专利名称：细胞粘连分子表达抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有有效成分组胺加免疫球蛋白的新型药物，详细的说本发明涉及含有有效成分组胺加免疫球蛋白的细胞粘连分子表达抑制剂。
免疫球蛋白和组胺的复合体作为组胺加免疫球蛋白制剂是已知的，由于其具有使变态反应患者或哮喘患者降低的组胺固定能力得以恢复的作用，作为非特异性减敏疗法剂可以用于支气管哮喘、变应性鼻炎、血管运动性鼻炎或荨麻疹、慢性湿疹、变应性皮炎等变态反应性皮肤病的治疗。另外，发现该药物有抑制组胺游离的作用，它没有作为对症疗法剂使用的抗组胺剂或肾上腺皮质激素等具有的副作用，作为安全性较高的药物得到了广泛的使用。〔《医疗药日本医药品集》(1996年10月版，日本医药情报中心编，药业时报社发行)的第463、464页〕。
另外，除上述之外还有报告指出组胺加免疫球蛋白具有抑制嗜酸性粒细胞增多的作用和免疫调节作用，以及组胺免疫加球蛋白即使口服给药也显示同样的药理作用(特开平7-53406号公报、特开平9-31311号公报等)。但是，在以前任何一篇文献中均没有关于组胺加免疫球蛋白具有抑制细胞粘连分子表达作用的记载。
本发明的目的在于提供一种副作用少、安全性高的新型细胞粘连分子表达抑制剂。
本发明者对上述组胺加免疫球蛋白继续进行了悉心的研究，结果发现本药物可以抑制细胞粘连分子的表达。本发明提供一种含有有效成分组胺加免疫球蛋白的新型细胞粘连分子表达抑制剂。
本发明药物组合物的有效成分组胺加球蛋白为组胺与免疫球蛋白的复合体，可以将免疫球蛋白成分与组胺成分适当混合制备而成。在本发明中使用的免疫球蛋白作为用于人的药品当然能够以人免疫球蛋白为原料使用，人免疫球蛋白可以由血清或胎盘血浆等采用常规方法制得。为了确保其作为药物的安全性，应当符合通常对血浆成分制剂制定的标准。例如，使用HBs抗原、HCV抗体及HIV抗体呈阴性的人血浆作为原料血浆并进行加热处理，可以避免混入肝炎病毒或艾滋病病毒等的危险性。加热处理一般用于病毒的惰性化，例如在血浆成分制剂中通常可以使用60℃-10小时液态加热处理、60℃-10小时蒸汽化加热处理、65℃-96小时干燥加热处理等。
在适用于人以外的场合，相应于作为对象的动物的种类，免疫球蛋白可以从人以外的动物制备后再使用。免疫球蛋白由IgG、IgA、IgM等种类组成，本发明的免疫球蛋白可以使用各种免疫球蛋白中的一种或数种。
组胺成分可以使用游离的组胺或其盐酸盐、磷酸盐、苦味酸盐等可药用盐。优选的组胺成分例如组胺二盐酸盐。
在制备本发明的药物组合物时，例如可以将免疫球蛋白1至200mg(优选5至50mg)和组胺成分0.01至2μg(优选0.05至0.5μg)适当溶解于生理盐水、蒸馏水等合适的溶剂中，搅拌、混合制得，可以通过冷冻或冷冻干燥保存。
以下给出本发明药物组合物的一个配方例，但本发明并不仅限于此。
本发明的药物组合物可以与适当的药用载体或稀释剂组合制成药物，可以采用本领域使用的常规方法配制成用于口服或非口服给药的固体、半固体或液体剂型。根据配方可以单独使用本发明药物组合物作为有效成分，也可以与其它药物活性成分制成复方制剂。
注射剂优选使用注射用蒸馏水或生理盐水等制成等渗溶液后制得的制剂。另外，配制成制剂时除本发明药物组合物之外还可以适当加入溶解辅助剂、等渗剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等添加剂，例如可以使用柠檬酸、苯甲酸钠、甘氨酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、磷酸盐、抗坏血酸钠、氯化钠、碳酸氢钠等。另外，本发明药物组合物也可以制成使用时再溶解的注射剂，可以将干燥粉末填充在小瓶中，或将溶液型药物制剂注入到小瓶中后冷冻干燥制得。这种场合下，除上述添加剂之外必要时还可以加入葡萄糖、甘露醇、山梨醇等赋形剂等。
制成口服给药用制剂时，可以直接或与合适的添加剂适当组合制成片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，其中所述合适的添加剂例如乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、柠檬酸钙等常用赋形剂，以及结晶纤维素、羟丙基纤维素等纤维素衍生物，阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶等粘合剂，玉米淀粉、马铃薯淀粉、羧甲基纤维素钙等崩解剂，滑石粉、硬脂酸镁等润滑剂，其它增量剂、润湿剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂、香料等。另外，本发明药物组合物也可以制成使用时再用蒸馏水溶解的口服液，可以通过将组胺加免疫球蛋白溶液填充到小瓶等后冷冻干燥制得，在制成制剂的时候，必要时还可以加入上述各种添加剂。相应于患者的状态和疾病的种类，也可以适当制成上述以外的适当剂型进行治疗，例如吸入剂、气雾剂、软膏、滴眼剂、栓剂等。
本发明药物组合物优选的给药量最好是根据疾病的种类、疾病发展程度、患者的年龄·性别、剂型、给药方法、给药时间等适当设定。例如为了能够得到注射剂所预期的效果，对于一般的成人通常可以1至300mg(优选5至150mg)1周1次乃至数次皮下给药，但本发明并不受其特别限定。
本发明药物组合物的优选方式如下所述。
(1)含有有效成分组胺加免疫球蛋白的细胞粘连分子表达抑制剂。
(2)如上述(1)所述的药物组合物，免疫球蛋白成分与组胺成分的比例是相对于免疫球蛋白成分1～200mg组胺成分为0.01～2μg。
(3)如上述(1)所述的药物组合物，免疫球蛋白成分与组胺成分的比例是相对于免疫成分5～50mg组胺成分为0.05～0.5μg。
(4)如上述(1)～(3)所述的药物组合物，免疫球蛋白成分与组胺成分的比例是相对于免疫球蛋白成分12.0mg组胺成分为0.15μg。
(5)如上述(1)～(4)所述的药物组合物，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。
(6)如上述(1)～(5)所述的药物组合物，组胺成分为组胺二盐酸盐。
(7)如上述(1)～(6)所述的药物组合物，该药物组合物为注射剂。
以下结合实施例更具体的说明本发明，但本发明并不受其任何限定。实施例下面列出本发明药物组合物制备方法的一个例子。另外，由于在以下的药理试验中使用大鼠作为试验动物，因而用大鼠免疫球蛋白代替人免疫球蛋白。也就是说，将大鼠免疫球蛋白和组胺二盐酸盐按照下述比例溶解于生理盐水，在室温下搅拌2小时后冷冻干燥，在使用时用生理盐水溶解后皮下给药。〔本发明化合物〕 〔大鼠免疫球蛋白量〕 〔组胺二盐酸盐量〕HG50 5.3mg0.10μgHG75 12.0mg 0.15μgHG90 28.8mg 0.30μg由于制得的HG50、HG75和HG90在下述任何药理试验中均具有显著作用，作为代表例给出HG75得到的结果。实施例药理试验按照下述进行。1)试验动物由于ヤ-ルスリバ-ジヤパン购入Lewis大鼠(6～10周龄，雌性，SPF)。在室温22±2℃、湿度55±10％、1日12小时(上午8点～下午8点)人工照明的动物室预备饲养5日，用健康正常的动物进行实验。2)组胺加免疫球蛋白的制备与给药将正常大鼠血清分离出的大鼠免疫球蛋白(コ-ン组分II和III)和组胺二盐酸盐溶解于生理盐水，使其最终浓度分别达到26.6mg/mL和0.333μg/mL，在23℃搅拌2小时，作为HG75使用。从免疫日或细胞植入日开始每隔1日在大鼠背部皮下给药。对照大鼠按照同样的时间表投给生理盐水。3)被动实验性变应性脑脊髓炎(pEAE)的诱导方法将豚鼠髓磷脂碱性肽(GP-MBP68-84)溶液(400μg/mL)与等体积的完全佐剂(H37Ra)混合，制成乳剂，其中豚鼠髓磷脂碱性肽含有相当于髓磷脂碱性蛋白质(MBP)诱发脑脊髓炎部分的合成肽(MBP68-84)。在用乙醚麻醉的Lewis大鼠左后肢脚踝皮下投给该乳剂0.1mL。10～14日后由大鼠无菌的取出脾脏，制备细胞浮游液。使用0.75％氯化铵/17mM Tris-盐酸(pH＝7.65)溶液，除去红细胞。离心分离后，使脾脏细胞浮游在RPMI-1640培养基中，用台盼蓝溶液(0.4％)测定活细胞浓度。用含有灭能胎牛血清(7％)的培养基(含有10mMヘペス缓冲液、20mML-谷氨酸、50μg/mL青霉素、50u/mL链霉素、5×10-6M2-巯基乙醇的RPMI-1640)将细胞浓度调节为2×106个/10mL，在2μg/mL刀豆素A存在条件下，将2×107个/10mL在培养皿中，37℃、5％CO2条件下培养3日。培养后回收细胞，离心洗涤3次。滤除凝集块，用台盼蓝溶液(0.4％)测定细胞浓度，用生理盐水调节为4×107个/mL。用X线照射装置(MBR-1520R日立生产)对Lewis大鼠进行800rad的X线照射后，将2×107个/0.5mL细胞植入尾静脉。4)实验性变应性脑脊髓炎(EAE)临床症状的判断基准大鼠临床症状使用判断基准值(0～5)记分进行评价。2～5的各临床症状部分发病时，采用减去0.5得到的值。另外，对临床症状的评价使用观察者不清楚药物投给组合的盲检法。判断值 临床症状0 正常0.5尾部轻度下垂0.75 尾部中度下垂1 尾巴的保持能力消失2 活动性降低3 一侧后肢麻痹4 两侧后肢麻痹5 两侧后肢麻痹，并伴有失禁5)组织的获取方法将活性化脾脏细胞植入Lewis大鼠，第5和第7日使之放血，取得脊髓。从脊髓切出腰锥部分，埋入到0.C.T.复合物中，用液氮冷冻。使用前始终保存在-20℃条件下。6)薄切切片试样的制备方法和固定方法用恒冷切片机将冷冻保存的脊髓切成6μm的厚度，装在明胶包衣的载玻片上。将载玻片上的试样充分风干后，在冷却到-20℃的丙酮中浸泡10分钟，再次风干。切片试样在试样前始终保存在-20℃条件下。7)苏木精曙红染色法将载玻片上的试样置于流水中洗涤5分钟。在迈耶的苏木精液中浸泡10分钟。在流水中洗涤15分钟后，在曙红液中浸泡5分钟。用流水除去多余的色素，依次用70％、90％、100％乙醇脱水。最后，用二甲苯浸泡3次，每次3分钟，用エンテラニユ-包埋。8)免疫组织染色法将载玻片上的试样充分干燥，在冷磷酸缓冲液(PBS)中浸泡3次，每次5分钟。然后在含有0.3％过氧化氢、0.1％叠氮化钠的冷PBS中浸泡15分钟。在冷PBS中浸泡3次洗净，每次5分钟，之后为了封闭，在试样中加入含有1％牛血清白蛋白的PBS(封闭缓冲液)，静置20～30分钟。除去封闭缓冲液，在试样中加入用封闭缓冲液稀释到20倍的生物素修饰小鼠抗大鼠ICAM-1抗体和LFA-1抗体，静置1小时。用冷PBS浸泡2次，每次5分钟，洗涤。在试样中加入用Elite ABC试剂制备的抗生物素蛋白与生物素的复合体，静置30分钟。用冷PBS浸泡2次洗净，每次5分钟。在试样中加入DAB反应溶液后，用显微镜确认显色的程度，用蒸馏水停止显色。9)核染色及包埋法为了进行核染色，将免疫组织染色结束后的试样置于1％甲基绿溶液中浸泡10分钟。在100％乙醇中浸泡3次，每次1分钟，然后在二甲苯中浸泡3次每次5分钟进行脱水后，将试样用エンテラニユ-包埋。10)组织的评价方法ICAM-1和LFA-1表达的评价是用光学显微镜对免疫组织染色后的试样进行观察，根据表达的程度记分，即0正常、1轻微、2轻度、3中度、4重度、5十分严重11)统计处理用平均值±标准差(S.E.M)表示免疫组织染色的结果，用Mann-Whitney(非参数法)或Scheffe检验(共分散法)进行显著性差异检验，危险率(P值)小于0.05时具有显著性差异。12)本发明药物组合物对患脑脊髓炎(EAE)时脊髓中细胞粘连分子表达的抑制效果采用免疫组织化学方法考察本发明药物组合物对主要在血管内皮细胞上表达的ICAM-1与用其counter partner在白血球上表达的LFA-1的表达的抑制效果。结果的一个例子如
图1所示。在EAE未发病组(Intact)中ICAM-1完全没有表达(分数0)。在EAE发病组，如图1所示，ICAM-1表达的程度是相对于发病初期(细胞植入第5天)的发病对照组分数1.8±0.3，本发明药物组合物的给药组分数为0.9±0.1，确认其具有显著的(p＜0.05)抑制效果。另外，相对于发病的峰期(细胞植入第7天)的发病对照组分数2.9±0.1，本发明药物组合物给药组的分数为1.7±0.3，确认同样具有显著的(p＜0.01)的抑制效果。
另外，相对于发病初期(细胞植入第5天)的发病对照组的分数3.1±0.6，本发明药物组合物给药组的分数为1.0±0.0，这一点虽然在图中没有表示，但仍可以确认对于LFA-1的表达程度具有显著的(p＜0.01)抑制效果。另外，相对于发病峰期(细胞植入第7天)的发病对照组的分数3.7±0.5，本发明药物组合物给药组的分数为3.1±0.5，具有降低的趋势。
多发性硬化症的模型——实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的特征在于伴有免疫细胞向中枢神经系统浸润和炎症的后肢麻痹。对于细胞向中枢浸润起主要作用的可以认为是形成血脑屏障的内皮细胞与浸润细胞上的细胞粘连分子之间的相互作用。ICAM-1是属于免疫球蛋白超家族的代表性细胞粘连分子，通过IL-1、TNF、IFN-γ等炎症性细胞因子的诱导，主要在血管内皮细胞上表达，与白细胞上的LFA-1或Mac-1结合。上述药理试验结果表明本发明药物组合物可以显著抑制由EAE诱导的ICAM-1等细胞粘连分子的表达。如上所述，已经明确ICAM-1、IFA-1等细胞粘连分子与炎症反应有很深的关系，因此本发明的药物组合物作为可以治疗和预防脑炎、肾炎、心肌炎、血管炎、肠炎、肺炎和全身性炎症反应综合症(SIRS)等炎症性疾病的细胞粘连分子表达抑制剂是有效的。
附图的简要说明图1表示本发明药物组合物对EAE中细胞粘连分子表达的抑制效果结果的一例。
权利要求
1.细胞粘连分子表达抑制剂，含有有效成分组胺加免疫球蛋白。
全文摘要
提供一种副作用少、安全性高的新型细胞粘连分子表达抑制剂。本发明提供一种含有有效成分组胺加免疫球蛋白的新型细胞粘连分子表达抑制剂。已知本发明药物组合物的有效成分组胺加免疫球蛋白副作用发生频率低,因此本发明药物组合物作为可以治疗或预防各种炎症性疾病的安全性高的细胞粘连分子表达抑制剂是有用的。
文档编号A61P43/00GK1253833SQ9912348
公开日2000年5月24日 申请日期1999年11月12日 优先权日1998年11月13日
发明者内木充 申请人:日本脏器制药株式会社