甘露糖（10 μ M))溶解在pH 4.0的0.1 M乙酸钠中在60°C进行 2小时以及将壳聚糖（0. 2-2% )溶解在1. 5%的乙酸中。然后，将溶解的甘露糖和溶解的壳 聚糖组合，并在室温下孵育，以允许壳聚糖的胺基团与糖上的羰基反应以产生希夫碱。没必 要为佐剂起作用而还原希夫碱，事实上实施例显示在非还原的希夫碱是更好的佐剂（参见 图6)。在其它实施方案中，希夫碱可以是还原的。
[0027] 在另一个实施方案中，可使用醛交联壳聚糖和抗原。在一方面，组合物含有0. 5% 至2%的醛交联的壳聚糖以及抗原。合适地，最终疫苗制剂含有0. 5%至1. 5%壳聚糖。佐 剂可含有〇. 5%至3%的壳聚糖，合适地0. 5%至2%的壳聚糖，合适地0. 5%至1. 5%的壳 聚糖，合适地0.5%至1.2%的壳聚糖。在疫苗组合物中醛的终浓度合适地小于0.5%。醛 的最大浓度是基于疫苗所允许的残留醛的最大水平。更高水平的醛可用于交联壳聚糖，但 最终的疫苗制剂合适地含有小于〇. 5%的醛。在实施例中，甲醛用作醛来交联壳聚糖。也可 以使用其它醛如福尔马林、戊二醛、乙醛、丙醛或丁醛。醛将壳聚糖氨基与其它壳聚糖分子 上或抗原上的氨基交联。
[0028] 本文还提供制备包含醛交联的壳聚糖和抗原的疫苗制剂的方法。所述方法包括在 乙酸溶液中溶解壳聚糖。碳水化合物连接的壳聚糖也可以用作本方法的壳聚糖。合适地， 以在水中1. 5%的终浓度来使用乙酸或者将15ml的乙酸溶解在IL水中。合适地，壳聚糖的 量在0. 5%和2%之间，合适地在0. 5%和1. 5%之间。抗原在适当的水平加入到溶解的壳 聚糖中。可以由本领域的技术人员来确定在疫苗制剂中所使用的抗原的量和形式。最后， 将抗原和壳聚糖与醛组合，使得醛的终浓度在〇. 02%和0. 5%之间。醛能够将壳聚糖化学 交联至其它壳聚糖分子以及将壳聚糖化学交联至抗原。可以加入Tris-HCl以淬灭游离醛。 可以加入Tris至0. 5g/L的终浓度。
[0029] 本文公开的任何佐剂组合物可与增强分子组合，所述增强分子包括但不限于皂 素、钟样受体、细菌毒素中的B亚基、细菌毒素、破伤风类毒素、CpG基序、脂质体或单磷酰基 脂质A。合适地，所述增强分子用于免疫系统的进一步刺激剂并增强将疫苗制剂向受试者施 用后产生的免疫应答。
[0030] 本文中所提供的疫苗制剂包含本文所述的基于壳聚糖的佐剂和抗原。所述抗原 可以是本领域技术人员可获得的任何抗原。在疫苗中可以使用抗原，如蛋白质、合成肽、 缀合至载体（carrier)的肽、或微生物。微生物包括细菌、酵母、寄生虫、真菌、病毒，懦 虫（helminthes)或其它致病生物。微生物包括活的、死的、减毒的、重组的、或灭活的生 物。微生物的实例包括但不限于是沙门氏菌属，埃希氏菌属（Escherichia)、志贺氏菌属 (Shigella)、博德特氏菌属（Bordetella)、梭菌属（Clostridium)、支原体（Mycoplasma)、 葡萄球菌属（Staphylococcus)、链球菌属（Streptococcus)、芽孢杆菌属（Bacillus)、流 感（Influenza)以及艾美球虫属（Eimeria)。可使用热、甲醇或其它固定剂如甲醛或其它 醛在使用之前灭活或失活微生物。可以通过随后加入Tris-HCl至0. 5g/L的终浓度以淬 灭醛。合适的抗原还可以包括肽抗原，例如流感M2e、血凝素、神经氨酸酶、或核蛋白；艾美 球虫属TRAP或MPP ;梭菌唾液酸酶、SagA、a毒素、NetB毒素、或铁转运蛋白。其它肽抗原 的实例至少可见于美国申请号12/441，851 ;12/740, 631 ;12/740, 608 ;13/574, 504 ;以及 13/702, 827,所有这些以其整体引用并入本文。基于壳聚糖的佐剂可用于增加针对已经可 获得的疫苗或新开发的疫苗或自体疫苗的免疫应答。
[0031] 对与此工作相关的接种疫苗有两个显著改进。首先，当修饰的壳聚糖与灭活的疫 苗通过肠胃外途径共同施用时，我们注意到免疫应答优于使用其它佐剂如明矾所观察到 的免疫应答，并具有最小的注射部位反应。许多佐剂通过在注射部位引起炎症反应、或者 推迟从注射部位吸收、或者通过两者起作用。传统佐剂的缺点之一是它们往往会引起一 些反应、疼痛，以及在某些情况下它们会导致持久性病变使得产肉动物在屠宰时等级降低 (downgrade)或消瘦（trim)。修饰的壳聚糖可以减少这些与其它疫苗佐剂相关问题。它是 生产成本低易于制作成商业疫苗。
[0032] 此外，当通过灌胃或通过添加在饮用水中来口服地共同提呈失活的抗原时，产生 稳健的免疫应答。这对于驯养动物，特别是家禽真的很重要，因为处理肠胃外注射的劳动强 度非常大并且对鸟或其它动物造成胁迫。唯一例外的是孵化场，由于施用成本太昂贵一般 不在家禽中使用灭活疫苗。口服递送疫苗的能力改变了我们能够接种动物的方式。大规模 施用活疫苗（称为活的改性疫苗或减毒疫苗）有两个主要优点。首先，您可以通过饮用水 或喷施应用来大规模应用。其次，这些活疫苗也在局部黏膜（大多数病原体感染的呼吸道 和肠道）产生免疫力。正因为如此，无论是失活的或活的疫苗都能保护免受疾病，但历史上 活疫苗在预防实际感染上更加有效因而是优选的。
[0033] 失活的疫苗具有巨大的优势，因为能够迅速生产它们，同时在引起感染和疾病上 具有非常低的风险，它们在遗传上不能变回成致病亲本类型，并且因为这些原因它们具有 较低的监管问题。此外，还有一个庞大并且数量在日益增多的孤儿疾病，其通常不足以使疫 苗公司为之开发监管/许可的疫苗，美国（和许多其它国家）的法律中有条款用来规定生 产尤其是从感兴趣的失活病原体制备的并且用在源群集（source flock)(或动物或人类群 体）中的"自体"疫苗。在发展中国家，孤儿疾病发生需要疫苗，而疫苗无法负担得起，或者 在技术上是不可能本地生产的或者不能足够快地生产应对疫情（outbreak)。本文提供的佐 剂是负担得起的，并且在技术上直接用于生产。它们可容易与失活或灭活的微生物组合以 产生疫苗。
[0034] 可用于本文所描述技术的几个潜在应用。通过并入作为注射用佐剂的修饰的壳聚 糖可以改进对失活疫苗的全身应答。我们可以使用这种佐剂平台通过口服施用失活的疫苗 来预防一些疾病。当口服施用时，这种佐剂平台可以靶向刺激全身和/或黏膜应答-这意 味着它具有许多活疫苗的优点，但避免了上述活疫苗的问题。
[0035] 本文所述的佐剂和疫苗制剂可与其它药学上可接受的载体组合。药学上可接受的 载体是任何适合于体内施用的载体。适合用于所述组合物的药学上可接受的载体的实例包 括但不限制于水、缓冲溶液、葡萄糖溶液、油基的或细菌培养液。组合物的额外成分可合适 地包括例如赋形剂，例如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂和润滑剂。药学上可接受的载体或 稀释剂的实例包括稳定剂如碳水化合物（如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）、 蛋白质如白蛋白或酪蛋白、含蛋白剂如牛血清或脱脂乳、和缓冲液（如磷酸盐缓冲液）。特 别地，当向组合物添加这样的稳定剂时，组合物适合于冷冻干燥或喷雾干燥。所述组合物还 可被乳化。
[0036] 本文所述的组合物还可以和其它药物组合物组合，以及这些组合物可以在相同时 间或作为单一组合物的部分以任何顺序施用。施用这两种组合物以使得一种组合物在另一 种之前施用，其中施用时间差为1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、1 天、2天、4天、7天、2周、4周或更久。
[0037] 本文所用的疫苗制剂的有效量或治疗有效量是指这样的组合物的量，当向受试者 施用用于增强受试者针对靶疾病的免疫应答时，所述组合物的量能够增加免疫应答，如细 胞介导或抗体介导的免疫应答以限制与感染或暴露至靶疾病相关的发病率或死亡率。合适 地，所述免疫应答增强到这样的水平以使得施用足以实现治疗或阻断疾病相关的发病率或 死亡率。治疗有效量将取决于疫苗、制剂或组合物，疾病及其严重性和受试者的年龄、体重、 身体状况和反应性（responsiveness)。例如，相比施用无佐剂的相同抗原或明研乍为佐剂 的相同抗原，通过加入本文所述的佐剂在接种疫苗应答时产生的抗体水平可以增加2倍、3 倍、4倍或更高。增加的免疫应答可以是IgA应答，或者IgG应答。所述佐剂也可能导致与 继发感染