核酸取代全病毒来转染宿主细胞，从而诱导子代病毒或病毒蛋白的产生。
本发明还包括通过将核酸直接注射至动物中或通过施用被核酸转染的宿主细胞来诱导针对FIV-141的抗体产生的方法。如上面对全病毒所讨论的方法，可在施用前固定宿主细胞。可从动物中纯化抗体并用于设计用来检测培养基或生物液体中FIV存在的分析中。
被FIV-141基因组DNA转染的宿主细胞还可被用在用于免疫猫的疫苗中。如果需要，可将这些细胞固定以降低病毒感染性，例如通过用如低聚甲醛的试剂处理。以这种方法制备的疫苗可被用来诱导猫中的免疫应答。可使用被优化用于诱导抗随后的被FIV-141，或者如果需要，被FIV的一些其它毒株感染的保护性免疫的标准免疫方法来施用疫苗。C.减毒的FIV-141病毒和疫苗在可将全病毒作为疫苗施用于动物之前，必须将其转化为非致病形式。如上面所讨论的，这可通过灭活病毒或固定宿主细胞来实现。另一种方法包括将突变导入病毒中以将其转化为减毒形式。如本文所采用的，术语“减毒病毒”指与其野生型对应物相比，具有显著降低的感染性的病毒。如本文下面实施例部分所描述的，感染性可在PBMCs中测定。
因此，本发明涉及相对于野生型(即非突变的)病毒，显示对猫T淋巴细胞显著降低的感染性的减毒FIV-141病毒。通过突变FIV-141基因组中的一个或多个基因来制备减毒病毒，其中这些基因选自Vif、MA、ORF(2)、ENV、CA、NC、SU、TMf、CT、IN、DU、V3/4、V7/8和RRE。本文描述了其中每一个基因的适宜的突变。可用于制备减毒病毒的一些特定突变的实例包括MA del、ENV del、V3/4 del、V7/8del、TMF del、CTdel、Vif del、Vifc del、Vifn del、ORF(2)del、CA del、NC del、IN del、DU del、SU del和RRE del。本发明还包括被减毒病毒感染的宿主细胞和由这些细胞产生的子代病毒。一旦产生，可使用标准方法从宿主细胞中纯化减毒病毒。
可通过用减毒病毒感染动物来诱导抗体的产生，或另一方面，可使用感染的宿主细胞。如果需要，可在施用于动物之前，灭活病毒或固定宿主细胞，并可使用标准方法从动物中纯化抗体。
此外，本发明包括使用如上所述的减毒的全病毒或被其中一种病毒感染的宿主细胞的疫苗。而且，可灭活减毒病毒并可固定宿主细胞。这些处理可提供疫苗本身不导致感染的附加的保证。基于一种或多种减毒的FIV-141病毒的疫苗可被用来诱导猫中的保护性免疫。在施用疫苗中可遵循标准的免疫方法以优化诱导抗随后的FIV-141攻击的保护性免疫。D.基于突变的FIV-141基因组DNA的组合物和方法另一方面，本发明涉及具有对应于SEQ ID NO1的序列，但被突变来编码减毒病毒的基本纯化的FIV-141核酸(DNA或RNA)。突变为选自Vif、MA、CA、NC、SU、TMf、ORF(2)、CT、ENV、Vifn、Vifc、IN、DU、V3/4、V7/8和RRE的一个或多个基因，并以在导入宿主细胞中时，相对于野生型病毒，产生对猫T淋巴细胞(或其它敏感的细胞类型)显著降低的感染性的病毒的方式来进行突变。本文描述了一些产生适宜的减毒病毒的特定突变的实例，包括MA del、ENV del、V3/4 del、V7/8 del、TMf del、CT del、Vif del、Vifc del、Vifn del、ORF(2)del、SU del、CA del、NC del、IN del、DU del和RRE del。本发明包括被突变核酸转染的宿主细胞和由宿主细胞产生的FIV子代病毒。
还包括在本发明范围中的是一种通过注射如上所述突变的核酸或被核酸转染的宿主细胞来诱导动物中FIV抗体产生的方法。如果需要，可在施用前固定宿主细胞。可使用标准方法纯化产生的抗体并用于设计用来检测FIV存在的分析中。
突变的核酸，优选DNA可被用于疫苗中，其中它以在施用于猫中时足以诱导保护性免疫的浓度存在。另一方面，疫苗可包括被该DNA转染的宿主细胞，如果需要，可在病毒蛋白表达后固定宿主细胞。可以足以在猫中诱导免疫应答的剂量和持续时间来施用疫苗，并可优化用于诱导抗随后的FIV-141感染的保护性免疫的免疫方法。E.制备和使用减毒慢病毒的方法本文公开的方法以及减毒的FIV-141的制备可被有效地用于FIV其它毒株和慢病毒的其它类型的减毒中。可通过突变一个或多个基因来制备相对于其未突变的野生型对应物具有显著降低的感染性的病毒，其中所述基因选自MA、CA、NC、DU、ENV、SU、TMf、CT、Vif、ORF(2)、Vifn、Vifc、IN、V3/4、V7/8和RRE。突变应被设计为消除或显著降低基因产物的活性。这可通过缺失整个基因或通过缺失整个基因的大(例如1/4)部分来实现。本发明包括使用所公开的方法制备的减毒的慢病毒，被这些病毒感染的宿主细胞和通过将减毒病毒注射至哺乳动物中来诱导抗体产生的方法。抗体可从感染的哺乳动物中纯化并用于免疫分析。另外，纯化的抗体或来自被减毒病毒感染的动物的含有抗体的血清可被用来治疗哺乳动物的慢病毒感染。
如本文所采用的，术语“保护性免疫的诱导”等被用来广义地包括对接种产生应答的任何基于免疫的应答的诱导，包括起保护接种的哺乳动物抗特定的慢病毒作用的抗体或细胞介导的免疫应答或两者。如本文所采用的术语“保护性免疫”，“保护性应答”，“保护”等不仅指对由特定的慢病毒感染导致的哺乳动物中的所有症状或疾病的绝对保护，而且指所有该症状或疾病启动的可检测的延迟，所有被特定慢病毒的感染的程度或速率的可检测的降低或所有由特定慢病毒感染导致的疾病或症状或病情的严重性的可检测的降低。根据本发明的疫苗制剂应以足以减少一种或多种与哺乳动物感染相关的临床信号和病毒负载的剂量和持续时间来施用。当慢病毒为一种FIV毒株时，被治疗的哺乳动物为猫，与感染相关的信号包括免疫异常，如异常低水平的CD4+T淋巴细胞或异常增加数目的CD8+T淋巴细胞。其它临床信号通常包括脱发、贫血、慢性鼻炎、结膜炎、腹泻、消瘦、肠炎、龈炎、便血、神经异常和皮炎。
减毒的慢病毒(例如FIV的减毒株)或被该病毒感染的宿主细胞可以当施用于哺乳动物(如猫)时足以诱导免疫性的浓度用于疫苗中。可接着通过以足以诱导抗随后的被至少一种慢病毒毒株感染的保护性免疫的剂量和持续时间施用该疫苗来诱导免疫应答。F.制备和使用突变的慢病毒核酸的方法本发明还涉及一种制备适用于抗慢病毒，例如FIV感染的疫苗中的核酸的方法。这通过逆转录慢病毒的基因组RNA；克隆逆转录产物；突变一个或多个选自MA、CA、NC、SU、TMf、ORF(2)、CT、ENV、Vif、Vifn、Vifc、V3/4、V7/8、IN、DU和RRE；并接着克隆突变的核酸来完成。优选地，突变应为在导入宿主细胞中时，产生相对于通过未突变的野生型核酸产生的慢病毒，具有显著降低的感染性的减毒病毒。在FIV的情况下，对猫T-淋巴细胞的感染性应被降低或消除。
突变的慢病毒核酸可以如上面对FIV-141描述的相同方式纯化并用来转染宿主细胞，制备子代病毒，以及制备抗体。此外，核酸或被核酸转染的宿主细胞可被掺入至疫苗中并被用来诱导哺乳动物中的保护性免疫。优选地，核酸编码在猫PBMC中具有显著降低的感染性的FIV减毒株，包括T-淋巴细胞，如FeP2细胞。在这些情况下，在猫中将诱导免疫应答。


图1来自转染细胞的FIV的产生。将Crandel猫肾(CRFK)细胞用包含全长FIV-141基因组的质粒转染。在转染后24小时开始收集细胞悬液并使用酶免疫分析法分析FIVp26壳体蛋白的存在。
图2通过共培养感染FeP2 T淋巴细胞。将CRFK细胞培养在6孔平板中，并用编码全长FIV-141基因组的质粒DNA转染。转染后48小时，将2×106FeP2细胞加入各孔中。共培养后72小时开始分离FeP2细胞，并通过ELISA检测它们上清中的FIV p26壳体蛋白的存在。
图3通过吸附作用感染FeP2细胞。将2×106FeP2细胞悬浮在200ul来自用全长感染性FIV-141克隆转染的CRFK细胞的含有FIV-141病毒的条件培养基中。在感染后4天开始使用p26 ELISA分析来检测FeP2细胞上清的FIV-141病毒的存在。
图4通过缺失克隆表达FIV-141病毒蛋白。制备各种突变缺失FIV基因或调节区的克隆，并转染至CRFK细胞中。48小时后，通过ELISA分析细胞上清的FIVp26壳体蛋白的存在。显示了各种缺失克隆以及野生型FIV-141分子克隆的结果。
图5-10通过FIV-141突变体感染FeP2 T淋巴细胞。将CRFK细胞培养在六孔平板中，并用三种不同FIV-141缺失克隆中的一种感柒；Tmf del、ENV del或NC del。48小时后，将FeP2细胞加入到各孔中，并将共培养物再培养72小时。接着将FeP2细胞与CRFK细胞分离，使用ELISA分析法分析p26抗原的存在。将p26水平的检测每3-4天重复一次，结果示于图5中。使用下面克隆重复实验Vifndel、Vifc del和Vif del(图6)；MA del和CA del(图7)；V3/4 del；V7/8 del和CT del(图8)；ORF(2)del(图9)；和DU del，SU del，IN del和RRE del(图10)。A.FIV-141和编码病毒的DNA的制备本发明涉及一种新的基于其基因组核酸序列和生物功能不同于所有类似毒株的猫疫苗缺陷病毒的毒株(本文称为“FIV-141”)。虽然FIV-141的基因组由RNA组成，但它被逆转录为DNA并整合至感染宿主的基因组中。应理解本文涉及FIV的序列和该序列的突变形式包括逆转录的病毒RNA序列以及其对应的DNA。
已熟知如定点诱变的方法可用来将变异导入核酸的结构中。本发明包括通过这种或一些类似的方法导入的FIV-141核酸序列中的突变，只要产生的病毒的至少一个主要生物特性，例如其抗原性基本保持与产生它的病毒相同。在一个优选但非限制性的具体实例中，与野生型毒株比较，可检测地降低FIV-141感染性的突变落入本发明的范围内。例如下文描述的产生复制但显示大大降低的感染性的病毒的ENV基因组中的特定突变。本发明包括导致显著降低的病毒感染性的这种突变和其它突变。
如实施例部分所讨论的，完整的FIV-141基因组已被克隆，含有全长序列的质粒已被保藏，保藏号为ATCC 203001。可使用标准方法来分离该质粒并将其转染至能支持病毒产生的宿主细胞中。Crandel猫肾(CRFK)细胞已被发现适宜于此目的，但也可使用其它细胞类型，如猫T淋巴细胞。在一些情况下，可直接使用表达病毒的宿主细胞，例如可收集它们并用于产生抗体或以疫苗的形式使用。另外，可使用已知的分离方法，如蔗糖梯度离心以高度纯化的形式分离细胞中产生的病毒。这些方法对于野生型病毒和病毒的突变形式均有效。
另一种获得FIV-141基因组的方法为使用对应于SEQ ID NO1序列部分的引物进行PCR扩增。通常，引物应为约20-50碱基长度。设计扩增完整的FIV-141基因组的方法，或可单独扩增基因组的某些部分，并接着连接在一起以形成全长序列。下面实施例部分描述了已被发现为有效的具体的引物和方法，但可开发和使用另外的方法。
如果病毒从天然来源分离，那么PCR引物应对应于FIV-141所特有的序列。使用这些引物的成功的扩增表明导致感染的病毒实际上为FIV-141。因此，可诊断性地以及在分离病毒的方法中使用PCR。B.灭活的病毒和固定的宿主细胞的制备FIV-141病毒可被用来在适宜宿主中产生抗体以及用于疫苗中。在每一种情况下，通常可望在对动物施用之前灭活病毒。可通过本领域已知的任何方法完成灭活。例如，可纯化病毒，接着通过在0.8％福尔马林或1.25％低聚甲醛中保温约24小时来灭活。这些方法可用于野生型或突变型病毒。
还可使用被FIV-141感染的宿主细胞或该病毒的突变形式产生抗体或完成免疫。可使用任何能支持病毒复制的宿主细胞，包括外周血单核细胞(PBMCs)。通常，应在施用于动物之前将细胞固定。可通过在37℃下将细胞用低聚甲醛(例如1.25％)处理约24小时来进行固定。上面讨论的其它用于灭活病毒的方法也可用于固定细胞，也可使用现有技术公开的任何其它方法。C.减毒病毒的制备如上面所描述的，可使用灭活的病毒或固定宿主细胞来制备疫苗。另一种方法是使用已通过突变病毒基因组中的一个或多个基因被减毒的病毒。目的是产生当施用于猫时不具有感染性的病毒。在体外可通过用病毒感染细胞(例如PBMCs)，接着测定病毒的水平如何随时间变化来确定病毒复制的速率。复制之后可使用测定FIV特异性抗原的免疫分析进行定量PCR或测定病毒特异性酶(例如逆转录酶)的活性。可通过将猫T淋巴细胞(例如FeP2细胞)暴露于病毒中并测定细胞摄取病毒以及支持复制的程度来确定感染性(参见下面实施例4)。
可通过定点诱变来产生FIV-141基因组的突变。实施它的一种方式是用将变异导入正常基因序列中的引物扩增病毒基因。例如，可在基因组的选定区导入独特的限制性位点，并且接着可通过限制酶消化切除这些位点之间的序列。切除后，可重新连接基因组DNA的剩余部分，接着导入适宜宿主细胞中以产生突变病毒。制备和检测突变病毒和突变病毒基因组的详细描述提供在下面实施例3和4中。可在表1中找到被导入的各种突变的概况。表1FIV-141中的突变
产生适宜于施用于动物以诱导抗体产生或用于疫苗中的减毒病毒的一些具体突变的实例为MA del、ENV del、V3/4 del、V7/8 del、TMf del、CTdel、Vif del、Vifc del、Vifn del、ORF(2)del、CA del、NC del、SU del、IN del、DU del和RRE del。因此，在Vif、MA、ORF(2)、ENV、Vifn、Vifc、V3/4、V7/8、TMf、CT、SU、CA、NC、IN、DU或RRE的任一个突变的病毒为减毒的，灭活这些基因的其它核苷酸缺失或改变应产生具有类似特性的病毒。D.FIV-141抗体的产生和被感染猫的治疗可在通常用于抗体产生的任何动物中产生FIV-141抗体，包括小鼠、兔等。然而，优选在猫中产生抗体。如果野生型病毒被用作抗原，应在施用前灭活病毒。当使用减毒病毒时，例如被突变以降低或消除其感染性的病毒时，不需要宿主细胞的灭活或固定，虽然如果需要可进行这些步骤。
含有病毒的组合物可通过任何途径施用于动物，但通常经肌肉内、皮下或静脉内对动物进行注射。通常，病毒制剂包括佐剂，例如Freund’s完全或不完全佐剂。用于注射、注射方案等的适宜的制剂为本领域所熟知并可被用于FIV-141和其突变体(参见例如Harlow等，1988，抗体，实验室手册，冷泉港实验室，N.Y.；Klein，1982，免疫学自身-非自身分辨的科学)。还可使用单克隆抗体，并可使用标准方法制备(Kennett，等，1980，单克隆抗体和杂交瘤生物分析的新视野；Campbell，1984，“单克隆抗体技术”，在生物化学和分子生物学中的实验室技术)。
与FIV-141特异性反应的抗体或抗体片段(即具有比任何其它病毒高至少100倍的对FIV-141亲和性)也可被用于任何各种免疫分析中。例如，在还被称为“2-位点”或“夹心”分析法的放射免疫分析法或放射测定分析法中，抗体可被用来检测FIV-141(参见Chard，1978，“放射免疫分析和相关技术入门”，在生物化学和分子生物学实验室技术，North Holland Publishing Co.N.Y.)。在常规的免疫测定分析法中，大量未标记的抗体与不溶于被检测液体，如血液、淋巴、细胞提取物等中的固体载体结合。在抗原与固定抗体的最初结合后，加入大量可检测的标记二抗(它可与一抗相同或不同)以使得能进行抗原的检测和/或定量(参见例如Kirkham等(编)，1970，放射免疫分析法，pp.199-206，E&S Livingstone，Edinburgh)。现有技术已知许多修改的这些类型的分析法，并可被用于FIV的检测。E.常规疫苗和接种方法许多作者已讨论了采用不同FIV毒株或极其相关的病毒的疫苗和接种方法(Elyar等，1997，疫苗151437-1444；Yamamoto等，1993，病毒学杂志67601～605；Murphey-Corb等，1989，科学2401293-1297；Jarrett等，1990，AIDS 4S163-S165；和Desrosiers等，1989，Proc.Natl’s Acad.Sci.USA 866353-6357)。在FIV-141的情况下，具有三种类型的可采用的疫苗灭活的全病毒疫苗、固定细胞疫苗和减毒病毒疫苗。
通常，疫苗在约0.5-5ml的体积中包含约1×106-约1×108病毒颗粒。使用如Remington’s药物科学，1982，Mack 出版公司，Easton，Pa.第16版中描述的标准方法进行配制。制剂可包含灭活的病毒、固定的宿主细胞或减毒病毒以及载体和一种或多种佐剂。疫苗通常被设计用于胃肠外给药，虽然本发明也包括其它形式的给药。最优选的疫苗包含当施用于猫时为完全或基本上完全无感染性的减毒病毒。
免疫方法通常包括由3-10周间隔分开的疫苗的数次接种(例如3次接种)。现有技术熟知优化接种方法和其它与免疫相关的参数的方法。F.DNA疫苗描述使用核酸(DNA或RNA)的疫苗和接种方法的参考文献包括美国专利5,703,055、US专利5,580,859和US专利5,589,466。以该方法送递的免疫原通常引起体液和细胞免疫应答。
这些方法可被用来产生抗FIV的疫苗，其中对应于减毒的FIV-141的核酸被施用于猫。
编码减毒FIV-141基因组的DNA或RNA可被用于疫苗中，但通常优选DNA。DNA可以“裸露”的形式存在或可与利于细胞摄取的试剂(例如脂质体或阳离子脂类)一起施用。通常的给药途径为通过肌肉内注射约0.1-5ml疫苗。疫苗中的总核苷酸通常应以约0.1ug/ml-约5.0mg/ml存在。多核苷酸可以悬浮液、溶液或乳液的一部分存在，但通常优选含水载体。
使用DNA疫苗免疫猫可以一次或以分开的剂量的多次单独接种的形式来进行，例如以3-10周的间隔。如果需要，可从接种动物中收集血清并检测FIV-141或其它FIV毒株的抗体的存在。G.其它慢病毒的方法学的扩展上面讨论的用于减毒FIV-141和制备适用于疫苗中的突变病毒核酸的方法可被扩展至FIV的其它毒株和其它类型的慢病毒。在每种情况下，克隆病毒基因组并在一个或多个选自MA、CA、NC、DU、ENV、SU、TMf、CT、ORF(2)、Vif、Vifn、V3/4、V7/8、IN和RRE的基因中突变。突变应被设计成灭活基因产物。这通常可最容易地通过缺失整个基因或基因的重要部分来完成。虽然用于诱导突变的具体的方法将取决于病毒而变化，但基本的方法是现有技术中常用的，并且使用本文公开的方法作为指导，专业的分子生物学家可很容易地进行。抗体的产生，疫苗的制备和施用等可如本文对FIV-141所讨论的，在需要时进行极小的修改而完成。
此外，设想某些慢病毒的抗体可被用来提供对病毒感染的动物或人的被动免疫性。纯化抗体或包含抗体的血浆可被用于此目的，可在阶段性的基础上施用制剂直至观察到在一种或多种与病毒感染相关的信号的改善。实施例实施例1感染性FIV原病毒DNA克隆的构建A.FIV-141的分离和克隆病毒的分离从FIV-感染的猫的血浆中分离FIV-141。通过将来自感染猫的血浆施用至特定的无病原体(SPF)的猫中来扩增病毒。通过病毒分离和血清转变来证实被接种猫的感染。攻击后12周将猫处死，收集组织，脾被作为用于FIV-141基因组的分子克隆的病毒的来源。根据制造商提供的方法，使用DNA提取试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)从感染脾中分离基因组DNA。将纯化的基因组DNA以1ug/ml的浓度溶解在TE缓冲液中，并储存于-70℃。FIV-141基因组的三个片段的PCR扩增和克隆根据公开的其它 FIV分离物的序列(Talbott等，1989，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，865743-5747；Miyazawa等，1991，病毒学杂志651572-1577；Talbott等，1990，病毒学杂志644605-4613)设计三套寡核苷酸。这些核苷酸被用来扩增FIV-141基因组的三个片段，一个位于5‘末端，一个位于3’末端和一个位于基因组的中间。由于在感染组织中的FIV原病毒基因组的低拷贝数目，使用各片段的半重叠引物组进行两轮PCR扩增。
三个引物被用来克隆来自FIV-141原病毒基因组的5’末端的片段，从核苷酸118至646。该区包括大多数5’长末端重复区、5’长末端重复区与Gag开放读框之间的间插序列和Gag基因的N末端部分。引物的序列如下正向引物pr-1(117-CCGCAAAACCACATCCTATGTAAAGCTTGC-146，SEQ ID NO2)和两个反向引物，pr-2(646-CGCCCCTGTCCATTCCCCATGTTGCTGTAG-617，SEQ ID NO3)和pr-8(1047-TTACTGTTTGAATAGGATATGCCTGTGGAG-1018，SEQ IDNO4)。使用200ng各种pr-1和pr-8作为引物和1ug基因组DNA作为模板以及0.5单位的Taq DNA聚合酶(Gibco，BRL Gaithersburg，MD)和1单位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)的混合物进行第一轮PCR扩增。94℃下扩增进行1分钟；接着是30次的94℃下45秒的变性；52℃下退火45秒；接着72℃下延伸2分钟。使用引物pr-1和pr-2以及2ul第一轮PCR产物作为模板进行第二轮扩增。将第一轮扩增所采用的相同条件用于第二轮中，但在55℃的温度下进行退火。
三种寡核苷酸也被用来克隆来自FIV-141原病毒基因组3’末端的片段。该片段包括核苷酸8874-9367，其由大部分3’长末端重复区和3’长末端重复区与ENV基因之间的间插序列组成。三种引物的序列如下两个正向引物，pr-5(8793-GCAATGTGGCATGTCTGAAAAAGAGGAGGA-8822，SEQ ID NO5)和pr-7(8874-TCTTCCCTTTGAGGAAGATATGTCATATGAATCC-8907，SEQ ID NO6)和反向引物，pr-6(9367-TCTGTGGGAGCCTCAAGGGAGAACTC-9342，SEQID NO7)。引物pr-5和pr-6被用来进行首轮扩增，pr-6和pr-7被用来进行第二轮扩增。将与在来自上述FIV-141 5’末端的片段的扩增中相同的条件用于本次扩增中。
为了克隆来自FIV-141基因组的中间部分的从核苷酸5147延伸至5631并包括IN基因的C末端部分和Vif基因的N末端部分的片段，使用正向引物pr-3(4738-ACAAACAGATAATGGACCAAATTTTAAAAA-4767，SEQ ID NO8)和反向引物pr-10(5631-TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT-5604，SEQ ID NO9)。使用正向引物pr-9(5147-TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT-5176，SEQ IDNO10)反向引物10进行第二轮扩增。
在完成第二轮PCR扩增后，将产物加至1％琼脂糖凝胶中并通过Wizard PCR Preps试剂盒(Promega，Madison，WI)纯化所有三个片段的预期带。根据制造商推荐的方法，将纯化的PCR片段克隆至PCR-Script Amp SK(+)载体(Stratagene，La Jolla，CA)中。通过限制酶消化，接着测序质粒DNA(高级基因分析中心，St.Paul，MN)的两条链来证明插入。为了消除在扩增期间通过DNA聚合酶产生的FIV序列中的“错误”，测序来自三个独立的PCR扩增的克隆的每一个区。来自三个独立克隆的共有序列被认为是真实的FIV-141序列。
结合来自5’和3’末端的片段表明FIV-141的长的末端重复由354个碱基组成，包括U3区的208个碱基，R区的79个碱基以及U5区的67个碱基。末端2-碱基的倒转重复区，TATA试剂盒，聚腺苷酸化信号和许多推测的顺式作用的增强子-启动子元件相对于其它FIV分离物被完好地保存了。
FIV-141的完整原病毒基因组的PCR扩增和克隆使用上面描述的三个克隆片段获得的序列信息被用来设计可被用来扩增和克隆为5’一半和3’一半的两个片段的全部原病毒基因组的FIV-141特异性引物。通过用半重叠的引物组的两轮扩增来扩增每一半。
为了扩增FIV-141基因组的5’一半(从核苷酸1-5460)，使用正向引物pr-11(1-TGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAATA-30，SEQ ID NO11)和反向引物pr-10进行首轮扩增。扩增方法遵循Clonetech的Advantage Genomic PCR试剂盒(Palo Alto，CA)提供的方法。简单地说，在50ul总体积中进行PCR反应，其中含有1ul基因组DNA模板(1ug/ml)，1ul各种引物(100ng/ul)，5ul 10×Tth PCR反应缓冲液，2.2ul 25mMMg(OAc)2，1ul 50×dNTP混合物(每一种为10mM)，1ul 50×Advantage Tth聚合酶混合物，1ul Pfu聚合酶(2.5U/ul)和36.8ul无菌水。94℃下，将反应混合物加热2分钟，接着进行30次扩增94℃，30秒，68℃，6分钟。使用2ul第一轮PCR产物作为模板，相同的正向引物pr-11和反向引物pr-12(5460-CATATCCTATATAATAATCACGCGTATGAAAGCTCCACCT-5421，SEQ ID NO12)进行第二轮扩增。为了便于构建来自两半的全长FIV-141基因组，将限制酶位点Mlu I(下化线的)加入到引物pr-12中。在第二轮中使用第一轮扩增采用的相同的PCR条件，导致具有5460碱基对长度的扩增片段的产生。
为了克隆FIV-141原病毒基因组的3’一半，最初用三个引物pr-9、pr13和pr14进行扩增。使用正向引物pr-9和反向引物pr-14(9464-TGCGAGGTCCCTGGCCCGGACTCC-9441，SEQ ID NO13)进行第一轮PCR扩增。使用正向引物pr-13(5421-AGGTGGAGCTTTCATACGCGTGATTATTATATAGGATATG-5460，SEQ ID NO14)和相同的反向引物pr-14进行第二轮扩增。引物pr-13被设计成与在基因组5’一半的扩增中所采用的pr-12重叠。如在pr-12引物中，Mlu限制酶位点(下划线的)被加入到pr-13中以便于全长FIV克隆的构建。不幸的是，在两轮PCR扩增后，未观察到特异性DNA带。总结出未能扩增FIV-141的3’一半可能是由于引物pr14中的高GC含量以及极稳定的二级结构。因此，设计了新的引物pr-16(9444-CTCCAGGGATTCGCAGGTAAGAGAAATTA-9416，SEQ ID NO15)。该序列在FIV-141基因组中的最后一个碱基的上游20个碱基出结束。使用正向引物pr-9和反向引物pr-16进行首轮PCR扩增。接着使用正向引物pr-13和再次使用反向引物pr-16进行扩增。在第二轮扩增后获得具有预期大小的DNA片段。
使用Wizard PCR Preps DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，MI)纯化FIV-141基因组的5’和3’一半的DNA片段，并克隆至pCR-ScriptAmp SK(+)克隆载体中(Stratagene，La Jolla，CA)。测序来自三个独立的PCR反应的三个克隆的每一个5’一半和3’一半的克隆。测序质粒DNA的两条链，通过比较对应三个独立的克隆所获得的结果来获得全部基因组的真正的共有序列。DNAStar程序(DNAStar公司，Madison，WI)被用来进行序列装配、比较和分析。B.克隆的FIV-141病毒的分子鉴定全部FIV-141基因组的序列结果和分析FIV-141整个原病毒基因组被发现包含9464个碱基。基因组以慢病毒通常的方式构成，并由5’和3’长的末端重复组成；包含Gag，Pol和ENV基因的三个大的开放读框(ORF)；和包含Vif、Rev和ORF(2)调节蛋白的三个小的开放读框。长的末端重复分别与FIV-Petaluma(Olmsted等1989，Proc.Natl’Acad.Sci.USA 862448-2452)和FIV-USIL(Sodora等，1995，AID研究和人逆转录病毒11531-533)分离物具有78.6％和93.9％的序列同源性。Gag多肽分别与FIV-Petaluma和FIV-USIL分离物具有88.4％和94.4％的氨基酸同源性。
Gag基因编码基质(MA)蛋白(碱基627-1031)、壳体(CA)蛋白(碱基1032-1724)和核壳(NC)蛋白(碱基1725-1976)。Gag和Pol多肽与PolORF重叠97个碱基，在核苷酸1880处开始，核苷酸5239处结束。七个核苷酸移码信号(5’-GGGAAAC-3’)位于重叠区的3’末端的上游100个碱基处。作为翻译中的-1移码的结果，产生了Gag/Pol的多肽融合。
与FIV-Petaluma和FIV-USIL分离物比较，FIV-141的Pol多肽分别显示85.7％和92.2％的氨基酸同一性。Pol基因编码从核苷酸1880-1978的前导序列；从核苷酸1979-2326的蛋白酶(PR)；从核苷酸2327-3994的逆转录酶(RT)；从核苷酸3995-4393的脱氧尿苷三磷酸酶(DU)和从4394-5239的整合酶(IN)。
Vif ORF与Pol基因重叠8个碱基，并分别与FIV-Petaluma和FIV-USIL分离物享有80.2％和91.3％的氨基酸同源性。紧接在Vif基因后的ORF(2)基因，从核苷酸5988开始，核苷酸6224结束，其分别与FIV-Petaluma和FIV-USIL分离物享有62％和92.4％的氨基酸同源性。
ENV多肽分别与FIV-Petaluma和FIV-USIL分离物享有79.3％和88.6％的氨基酸同源性。ENV基因编码表面(SU)蛋白，从核苷酸6262-8088；和跨膜(TM)蛋白，从核苷酸8089-8826。
Rev蛋白由多剪接mRNA的翻译产生。推测的Rev基因的第一个外显子显然与ENV基因享有一个起始密码子，从核苷酸6262开始，于6505结束。第二个Rev外显子在核苷酸8947开始，延伸至3’长末端重复的U3区中，于核苷酸9161结束。FIV-141的Rev蛋白分别与FIV-Petaluma和FIV-USIL分离物享有67.3％和83.9％的氨基酸同源性。151个碱基的Rev效应元件(RRE)与ENV基因重叠52个碱基，于核苷酸8775开始，于核苷酸8925结束。
基于与SU糖蛋白的V3区的序列比较，FIV-141为B型分离物，FIV-141显然与另一种B型FIV分离物FIV-USIL最相关。C.FIV-141的全长分子克隆的构建为了构建全长FIV-141克隆，将基因组3’末端的最末端的20个碱基加至3’一半的克隆中。此外，通过比较来自三个独立克隆的序列确定共有序列。接着在构建全长病毒克隆之前，定点诱变(SDM)被用来调节5’和3’一半克隆的序列以匹配共有序列。在FIV-141的3’末端的最末端加上缺失的20个碱基为了将20个碱基加入至FIV-141的3’一半克隆，使用5’一半克隆作为模板和正向引物pr-21(5’TTACAAGAATTCAACTGCAGTGGGAAGATTATTGGGATCCTGAAGAAAT-3’，SEQID NO16)和反向引物pr-20(5’-TTCAAGGAGCTCTTTTGTCGACAACTGCGAGGTCCCTGGCCC- 3’，SEQ IDNO17)，首先将长的末端重复区进行PCR扩增，并克隆至PCR-ScriptAmp SK(+)克隆载体中。为了便于克隆PCR片段，将两个限制酶位点EcoRI和PstI(下化线部分)加入到正向引物PR-21中，将两个位点，SacI和SalI(下化线部分)掺入到反向引物PR-20中。引物中的FIV-141的具体序列以斜体字表示。测序产生的克隆，其被称为pCR-LTR。将用SacI和NheI消化产生的pFIV-LTR的限制性片段克隆至一个FIV-141的3’一半克隆中。产生的克隆被称为pFIV3’-2A-1+，并通过核苷酸测序证实FIV-141 3’末端最末端20个碱基的存在。5’和3’一半克隆的共有序列的构建为了建立FIV-141基因组的现有的5’和3’一半克隆的共有序列，进行SDM。为了在基因组的第一半导入序列变化，将一个5’一半克隆(称为“pFIV5’-D-11”)用作模板。与共有序列相比，在pFIV5’-D-11中具有总共15个核苷酸变化。两个变化位于5’非编码区，A602G和A612G，编码区中的7个核苷酸变化为沉默突变。编码区的其它6个变化每一个导致一个氨基酸置换，三个位于RT区中(A2890G核苷酸变化，导致I变为M氨基酸的置换；G3461A变化导致E变为K的置换；和G3737变化，导致E变为K的置换)，一个位于DU蛋白中(C4383T变化，导致T变为I的置换)，两个位于IN蛋白中(A4579G变化，导致I变为M的置换；和A5007T变化，导致Q变为L的置换)。七个寡核苷酸被设计用来产生非编码区的两个变化和导致氨基酸置换的编码区的六个变化。寡核苷酸如下，错配被下划线oligo pF-1，设计来修复A602G和A612G错误5’-GATTCGTCGGGGGACAGCCAACAAGGTAGGAGAGATTCTACAGCAACATGGGG-3’(SEQ ID NO18)oligo pF-2，设计来修复A2890G错误5’-TCAATATATGGATGATATCTATATAGGATCAAAATTTAAGTAA-3’(SEQ IDNO19)oligo pF-3，设计来修复G3461A错误5’-GTGATATAGCTCTAAGGGCATGTTACAAAAGAGAAGAATCCATTATAAGAATAGG-3’(SEQ ID NO20)oligo pF-4，设计来修复G3737A错误5’-CGGGGCAGATGGCAGGTAATGGAAATAGAAGGAAGTAATCAAAAAGC-3’(SEQ IDNO21)oligo pF-5，设计来修复C4383T错误5’-AGAAAGGGATTTGGGTCAACTGGAGTCTTTTCATGGGTGGA-3’(SEQ IDNO22)oligo pF-6，设计来修复A4579G错误5’-GGGGGACAATTAAAGATTGGACCTGGCATATGGCAAATGGACTGTACACAC-3’(SEQ ID NO23)oligo pF-7，设计来修复A5007T错误5’-GGCTCCTTATGAATTATACATACAACAGGAATCATTAAGAATACAAGAC-3’(SEQID NO24)为了在基因组的3’-半产生序列的改变，3’一半克隆“pFIV3’-2A-1+”被作为模板用于进行SDM。与共有序列相比，pFIV3’-2A-1+克隆中具有9个改变。编码区的两个核苷酸改变为沉默的。其它7个改变导致氨基酸的置换1个位于Vif蛋白(T5508C，H改变为Y)；1个位于ORF(2)区(A6041T，D改变为E)；3位于SU蛋白(A6922G，V改变为I；G7007T，T改变为R；和A7814G，S改变为N)；1个位于TM区(A8405T，I改变为N)；1个位于Rev区(A8976G，E改变为K)。7个突变寡核苷酸被设计用于修复这些氨基酸置换oligo pF-8，设计来修复T5508C错误5’-CAAAATAGTTTAAGATTGTATGTTTATATAAGCAAT-3’(SEQ ID NO25)oligo pF-9，设计来修复A6041T错误5’-CAGAAAAGTTAGATAGAGAAGCAGCTATTAGATTGTTTAT-3’(SEQ ID NO26)oligo pF-10，设计来修复A6922G错误5’-TAAAAGCAAATGTTAATATAAGCTTACAAGAAGGACCTAC-3’(SEQ ID NO27)oligo pF-11，设计来修复G7007T错误5’-AAAAGCTACAAGGCAATGCAGAAGGGGAAGGATATGGAAG-3’(SEQ ID NO28)oligo pF-12，设计来修复A7814G错误5’-AGAGGACCTTATTGTACAATTTAATATGACAAAAGCAGTGGAAA-3’(SEQ IDNO29)oligo pF-13，设计来修复A8405T错误5’-CCCTCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACTATAAATCA-3’(SEQ ID NO30)oligo pF-14，设计来修复A8976G错误5’-GACAACGCAGAAGAAGAAAGAAGAAGGCCTTCAAAAAATT-3’(SEQ ID NO31)基本上通过由制造商(Promega，Madison，WI)提供的方法制备用于两个克隆pFIV5’-D-11和pFIV3’-2A-1+的单链DNA模板制备物。简单地说，将两个克隆的DNA质粒转染至大肠杆菌毒株CJ236中。使用辅助噬菌体R408拯救单链(SS)DNA并通过苯酚/氯仿提取纯化。将纯化的SS DNA溶解在TE缓冲液中，通过在1％琼脂糖凝胶中对2ul模板制备物样品进行电泳测定其浓度。根据制造商(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)提供的方法将寡核苷酸磷酸化。
在30ul的总反应体积中将寡核苷酸对模板退火。这包含0.2pmol单链DNA模板(pFIV5’-D-11或pFIV3’-2-A-1+)，4pmol各种寡核苷酸(即对于pFIV5’-D-11模板的pF-1至pF-7和对于pFIV3’-2-A-1+模板的pF-8至pF-14)，3ul退火缓冲液(0.2M Tris-HCl，pH7.4，20mMMgCl2和0.5M NaCl)。85℃下将混合物保温5分钟，并接着以约1℃/分钟的速率逐渐冷却至室温。
为了合成互补DNA链，将下面组分加入到退火混合物中3ul合成缓冲液(4mM各种dNTP，7.5mM ATP，175mM Tris-HCl，pH7.4，37.5mM MgCl2，215mM DTT)，3ul T4 DNA连接酶(3U/ul)和3ul稀释的T7 DNA聚合酶(0.5单位/ml)。37℃下将反应保温3小时，接着在68℃下加热灭活10分钟。将2ul SDM反应混合物用来转染大肠杆菌DHα-5感受态细胞。
对于5’一半克隆，掺入一个诱变的寡核苷酸，PF-5导致Hinc II位点的加入。用Hinc II的初步筛选导致4个阳性突变的确定，它们被称为FIV5’-D-11/M-4、FIV5’-D-11/M-22、FIV5’-D-11/M-28和FIV5’-D-11/M-52。将4个突变体进行全长测序以证实其它7个所需突变的掺入。测序结果表明4个克隆中的3个包含所有8个突变。一个克隆，FIV5’-D-11/M-28仅具有7个突变的位置。
克隆FIV5’-D-11/M-52被选择作为5’诱变克隆以构建全长FIV-141克隆。对于3’一半克隆，用BspH I消化的初步筛选证实了10个突变，其中由于诱变寡核苷酸pF13的掺入而去除了BspH I限制性位点。全长测序表明10个克隆中的8个在所有7个所需位置包含突变。一个突变体“pFIV3’-2-A-1+/M-21”包含全部8个改变，并被选择作为构建全长FIV-141克隆的3’一半克隆。全长FIV-141克隆的构建为了构建全长FIV-141克隆，将来自5’一半克隆，FIV5’-D-11/M-52的5.5kb Mlul/Xhol片段与被两个相同的限制酶消化的3’一半克隆pFIV3’-2-A-1+/M-21连接。通过使用针对5’一半克隆的正向引物和3’一半克隆的反向引物的PCR扩增筛选全长连接产物。正向引物pr9具有序列5’-(5147)-TTAAAGGATGAAGAGAAGGGATATTTTCTT-(5176)-3’(SEQ ID NO10)。反向引物pr10具有序列5’-(5631)-TTTCAATATCATCCCACATAAATCCTGT-(5604)3’，(SEQ ID NO9)。通过限制性消化和测序证实阳性克隆。其中一个产生的全长克隆被称为“pFIV-141B-1”，并被选择用于体外和体内鉴定。实施例2证实全长分子克隆具有感染性转染将Crandell猫肾(CRFK)细胞培养在6孔平板中至40-60％的铺满度。通过加入2ug质粒DNA，并遵循Trans IT Polyamine TransfectionReagents(Mirus，Madison，WI)推荐的基本方法来完成转染。简单地说，将10ul TransIT Lt-1(Panvera)与1ml RPMI 1640培养基混合物，并在室温下保温15分钟。将2ug质粒DNA加入到RPMI/Lt溶液中，室温下再保温15分钟。将培养基从孔中除去，将细胞用PBS洗涤一次，并将DNA混合物加入到细胞单层中。37℃，CO2保温箱保温4小时后，将DNA混合物从孔中除去，将2ml补充有3％胎牛血清(FS)的RPMI培养基加入到各孔中。转染后24小时，分析细胞上清中的FIV的产生、逆转录酶(RT)的活性和病毒的感染性。来自转染的CRFK细胞的FIV的产生在转染后，每天收集转染的CRFK细胞的上清，并根据制造商推荐的方法，使用FIV抗原检测试剂盒(IDEXX，波特兰，ME)检测。该酶免疫活性法被设计用来检测主要的FIVp26壳体蛋白的组相关的抗原。转染后(PT)24小时检测FIV抗原p26，转染后72小时到达峰值，转染后11天降低至本底水平(参见图1)。
为了证实转染(CRFK)细胞的病毒的产生，进行逆转录酶(RT)活性分析(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)以检测转染细胞上清中的与病毒体相关的RT活性。简单地说，收集200ul细胞上清，在微量离心管中离心5分钟以沉淀细胞和细胞残渣。4℃下，在吊桶式转头离心机中将上清以20,000g离心20分钟以沉淀FIV病毒颗粒。将病毒颗粒重新悬浮在40ul来自检测试剂盒的裂解缓冲液中，如制造商所推荐地进行分析。在转染后(PT)48小时的细胞上清中证实了来自转染细胞的病毒的产生。CRFK细胞的感染FIV-141野生型病毒不感染CRFK细胞。为了确定分子克隆病毒是否表现类似的特性，将CRFK细胞培养在6孔平板中，并用200ul来自转染的CRFK细胞的p26+条件培养基接种。37℃下保温2小时后，将细胞用PBS洗涤一次，将2ml补充有3％FS的RPMI 1640培养基加入至各孔中。接着转染后每3-4天，通过FIV p26 ELISA监测上清的病毒的产生。结果发现类似于野生型病毒，FIV-141克隆不感染CRFK细胞。通过与转染的CRFK细胞共培养感染FeP2细胞将CRFK细胞培养在6孔平板中，并如上所述进行转染。转染后48小时，将2×106FeP2细胞加入到各p26+转染孔中。将细胞共培养72小时后，从CRFK细胞(贴壁)分离FeP2细胞(非贴壁)。收集来自FeP2细胞的上清，每3-4天通过FIV p26 ELISA监测病毒产生。共培养后4天后，在FeP2细胞上清中证实了高水平病毒产生(参见图2)。转染后6天病毒效价到达平台期，表明FIV-141分子克隆病毒在FeP2细胞中具有感染性。结果还表明在病毒感染的早期，即病毒进入细胞时，CRFK细胞的感染被阻断。
总之，总结出在转染至CRFK细胞时，FIV-141分子克隆可在细胞中复制，从细胞中释放的病毒颗粒对FeP2 T淋巴细胞具有感染性。
通过吸附作用的FeP2细胞的感染将FeP2细胞(2×106)悬浮在从转染的CRFK细胞获得的200ulp26+条件培养基中，37下保温2小时。将细胞用PBS洗涤，悬浮在2ml补充有10％加热灭活的FCS的Opti-MEM培养基中，37℃下保温。收集上清，每3-4天通过FIV p26 ELISA监测病毒的产生。感染后4天后，监测上清中的来自感染的FeP2细胞的病毒的释放，感染后3星期到达峰值(图3)。结果表明FIV-141产生的FeP2细胞的生产性感染可通过吸附作用或用转染的CCRFK细胞共培养来完成。与共培养的感染比较，当通过吸附进行感染时，病毒产生到达峰值更慢。实施例3突变的FIV-141和其在疫苗中的用途为了开发FIV-141疫苗代表物，感染性的FIV-141野生型克隆被用来构建许多基因缺失克隆。制备突变克隆的通常的标准为1.导入FIV-141基因组中的缺失或突变必须是严重的，以致在体外克隆被转染至培养的细胞中或在体内施用于猫中后病毒的感染性显著降低(减毒)。2.导入FIV-141基因组中的缺失或突变应不消除病毒基因组的复制能力，或高水平表达病毒蛋白的能力。
被考虑的其它因素是基因缺失的基因组是否整合至宿主染色体中，缺损病毒颗粒是否形成以及将表达的病毒结构蛋白的水平。基于这些考虑，许多基因和元件被靶定用于缺失。由于将维持病毒基因组的复制，因此，FIV-141的RT和PR基因不被突变。A.Gag区中的缺失
Gag多肽包含3个病毒体结构基因，MA、CA和NC。3个基因缺失克隆被构建成在这三种蛋白中的每一种具有一个缺失。MA del突变使用5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52作为模板，诱变引物Mpma-1(5’-AGTAAAGAAATTGACATGGCGATTACTAGTTTAAAAGTTTTTGCAGTGGC-3’，(SEQID NO32)；和Mpma-2(5’-CCATCTATAAAAGAAAGTGGGACTAGTGAAGAAGGACCTCCACAGGC-3’，SEQ IDNO33)，进行定点诱变以在MA蛋白的C末端部分产生两个Spe I限制位点。
由引物导入的SepI位点在序列中被下化线。如前所讨论地进行SDM以修复5’和3’一半克隆中的推测的错误。通过SpeI限制性消化筛选突变体，阳性克隆被用来构建缺失的克隆。进行Spe I消化以释放SpeI片段，克隆的剩余部分自身连接以产生缺失的克隆。通过使用缺失区侧翼的引物组的PCR扩增筛选它们，并通过核苷酸测序获得证实。将具有缺失的5’一半克隆与3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21连接以产生具有缺失的全长克隆。该克隆被称为FIV-141 MA缺失克隆，并包含从核苷酸879至核苷酸1001的123个碱基的缺失，对应于MAC末端残基85-125的41个氨基酸。CA del突变使用5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52作为模板，引物Mpca-1(5’-ATTCAAACAGTAAATGGAGCAACTAGTTATGTAGCCCTTGATCCAAAAATG-3’，(SEQ ID NO34)和Mpca-2(5’-ACAGCCTTTTCAGCTAATTTAACTAGTACTGATATGGCTACATTAATTATG-3’，SEQID NO35)进行SDM以在FIV-141的CA区中产生两个Spe I限制位点。在缺失Spe I限制性片段后，将5’一半克隆与pFIV3’-2A-1+/M-21连接以产生具有缺失的全长克隆。该克隆具有从核苷酸1056-1169的114个碱基对的缺失，对应于MA N-末端位置9-46的38个氨基酸。NC del突变5’一半克隆分别在核苷酸1635和1876处具有唯一的Sca I和SmaI位点。将克隆用ScaI和Sma I消化以释放242个碱基对的片段。5’一半克隆的剩余部分自身连接，接着与3’一半克隆连接以产生基因缺失的全长克隆。缺失由CA区中的63个碱基(21个氨基酸残基)，CA和NC蛋白之间的27个碱基(9个氨基酸残基)和NC蛋白的N-末端部分的152个碱基(51个氨基酸残基)组成。缺失还导致-1阅读框的移动，因此NC蛋白的C-末端部分不能由该克隆表达。B.ENV区的缺失ENV前体糖蛋白被加工成两种成熟蛋白SU和TM。在ENV区构建6个缺失克隆。ENV del突变使用3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作为模板，诱变引物Mpenv-1(5’-ACTATAGTCTATTTACTAACTGGTTACCTGAGATATTTAATAAGCCATAG-3’，(SEQID NO36)和Mpenv-2(5’-TACTTATATGCTTGCCTACATTGGTTACCGTATAAGAAACTGTACTAATAAAA-3’，SEQ ID NO35)，进行SDM以在ENV区产生两个BstE II位点。引物中的BstE II位点以下划线标出。缺失BstE II片段后，将自身连接的克隆与pFIV5’-D-11/M-52连接。产生的克隆具有从核苷酸6577-8679的2103个碱基的缺失，其对应于ENV蛋白的中间701个氨基酸(残基106-806)。在缺失克隆中保留了其中大部分重叠Rev蛋白的第一个外显子的N-末端105个残基和其中大部分重叠Rev效应元件(RRE)的C-末端45个残基。SU del突变使用克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作为模板，诱变引物Mpsu-1(5’-GAGGTATAAAGGTAAACAAAAAACTAGTGCCATTCATATTATGTTAGCCCTTGG-3’，(SEQ ID NO38)；和Mpsu-2(5’-ACTAACTATAGTCTATTTACTAACAACTAGTTTGAGATATTTAATAAGCCATAGAAAC-3’，SEQ ID NO35)，进行SDM以在FIV-141的SU区产生两个SpeI位点。通过SpeI消化缺失SpeI片段，接着大的剩余片段进行自身连接。将产生的克隆与pFIV5’-D-11/M-52连接。该克隆具有核苷酸6577-8085的1509个碱基对的缺失，对应于SU蛋白的503个氨基酸(残基106-608)。克隆保留了SU蛋白的N-末端105个氨基酸。V3/4 del突变进行SDM以产生两个在SU蛋白的V3和V4区侧翼的SphI位点。使用克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作为模板和诱变引物Mpenv-5(5’-ATACCGAAATGTGGATGGTGGAATCAGGCATGCTATTATAATAATTGTAAATGGGAAGAAGC-3’，SEQ ID NO40)和Mpenv-6 (5’-GCACTATGTACAATTGTTCCTTACAGGCATGCTTCACTATGAAAATAGAGGACCTTA-3’，SEQ ID NO41)。Sph I位点以下划线标出。在消化除去SphI片段后，克隆进行自身连接，接着与pFIV5’-D-11/M-52连接。该克隆具有从核苷酸7339-7770的432个碱基的缺失，对应于SU蛋白的144个氨基酸(残基360-503)，它覆盖了V3和V4区。V7/8 del突变SDM被用来产生两个在TM蛋白的V7和V8区侧翼的SphI位点。这通过使用克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作为模板和诱变引物Mpenv-7(5’-GAATCAATTCTTTTGTAAGATCGCATGCAATCTGTGGACAATGTATAACATGACT-3’，SEQ ID NO42)和Mpenv-8(5’-GGGAAAATTGGGTGGGATGGATAGGTAAGATCGCATGCTATTTAAAGGACTTCTTGGTAG-3’，SEQ ID NO43)来完成。Sph I位点以下划线标出。用SphI消化导致除去从核苷酸8380-8595的216个碱基，接着为大片段的连接。然后将产生的克隆与5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52连接以产生“V7/8 del”。这包含覆盖V7和V8区的TM蛋白的72个氨基酸(从残基98-169)的缺失。Tmf del突变FIV-141的3’一半克隆在核苷酸8145处具有唯一的Age I位点。进行SDM以在位置8071处产生第二个AgeI位点。使用3’一半克隆用作模板和诱变引物Mpenv-3(5’GGAAGAAGTTATGAGGTATACCGGTAAACAAAAAAGGGCC-3’，SEQ IDNO44)。通过限制酶消化，接着通过大的限制性片段的连接来缺失两个AgeI位点之间的75-碱基片段。将产生的克隆与5’一半克隆连接以产生“Tmf del”。这包含SU与TM蛋白之间的裂解接头处的25个氨基酸缺失。缺失的氨基酸包括SU蛋白的6个C-末端残基(其中4个为碱性(K或R)并为SU/TM裂解位点的加工所必需)和TM蛋白的融合肽的19个N-末端残基(为病毒体被膜与细胞膜之间的膜融合所必需))。CT del突变使用3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21作为模板和诱变引物Mpenv-4(5’-CTACTTATATGCTTGCCTACATTGGTCGACTGATAGGAAACTGTACTAATAAAATATTGGG-3’，SEQ ID NO45)进行SDM以平截TM蛋白的细胞质尾。通过沉默突变将Sal I限制性位点(下划线)掺入到寡核苷酸中以便于突变体的筛选。将三个串联重复翻译终止区(斜体字)在TM蛋白的跨膜区加入到引物中。将产生的克隆与5’一半克隆连接以产生“CT del”。这具有从核苷酸8686-8823的138-碱基平截(对应于来自TM蛋白细胞质区的46个氨基酸平截)。C.Pol区的缺失Pol多肽由4个酶蛋白组成PR、RT、DU和IN。2个缺失克隆构建在Pol区。DU del突变使用5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52作为模板和诱变引物Mpdu-1(5’-GATGGTTATAGAAGGTGAAGGAATTACTAGTAAAAGATCAGAAGATGCAGGATATG-3’，(SEQ ID NO46)；和Mpdu-2(5’-GAAATAATAATGGATTCAGAAAGAGGAACTAGTGGATTTGGGTCAACTGGAGTCTTTTC-3’，SEQ ID NO47)进行SDM以在DU区产生两个Spe I位点。引物中的Spe I位点以下划线标出。通过Spe I消化，接着进行大限制性片段的自身连接完成核苷酸4019-4363的345个碱基的缺失。将产生的克隆与克隆pFIV3’-2A-1+/M-21连接以产生“DU del”。克隆包含对应于几乎整个DU蛋白的115个氨基酸的缺失。IN del突变使用pFIV5’-D-11/M-52作为模板和诱变寡核苷酸Mpin-1(5’-CTTCATGGGTGGACAGAATTGAAACTAGTGTATTAAATCATGAAAAATTTCACTCAG-3’，(SEQ ID NO48)和Mpin-2(5’-GCAATGGGTGTATTATAAAGACTAGTAAAAAGTGGAAGGGACCAATGAGAGTAG-3’，SEQ ID NO49)通过SDM在FIV-141的IN区产生两个Spe I位点。引物中的Spe I位点以下划线标出。SpeI片段缺失和自身连接之后，将产生的克隆与克隆pFIV3’-2A-1+/M-21连接以产生“IN del”。克隆包含对应于几乎整个IN蛋白的核苷酸4418-5036的669个碱基的缺失(223个氨基酸，从IN的残基9至231)。D.调节基因或元件的缺失在FIV中确定的3种调节蛋白为Rev、Vif和ORF2。Rev效应元件被报道位于FIV基因组的3’末端。在这些区中构建5个缺失克隆。Vifn del突变将唯一的Mlu位点导入5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52的Vif基因的中间。使用pFIV3’-D-11/M-52作为模板和诱变引物Mpvif-1(5’-AGAAGACTCTTTGCAGTTCTCCAATGAACGCGTTAGATGCCATGTTATACATATCG-3’，SEQ ID NO50)进行SDM以在Vif基因的-末端产生第二个Mlu I位点。引物中的Mlu I位点以下划线标出。通过Mlu I消化，接着进行大限制性片段的自身连接完成核苷酸5286-5435的150个碱基的限制性片段的缺失。将产生的缺失克隆与克隆pFIV3’-2A-1+/M-21连接以产生“Vifn del”。它包含Vif蛋白的N末端部分的50个氨基酸(残基19-68)的缺失。Vifc del突变3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21在Vif区中具有唯一的Mlu I位点。使用pFIV3’-2A-1+/M-21作为模板和诱变引物Mpvif-2(5’-CGTGTGGCAAAGAGGCTAAAACGCGTAGAGGCTGTTGTAATCAG-3’，SEQ IDNO51)通过SDM在Vif蛋白的C-末端产生第二个Mlu I位点。引物中的Spe I位点以下划线标出。Mlu片段缺失后，将产生的克隆与5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52连接以产生“Vifc del”。这包含从核苷酸5436-5873的438个碱基的缺失，对应于Vif蛋白C-末端部分的146个氨基酸缺失(从残基69至214)。Vif del突变为了构建“Vif del”，将Vifc del的XhoI/Mlu I限制性片段用5.3kb Xho I/Mlu I片段替代。产生的克隆包含从核苷酸5286-5873的588个碱基的缺失，其对应于几乎整个Vif蛋白的196个氨基酸(从残基19-214)的缺失。ORF(2)del突变通过SDM在核苷酸5988和6224(ORF(2)的N-末端和C-末端)产生两个MluI位点。这通过使用pFIV3’-2A-1+/M-21作为模板和诱变引物如orf-1(5’-GTGGACGGGAGAATTATGAACGCGTGAACTAATCCCACTGTTTAATAAGGTTACAG-3’，SEQ ID NO52)和Mporf-2(5’-CTACATTATCCATAAATACTGCCTAGACGCGTTTCTTTTAATATTTCATCTGCAG-3’，SEQ ID NO53)来完成。引物中的Mlu I位点以下划线标出。除开由SDM产生的两个Mlu I位点外，在克隆的核苷酸5436处存在一个MluI位点。为了构建“ORF(2)del”，将来自5’一半克隆pFIV5’-D-11/M-52的5.4kbMlu I/Xho I片段与3’一半克隆pFIV3’-2A-1+/M-21的大的Mlu I/XhoI片段连接。接着将来自位置5436-5988的552碱基Mlu I片段插入到产生的克隆中。ORF(2)del包含覆盖整个ORF(2)基因的237个碱基的缺失。RRE del突变使用pFIV3’-2A-1+/M-21作为模板和诱变引物Mprre-1(5’-GGCATATCTGAAAAAGAGGAGGAATGAACTAGTATATCAGACCTGTAGAATACA-3’，SEQ ID NO54)和Mpree-2(5’-GAGGAGGATGTGTCATATGAATCAAATACTAGTCAAAAATAACAGTAAAATCTATATTG-3’，SEQ ID NO55)来进行SDM以在RRE区中产生两个Spe I位点。引物中的Spe I位点以下划线标出。通过Spe I消化，接着进行大限制性片段的自身连接完成Spe I片段的缺失。将产生的缺失克隆与pFIV5’-D-11/M-52连接以产生“REE del”。它包含从核苷酸8827-8910的84个氨基酸的缺失。实施例4FIV-141基因缺失克隆的鉴定A.病毒蛋白的表达和/或缺损病毒的产生如前所述将各种缺失克隆的质粒转染至CRFK细胞中。进行FIVp26 ELISA分析以检测病毒蛋白的表达和/或转染细胞上清中的病毒颗粒的产生。转染后48小时后，来自13种构建物的样品被发现产生与野生型FIV-141分子克隆所观察的信号相当的阳性信号(参见图4)。对于ENV区的6种缺失克隆观察到最高水平病毒颗粒的产生，包括ENVdel、TMF del、SU del、CT del、V3/4 del和V7/8 del。
对于7个其它缺失克隆获得相当水平的病毒颗粒的产生，包括Vif区的三个缺失克隆(Vifn del、Vifc del和Vif del)、MA del、DU del、IN del和ORF(2)del。结果表明这13个克隆携带的缺失不干扰来自转染细胞的病毒颗粒的形成和释放。对于NC del检测到了相对弱的阳性信号，表明该区中的缺失影响病毒颗粒的装配或释放。
在被CA del或RRE del转染的细胞上清中未检测到病毒颗粒的产生。CA蛋白的C-末端中的缺失可能消除病毒颗粒的形成或导致用于p26 ELISA试剂盒中的被单克隆抗体识别的表位的丧失。如所预期的，RRE区中的缺失导致阻断未剪接的病毒RNA从核转移至细胞质，这导致病毒结构蛋白表达的全部丧失或显著降低。B.检测病毒RNA表达的细胞内RT-PCR进行细胞内RT-PCR以检测两个缺失克隆CA del和RRE del中的病毒RNA的表达。将各克隆的质粒DNA转染至不同的CRFK细胞中。转柒后48小时，使用RNeasy试剂盒(Qiagen Chatsworth，CA)从转染细胞中分离全部RNA。将RNA用50ul DEPC水洗脱，使用SuperscriptII(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)和2ul各种RNA样品来合成cDNA的第一链。
使用正向引物Sp-8(5’-TATTATGGTGGGGATTTGAAAC-3’，SEQ IDNO56)和反向引物Sp-20(5’-TAATTAGATTTGATTCCCAGGC-3’，SEQ IDNO57)扩增核苷酸2958-3542的585个碱基对片段。在PCR反应中使用2ul来自各个反应的cDNA和作为对照的2ul来自各个制备物的全部RNA。使用PCR扩增试剂盒(Gibco BRL，Gaithersburg)在100ul的体积中进行各个反应。反应如下进行94℃，30秒，25次循环；55℃，30秒；和72℃，再30秒。将10ul各反应物加至1％琼脂糖凝胶中。对于CA del和RRE del克隆观察到具有预期大小的特定的带，表明病毒RNA的表达发生在被这些克隆转染的细胞中。结果表明通过ELISA未检测出CA del的p26蛋白表达可能是由于没有形成病毒颗粒或缺乏在p26 ELISA分析中使用的抗体识别的表位。对于RRE缺失克隆，通过细胞内RT-PCR证实病毒基因的表达，但使用ELISA分析来检测到p26蛋白的表达。当与ELISA比较时，误差可能反应出RT-PCR分析的更高的灵敏性。C.感染性病毒颗粒中的病毒基因组和RT酶的包壳作用CRFK细胞被主要的FIV-141缺失克隆转染导致感染性病毒颗粒的产生和释放。为了确定基因缺失病毒基因组和RT蛋白是否被包被至病毒颗粒中，进行与病毒体相关的RT PCR和RT活性分析。简单地说，转染后48小时，收集200ul来自各种转染CRFK培养物的上清，并在微量离心机中离心5分钟以沉淀细胞和细胞残渣。4℃下，在吊桶式转头离心机以20,000g超离心沉淀上清中的病毒颗粒。为了检测包壳作用，将病毒沉淀重新悬浮在350ul来自RNeasy试剂盒的RLT缓冲液中，并如制造商推荐的通过用50ul DEPC洗脱来纯化病毒RNA。使用Superscript II制备第一链cDNA，如前所述，使用Sp-8和Sp-20引物组进行PCR扩增。
RT-PCR扩增后，16个缺失克隆中的14显示出特定的带，表明被这些克隆转染的CRFK细胞产生感染性的病毒颗粒，并且基因缺失病毒基因组被包被。14个克隆由6个来自ENV区的克隆(包括ENV del、TMfdel、SU del、CT del、V3/4 del和V7/8 del)；3个来自Vif区的克隆(Vifn del、Vifc del和Vif del)；2个来自Pol区的克隆(DUdel和IN del)；2个来自调节基因/元件区的克隆(ORF(2)del和RREdel)；1个来自Gag区的克隆(MA del)。与p26 ELISA数据一致，在与病毒体相关的RT-PCR分析中CA del显示阴性信号。将病毒基因组包被至病毒体中需要NC蛋白，如所预期的，通过对NC del的RT-PCR未检测到与病毒体相关的基因缺失病毒RNA基因组。对于RRE del，使用p26 ELISA分析，证实存在病毒体相关的基因缺失病毒RNA，但未检测到病毒颗粒的产生。这些结果的误差可能再次反映出RT-PCR相对于ELISA更高的敏感性。
为了检测感染性病毒颗粒中的RT(即逆转录酶)酶的包壳作用，将病毒沉淀重新悬浮在40ul来自ELISA试剂盒的裂解缓冲液中，如制造商推荐进行分析。与使用p26 ELISA分析和病毒体相关的RT-PCR分析所获得的数据一致，可检测到14个缺失克隆的病毒体相关的RT活性，包括ENV del；SU del；TMf del；V3/4 del；V7/8 del；CT del；MA del；DU del；IN del；Vifn del；Vifc del；Vif del；ORF(2)del和NC del。在CA或RRE缺失克隆中未检测到病毒体相关的RT活性。D.体外FIV-141基因缺失克隆的感染性如前所述，将CRFK细胞培养在6孔平板中并进行转染。转染后48小时，将2×106FeP2细胞加入到各孔中。将细胞共培养72小时后，从CRFK细胞中分离FeP2细胞，收集FeP2细胞培养物上清，并使用FIV p26 ELISA分析，每3-4天监测病毒的产生，长达4-6周。
在监测期间未发现12个缺失克隆具有显著水平的p26壳体蛋白的表达。这些包括ENV del、TMfdel和NC del(图5)；3个来自Vif区的缺失克隆(Vifn del、Vifc del和Vif del)(图6)；MA和CA缺失克隆(图7)；和V3/4和V7/8和CT缺失克隆(图8)；和ORF(2)缺失克隆(图9)。结果表明导入这些克隆中的缺失完全消除了病毒在FeP2细胞中的感染性。检测到了4个缺失克隆的中等水平的病毒复制，包括DU del；SU del；IN del和RRE del(图10)。E.结论ENV del在ENV蛋白中部具有701个氨基酸缺失(残基106-806)的ENV缺失克隆完全丧失了感染FeP2细胞的能力。然而，它保留了装配和释放感染性病毒颗粒，包被病毒基因组和逆转录RNA的能力。ENV蛋白的主要功能是在感染早期介导病毒进入靶细胞。主要的ENV蛋白的缺失可能阻断病毒进入以及病毒感染。Tmf del在SU与TM蛋白之间的裂解接头中包含25个氨基酸缺失的TMf缺失克隆在FeP2细胞中为非感染性的。缺失可能阻断ENV前体蛋白的裂解加工，这可能导致病毒颗粒不能与靶细胞结合和进入靶细胞。已报道FIV的ENV糖蛋白的裂解位点的去除导致未裂解ENV前体蛋白的表达。然而，如使用蛋白质印迹和放射免疫沉淀分析(Rimmelzwa等，1994，普通病毒学杂志752097-2012)所确定的其与单克隆抗体的相互作用所证实的，表达的重组蛋白保留了它的抗原特性。在转染至CRFK细胞中时，缺失克隆以可与野生型FIV-141克隆相比的水平产生感染性病毒颗粒。感染性病毒基因组和RT酶被包被在感染性病毒体中。SU delSU del具有SU蛋白的残基106-608的503个氨基酸缺失。它被发现保留了大约与野生型克隆相等的病毒颗粒产生水平。基因缺失病毒基因组和RT酶被包被。然而，与ENV del相反，SU del转染的细胞产生在FeP2细胞中具有感染性的病毒颗粒，虽然比野生型病毒小得多。因此，看来FIV-141基因组的SU蛋白的缺失使病毒减毒。认为当与TM蛋白相关时，病毒感染的第一个步骤即FIV与细胞受体的结合通过SU蛋白介导。突变病毒与靶细胞结合和进入靶细胞中的机理不甚了解。突变病毒进入宿主细胞的另一个途径可能导致观察的更低的与缺失克隆相关的感染性。V3/4 del和V7/8 del在V3/4 del和V7/8 del中分别缺失SU蛋白的残基360-503的144个氨基酸(覆盖V3和V4可变区)和TM蛋白的残基98-169的72个氨基酸残基(包含V7和V8区)。在转染至CRFK细胞中时，各个克隆以类似于野生型所观察到的水平产生缺损病毒。对于其它ENV相关的缺失克隆，V3/4和V7/8 del将它们的基因缺失病毒基因组和RT酶包被至病毒体中。感染性分析表明SU的V3和V4区的缺失，TM蛋白的V7和V8区的缺失完全消除了病毒在FeP2细胞中的感染性。V3可变区为免疫显性区，并被报道参与多种功能，包括病毒趋性、病毒致病和中和表位。在这两个缺失克隆中病毒感染在哪一步被阻断目前不甚清楚。CT delFIV的TM蛋白具有相对长的细胞质尾(长度为46个氨基酸)。CT del克隆中尾的平截导致FeP2细胞中病毒感染性的丧失。然而，平截对于病毒颗粒的形成和病毒基因组和RT酶的包被没有影响。已报道了FIV以及HIV-1的MA与TM细胞质尾之间的特定的功能性相互作用。该相互作用被认为对于ENV蛋白掺入到病毒体中是非常重要的。CT del中的细胞质区的平截可能消除MA与TM蛋白之间的功能性相互作用，从而阻断ENV的掺入。MA delMA del包含MA蛋白C末端的残基85-125的41个氨基酸缺失。在转染至CRFK细胞中时，克隆以与使用野生型FIV-141克隆产生的病毒相当的水平产生感染性病毒。这表明C-末端区的缺失对病毒颗粒的装配和释放没有显著的影响。基因缺失病毒基因组和RT蛋白被包被在感染性病毒颗粒中。当这些病毒颗粒从转染的CRFK细胞中释放时，它们对于FeP2细胞没有感染性。CA del如p26 ELISA分析、病毒体内RT PCR分析和RT活性分析中的阴性信号所证实的，CA蛋白N-末端残基9-46的38个氨基酸的缺失消除了病毒颗粒的形成。然而，来自转染CRFK细胞的细胞内RT PCR证实缺失不阻断病毒RNA的表达。因此，在转染细胞上清中未能检测到p26蛋白或感染性病毒的产生是由于病毒颗粒装配，而非病毒蛋白表达的阻断。NC del在NC del克隆中缺失了整个NC蛋白。被这种克隆转染的细胞以与野生型克隆相比显著降低的水平产生缺损病毒，表明缺失损伤了病毒颗粒的装配或释放。已报道HIV-1的NC蛋白不为病毒样颗粒的装配所必需。NC克隆中的缺失不影响RT酶包装至感染性病毒体中。如所预期的，无病毒基因组包被在病毒颗粒中。Vif del、Vifc del和Vifn del在Vif基因中构建3个缺失克隆，即Vifn del、Vifc del和Vifdel。Vifn在Vif蛋白的N-末端部分具有50个氨基酸的缺失。Vifc在蛋白的C-末端部分具有146个氨基酸的缺失，和Vif del具有几乎整个Vif蛋白的缺失。所有三个克隆显示类似的特性。被三个克隆的任一个转染的细胞以可与野生型FIV-141克隆相比的速率产生病毒颗粒。对于所有3个克隆，病毒基因组和RT酶被包被至病毒体中。对于FeP2细胞，从被3个克隆转染的CRFK细胞释放的病毒体为非感染性的，表明Vif为T淋巴细胞中的病毒复制所必需。ORF(2)del在ORF(2)缺失克隆中缺失了整个ORF(2)的开放读框。被克隆转染的细胞以可与野生型克隆相比的速率装配和释放病毒颗粒。虽然病毒基因组和RT酶被包装至病毒颗粒中，但克隆在FeP2细胞中未复制，表明在这些细胞中ORF(2)的基因产物为病毒产生所必需。RRE del在RRE del中缺失了包括FIV的RRE序列的总共150个碱基中的84个。该缺失严重地损伤转染细胞中的病毒结构蛋白的表达和病毒颗粒的产生。在转染CRFK细胞上清中未检测到p26的产生。类似地，未测定出包被的RT活性。这些结果较好地与这种建议一致，即RRE序列为未剪接以及单剪接的病毒RNA从细胞核转运至细胞质所必需。然而，通过RT PCR证实病毒体相关的病毒基因组RNA存在，并且病毒颗粒在FeP2细胞中具有感染性，虽然与野生型FIV-141克隆相比为显著降低的水平。从整体上看，这些结果表明RRE序列的缺失显著降低病毒结构蛋白的表达。然而，看来缺失未全部消除表达，转染细胞产生少量感染性病毒体颗粒。IN del在IN del克隆中缺失几乎整个IN蛋白。在转染至CRFK细胞中时，克隆显示可与野生型克隆相比的病毒蛋白表达和病毒颗粒产生。病毒体相关的RT PCR和RT活性分析表明病毒基因组RNA和RT酶被包被至病毒颗粒中。出乎意料地，从被克隆转染的细胞中回收的病毒体具有感染性，并可在FeP2细胞中复制，虽然与野生型病毒细胞为降低的水平。整合是许多逆转录病毒，包括HIV-1的生产性感染所需的必需步骤。数据表明与HIV相反，FIV的IN蛋白在FeP2细胞中可能不是病毒蛋白表达和病毒复制的必需要求。DU del在DU del克隆中缺失几乎整个DU基因。该基因产物将dUTP转化为dUMP。克隆中缺失DU基因不影响转染的CRFK细胞中的病毒蛋白的表达或病毒颗粒的产生。病毒基因组和RT酶被包被，转染细胞产生的病毒体对于FeP2细胞具有感染性。然而，在FeP2中缺失克隆以比野生型FIV-141病毒慢的速率复制。这表明DU基因为病毒最大量复制所必需。数据与DU缺失FIV保留其在T淋巴细胞中复制的能力的报道一致。生物材料的保藏下面的生物材料于1998年7月1日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852，USA，被给予了下面的保藏号ATCC保藏号病毒毒株FIV-141VR-2619质粒pFIV-141-B1 203001上面所引用的所有专利、专利申请和公开的文献被本文全文引作参考。
本发明不局限于所述的具体实施方案，它们旨在简单地说明本发明的各个方面。功能等同的组合物和方法落在本发明的范围内。
序列表<110>PFIZER PRODUCTS，INC.<120>保护动物免于慢病毒相关疾病的组合物和方法<130>PC10173A<140>待给定<141>1999-08-23<150>60/097,645<151>1998-08-24<160>57<170>PatentIn Ver.2.0-beta<210>1<211>9464<212>DNA<213>猫免疫缺损病毒<400>1tgggaagatt attgggatcc tgaagaaata gaaaaaatgc taatggactg aggacgtaca 60taaacaagtg acagatggaa acagctgaat atgactcaat gctagcagct gcttaaccgc 120aaaaccacat cctatgtaaa gcttgccgat gacgtgtatc ttgctccatt ataagagtat 180ataaccagtg ttttgtaaaa gcttcgagga gtctctctgt tgagggcttt cgagttctcc 240cttgaggctc ccacagatac aataaaaaac tgagctttga gattgaaccc tgtcttgtat 300ctgtgtaatt tctcttacct gcgaatccct ggagtccggg ccagggacct cgcagttggc 360gcccgaacag ggacttgaaa aggagtgatt agggaagtga agctagagca atagaaagct 420gtcaagcaga actcctgcag gccttgtatg gggagcagtt gcagacgctg ctggcagtga 480gtatctctag tggagcggac ctgagctctg gattaagtca ctgctcacag gcctagataa 540agattatctg gtgactcttc gcggatcgtc aaaccagggg attcgtcggg ggacagccaa 600caaggtagga gagattctac agcaacatgg ggaatggaca ggggcgagac tggaaaatgg 660ccattaagag atgtagtaat gttgctgtag gggtagggag 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1.基本纯化的FIV-141病毒，其中所述病毒具有对应于SEQ IDNO1的基因组核酸序列。
2.被权利要求1的病毒感染的宿主细胞。
3.在权利要求2的宿主细胞中产生的FIV-141子代病毒。
4.一种诱导FIV-141抗体产生的方法，包括用权利要求1的病毒感染动物。
5.权利要求4的方法，其中所述病毒在接种前被灭活。
6.一种诱导FIV-141抗体产生的方法，包括用权利要求2的宿主细胞感染动物。
7.权利要求6的方法，其中所述细胞在感染前被固定。
8.权利要求4-7任一项的方法，进一步包括从所述动物中分离所述抗体。
9.通过权利要求4-7任一项的方法制备的抗体。
10.包含权利要求1的FIV-141病毒的全病毒疫苗，其中所述病毒已被灭活。
11.一种固定细胞疫苗，包含被权利要求1的病毒感染的宿主细胞，其中所述宿主细胞被固定。
12.一种在猫中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后FIV-141感染的保护性免疫的剂量将权利要求10或权利要求11的疫苗施用于所述猫中。
13.基本纯化的具有对应于SEQ ID NO1序列的核酸分子。
14.权利要求13的核酸分子，其中所述核酸为DNA。
15.被权利要求13的核酸转染的宿主细胞。
16.由权利要求15的宿主细胞产生的FIV子代病毒。
17.一种在动物中诱导FIV-141抗体产生的方法，包括对所述动物注射权利要求13的核酸分子。
18.一种在动物中诱导抗体产生的方法，包括用权利要求15的宿主细胞感柒所述动物。
19.权利要求18的方法，其中所述宿主细胞在感染前已被固定。
20.权利要求17-19任一项的方法，进一步包括从所述动物分离所述抗体。
21.通过权利要求17-19任一项的方法制备的抗体。
22.一种固定细胞疫苗，包含被权利要求13的核酸转染的宿主细胞，其中所述宿主细胞已被固定。
23.一种在猫中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后FIV-141感染的保护性免疫的剂量将权利要求22的疫苗施用于所述猫中。
24.一种减毒的FIV-141病毒，其在进入宿主细胞中时复制，但当与野生型病毒相比时显示显著降低的对猫T淋巴细胞的感染性，其中所述减毒病毒通过突变FIV-141基因组中的一个基因产生，所述基因选自Vif、MA、ORF(2)、ENV、CA、NC、SU、TMf、CT、IN、DU、V3/4、V7/8和RRE。
25.权利要求24的减毒的FIV-141病毒，其中所述基因选自Vif、MA、ORF(2)和ENV。
26.被权利要求24的减毒病毒转染的宿主细胞。
27.在权利要求26的宿主细胞中产生的FIV-141减毒病毒。
28.一种诱导FIV-141抗体产生的方法，包括用权利要求24的减毒FIV-141病毒感染动物。
29.权利要求28的方法，其中所述减毒的FIV-141病毒在感染前被灭活。
30.一种诱导FIV-141抗体产生的方法，包括用权利要求26的宿主细胞感染动物。
31.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞在感染前被固定。
32.权利要求28-31任一项的方法，进一步包括从所述动物中纯化所述抗体。
33.由权利要求28-31任一项的方法制备的抗体。
34.一种减毒的全病毒疫苗，包含权利要求24或25的病毒。
35.一种在猫中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后FIV-141感染的保护性免疫的剂量将权利要求34的疫苗施用于所述猫中。
36.一种减毒的宿主细胞疫苗，包含权利要求26的宿主细胞。
37.一种减毒的宿主细胞疫苗，包含被权利要求25的病毒感染的宿主细胞。
38.一种在猫中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后FIV-141感染的保护性免疫的剂量将权利要求36或37的疫苗施用于所述猫中。
39.基本纯化的具有对应于SEQ ID NO1的序列的FIV-141核酸分子，但其中所述核酸分子在一个选自Vif、MA、CA、NC、SU、TMf、ORF(2)、CT、ENV、Vifn、Vifc、IN、DU、V3/4、V7/8和RRE的基因中发生突变，并且突变的分子在导入宿主细胞中时，产生能复制但相对于野生型FIV-141在PBMCs中具有显著降低的感染性的病毒。
40.权利要求39的核酸分子，其中所述基因选自MA、Vif、ORF(2)和ENV。
41.权利要求39或40的核酸分子，其中所述核酸为DNA。
42.被权利要求39的核酸分子转染的宿主细胞。
43.由权利要求42的宿主细胞产生的FIV子代病毒。
44.一种在动物中诱导FIV-141抗体产生的方法，包括对所述动物注射权利要求39的核酸分子。
45.一种在动物中诱导FIV-141抗体产生的方法，包括对动物注射权利要求42的宿主细胞。
46.权利要求45的方法，其中所述宿主细胞在感染前被固定。
47.权利要求44-46任一项的方法，进一步包括从所述动物中纯化所述抗体。
48.由权利要求44-46任一项的方法制备的抗体。
49.一种疫苗，包含当施用于猫时足以诱导免疫性的浓度的权利要求39的核酸分子。
50.权利要求49的疫苗，其中所述核酸为DNA。
51.一种疫苗，包含被权利要求39的核酸分子转染的宿主细胞。
52.权利要求51的疫苗，其中所述宿主细胞已被固定。
53.一种在猫中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后FIV-141感染的保护性免疫的剂量将权利要求49-52任一项的疫苗施用于所述猫中。
54.一种制备在宿主细胞中复制但相对于其野生型对应物具有显著降低的感染性的减毒慢病毒的方法，所述方法包括突变一个或多个选自MA、CA、NC、DU、ENV、SU、TMf、CT、V3/4、V7/8、Vif、Vifn、Vifc、IN、RRE和ORF(2)的基因。
55.权利要求54的方法，其中所述基因选自MA、ORF(2)和ENV。
56.权利要求54或55的方法，其中所述慢病毒为FIV毒株。
57.由权利要求54或55的方法制备的减毒慢病毒。
58.被权利要求57的减毒病毒感染的宿主细胞。
59.一种诱导慢病毒抗体产生的方法，包括用权利要求57的减毒病毒感染哺乳动物。
60.一种诱导慢病毒抗体产生的方法，包括用权利要求58的宿主细胞感染哺乳动物。
61.权利要求60的方法，进一步包括从所述哺乳动物中纯化所述抗体。
62.通过权利要求59或权利要求60的方法制备的抗体。
63.一种治疗哺乳动物慢病毒感染的方法，包括对所述哺乳动物以足以减少一种或多种与所述感染相关的症状的剂量施用权利要求62的抗体。
64.一种减毒的全病毒疫苗，包含权利要求54或55的病毒。
65.一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后至少一种所述慢病毒毒株感染的保护性免疫的剂量将权利要求64的疫苗施用于所述哺乳动物中。
66.一种减毒的宿主细胞疫苗，包含被权利要求58的慢病毒感染的宿主细胞。
67.一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后至少一种所述慢病毒毒株感染的保护性免疫的剂量将权利要求66的疫苗施用于所述哺乳动物中。
68.一种制备适用于用于慢病毒感染的疫苗的核酸的方法，包括a)逆转录所述慢病毒基因组RNA；b)克隆步骤a)的逆转录的RNA；c)突变步骤b)的克隆的核酸中的一个基因，其中所述基因选自MA、CA、NC、SU、TMf、ORF(2)、CT、ENV、V3/4、V7/8、Vif、Vifn、Vifc、IN、DU和RRE。d)克隆步骤c)突变的核酸。
69.权利要求68的方法，其中突变的分子在导入宿主细胞中时，产生能复制但相对于从未突变的野生型核酸制备的慢病毒具有显著降低的感染性的病毒。
70.权利要求69的方法，其中所述慢病毒为FIV毒株，并且所述减毒病毒能复制，但相对于从未突变的野生型核酸制备的FIV在猫T淋巴细胞中具有显著降低的感染性。
71.权利要求69或70的方法，其中所述基因选自MA、ORF(2)和ENV。
72.被权利要求71的核酸分子转染的宿主细胞。
73.由权利要求72的宿主细胞产生的子代慢病毒。
74.一种诱导产生至少一种慢病毒毒株的抗体的方法，包括对所述动物注射权利要求68的核酸分子。
75.由权利要求74的方法制备的抗体。
76.一种疫苗，包含当施用于哺乳动物足以诱导免疫性的浓度的权利要求69的核酸分子。
77.一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后所述慢病毒感染的保护性免疫的剂量将权利要求76的疫苗施用于所述哺乳动物中。
78.一种疫苗，包含当施用于猫中时足以诱导免疫性的浓度的权利要求70的核酸分子。
79.一种在猫中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后至少一种FIV毒株感染的保护性免疫的剂量将权利要求78的疫苗施用于所述猫中。
80.包含权利要求72的宿主细胞的疫苗。
81.一种在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包括以足以诱导抗随后所述慢病毒感染的保护性免疫的剂量将权利要求80的疫苗施用于所述哺乳动物中。
82.权利要求81的方法，其中所述哺乳动物为猫，所述慢病毒为FIV毒株，并且所述疫苗以足以诱导抗随后至少一种FIV毒株感染的保护性免疫的剂量施用。
83.具有ATCC保藏号VR-2619的猫免疫缺损病毒毒株，和从其制备的子代病毒。
84.称为pFIV-141-B1的具有ATCC保藏号203001的质粒。
全文摘要
本发明涉及一种新的猫免疫缺损病毒,其在本文被称为FIV－141,以及通过突变病毒基因组的特定区而产生的病毒的减毒形式。该病毒和病毒的突变形式可被用来诱导FIV－141抗体的产生以及被设计用于保护猫免于FIV的疫苗中。
文档编号A61K48/00GK1253176SQ99118128
公开日2000年5月17日 申请日期1999年8月24日 优先权日1998年8月24日
发明者R·T·邓, M·G·谢帕德 申请人:辉瑞产品公司