松苞菇切块，每一个梭柄松苞菇均分为四块。
[0043] I. 2. 3冷冻干燥：将梭柄松荀葫块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样品。
[0044] 1. 3梭柄松苞菇醇提物的制备
[0045] 1. 3. 1粉碎：将经预处理的梭柄松苞菇粉碎，过40目筛，即获得梭柄松苞菇粉末。
[0046] 1.3. 2乙醇洗涤：将适量梭柄松苞菇粉末加入索氏提取装置，并按料液比1 : 10， 加入95%的乙醇，80°C水浴回流抽提2h后，将混合液加入离心管离心（5000rpm，5min)，将 上清液干燥，所得粉末即为该反应的还原剂。
[0047] 1. 4梭柄松苞菇多糖的制备
[0048] 1.4. 1水提取：将经乙醇洗涤后，离心管中的沉淀样品干燥，并按料液比 I: 20(w:V)与蒸馏水混合，超声波作用功率为150W(每工作15min，暂停5min)，提取温 度80°C，提取时间2. 5h，以上步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液。
[0049] 1. 4. 2乙醇沉淀：将多糖提取液利用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95%乙醇溶 液，搅拌〇. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心（5000rpm，5min)，弃上清液，收集沉淀，冻干待 用。
[0050] 1.4. 3去除蛋白质：按固液比I: 10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇粗多糖，随后加 入1/4倍体积的氯仿-正丁醇（3 : 1)，充分振荡30min后，离心（5000rpm，5min)，获得三 层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该步骤5次。
[0051] 1. 4. 4去除小分子物质：将去除蛋白质的粗多糖提物，加入透析袋中（截留分子量 为5000)，流水过夜，以去除小分子物质。再利用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，并加入4 倍体积的95%乙醇溶液，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心（5000rpm，5min)，弃上清 液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冻干保藏于_80°C冰箱待用。
[0052] 1. 5纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的制备
[0053] 1. 5. 1还原剂浓度的优化
[0054] ①将5mL亚硒酸钠溶液（2mM)置于磁力搅拌器上，加入5mL超纯水，再分别缓慢滴 加入5mL不同浓度的梭柄松苞菇醇提物溶液（0~9mg/mL)及IOOmM的维生素C(对照）， 常温反应24h后，将反应液置于透析袋（SkD)中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠被检测到 (取少量透析袋外液体，滴加维生素C后液体不变红，则证明没有亚硒酸钠存在），所得透析 袋内样品即为纳米硒。
[0055] ②利用纳米粒度仪测定纳米硒的粒径，其中参数设置为：入射光为氦氖激光，波长 入为633nm，入射角为90°，测量温度为25°C〇
[0056] 结果：由表1可以看出，还原剂的浓度显著的影响着纳米硒的粒径（p< 0.05)， 其中没有添加还原剂的阴性对照组，没有纳米硒粒子被检测到，由此可见还原剂对于纳米 硒的制备是必不可少的。当添加了还原剂后，所有浓度的梭柄松苞菇醇提物均可将亚硒酸 钠还原成纳米硒，其中梭柄松苞菇醇提物的浓度为7mg/mL时，可以获得最小粒径的纳米硒 (72. 7nm)，这个数据显著优于阳性对照的89. 5nm(p< 0. 05)。因此该氧化还原反应的最适 梭柄松苞菇醇提物的浓度为7mg/mL。
[0057] 表1梭柄松苞菇醇提物的浓度对纳米硒粒径的影响d
[0058]
【主权项】
1. 纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在于，其包括以下步骤： (1) 样品预处理：依次进行清洁、切块和冷冻干燥，获得含水量低于5%的新鲜梭柄松 苞菇样品； (2) 提取梭柄松苞菇多糖：依次将新鲜梭柄松苞菇样品进行粉碎、乙醇洗涤、水提取、 乙醇沉淀、去除蛋白质和去除小分子物质的处理，从而获得梭柄松苞菇多糖； (3) 制备还原剂：将梭柄松苞菇多糖提取过程中的乙醇洗涤液冷冻干燥，获得固体粉 末即为还原剂； (4) 制备纳米硒：利用制备好的还原剂，将亚硒酸钠还原成单质硒； (5) 制备纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体：利用多糖游离的羟基，对纳米硒表面进行修 饰和包裹，形成稳定的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
2. 根据权利要求1所述的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在 于，还包括测定纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的抗糖尿病氧化应激活性，其利用STZ诱导 的糖尿病小鼠作为动物实验模型，评价糖尿病小鼠在服用纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体 后，对机体内的各生理指标的改善。
3. 根据权利要求1所述的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在 于，所述步骤（1)样品预处理的具体操作为： (a) 清洁：用特制塑料刮片将适量新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，且不可用水清洗； (b) 切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个梭柄松苞菇均分为四块； (c) 冷冻干燥：将梭柄松苞菇块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样品。
4. 根据权利要求1所述的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在 于，所述步骤（2)样品预处理的具体操作为： (a) 、粉碎：将经预处理的梭柄松苞菇粉碎，过40目筛，即获得梭柄松苞菇粉末； (b) 、乙醇洗涤：将适量梭柄松苞菇粉末加入索氏提取装置，并按料液比1 : 10,加入 95%的乙醇，80°C水浴回流抽提2h后，将混合液加入离心管离心，离心转速为5000rpm，离 心时间为5min，将上清液干燥，所得粉末即为该反应的还原剂； (c) 水提取：将经乙醇洗涤后，离心管中的沉淀样品干燥，并按料液比1 : 20与蒸馏水 混合，超声波作用功率为150W，且使其每工作15min，暂停5min，提取温度80°C，提取时间 2. 5h，以上步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液； (d) 乙醇沉淀：将多糖提取液利用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95 %乙醇溶液，搅 拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，弃上清液，收 集沉淀，冻干待用； (e) 去除蛋白质：按固液比I : 10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇粗多糖，随后加入1/4 倍体积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心，且离心转速为5000rpm，离心时间为 5min，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该步骤5次； (f) 去除小分子物质：将去除蛋白质的粗多糖提物，加入截留分子量为5000的透析袋 中，流水过夜，以去除小分子物质，再利用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，并加入4倍体 积的95%乙醇溶液，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心，离心转速为5000rpm，离心时 间为5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冻干保藏于-80°C冰箱待用。
5. 根据权利要求3所述的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在 于，所述步骤（4)中制备纳米硒的具体操作为： 将5mL亚硒酸钠溶液置于磁力搅拌器上，加入5mL超纯水，再分别缓慢滴加入5mL不同 浓度的梭柄松苞菇醇提物溶液及IOOmM的维生素C，常温反应24h后，将反应液置于透析袋 中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒。
6. 根据权利要求5述的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在于， 检测透析袋外有无亚硒酸钠的方法是，取少量透析袋外液体，滴加维生素C后液体不变红， 则证明没有亚硒酸钠存在。
7. 根据权利要求1所述的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在 于，所述步骤（5)制备纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的具体操作为： 将5mL亚硒酸钠溶液置于磁力搅拌器上，加入梭柄松苞菇多糖溶液，充分混匀后，缓慢 滴加入5mL的梭柄松苞菇醇提物，常温反应24h后，将反应液置于相应规格的透析袋中处 理，直至透析袋外没有亚硒酸钠和梭柄松苞菇多糖被检测到，所得透析袋内样品即为纳米 硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
8. -种对糖尿病氧化应激具有调节作用的多糖复合体，其特征在于，该多糖复合体是 采用权利要求1-7意一项所述的方法制备的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
【专利摘要】本发明提供了一种纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其以梭柄松苞菇多糖作为分散剂，利用梭柄松苞菇多糖提取过程中的废弃物(乙醇洗涤液)作为反应的还原剂，不但实现了废弃物的再次利用，而且该新型还原剂相对于维生素C等传统还原剂，具有更出色还原性能(纳米硒的粒径减小了23.8％)；(2)整个制备过程的反应条件温和，成本低廉，并且操作简单易于工业推广，所得纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径仅为32.7nm，并且在存放60天后依然可以保持在62.7nm，具有非常好的生物可利用性及稳定性；(3)纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体中的梭柄松苞菇多糖和纳米硒能够协同促进该复合体的抗氧化活性。
【IPC分类】A61P3-10, A61K33-04, C08B37-00, A61K31-715
【公开号】CN104800240
【申请号】CN201510166652
【发明人】刘韫滔, 陈荻, 刘爱平, 韩国全, 张清, 刘书亮, 李 诚, 周康, 胡欣洁, 吴贺君
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月9日