g离心10分钟而澄清。澄清的上清通过0. 22微米注射器滤器过滤，通过接种100 μ 1 和200 μ 1滤液而进行病毒分离。在PBS中制备10%粪便悬液并在1000 g离心10分钟而澄 清。在通过0. 22微米注射器滤器过滤后，通过接种100 μ 1和200 μ 1粪便滤液而进行病毒 分离。在猴样品上的所有病毒分离工作均一式二份进行，一组是在28°C保温的接种细胞培 养物，另一组是在37°C保温。
[0067] 分子检测及完整基因组测序：使用商业病毒RNA提取和纯化试剂盒（Qiagen， Germany)从血清、PBMC和澄清的组织匀浆中提取病毒基因组RNA。在从组织提取后，使用 商业一步RT-PCR试剂盒（Qiagen，Germany)和扩增所有EV71基因型的VPl基因的近端三 分之一的共有寡核苷酸引物对（有义：5'-CACCCTTGTGATACCATGGATCAG-3'（SEQ ID N0:4); 反义：5' -GTGAATTAAGAACRCAYCGTGTYT-3'（SEQ ID NO :5))进行 EV71 特异性病毒 RNA 的分 子扩增和检测。使用基于EV71 :TLLf3的完整基因组序列的18对序列特异性引物对扩增和 测序在PI第4天和第8天获得的2只猴的血清中存在的EV71的完整基因组。将通过直接 测序不产生良好序列读取的任何PCR扩增片段克隆进pZero-2 (Invitrogen，USA)并转化进 T0P10大肠杆菌中。从每个转化体选择至少10个菌落，在携带插入序列的纯化质粒上进行 测序。
[0068] 血清结合及中和抗体测定：在接近完全CPE时收获用基因型B3的EV71感染的 Vero细胞，并用无菌PBS洗5次。最后一次洗涤后，将感染细胞的悬液与洗涤的未感染的 Vero细胞悬液以大约4个感染细胞比1个未感染细胞的比率混合。将10微升的含有250 个细胞的混合细胞悬液小心放置在12孔Tef Ion包被玻片的每个孔上，并在热平板上干燥。 干燥的玻片在冷丙酮中固定10分钟，用作内部抗原以通过间接免疫荧光测定从I : IOIgM 和I : 20IgG的最初稀释度开始测定EV71结合抗体。在抗EV71 IgM效价测定中，在用无 菌PBS进行系列2倍稀释之前，猴血清用合适浓度的蛋白A(Invitrogen，USA)处理以去除 IgG0
[0069] 根据世界卫生组织的Polio Laboratory Manual 2004所述方法稍作修改通过 用Vero细胞的微中和测定确定猴的中和抗体效价。用于中和的每种EV71基因型的浓度 是100CCID 5(I/100 μ 1。用96孔平底培养平板进行病毒中和测定。从1 :10稀释度开始以 100 μ I DMEM(1 % FCS)体积一式二份制备每种血清样品的系列2倍稀释液。向每孔稀释血 清中加入等体积（1〇〇μ1)的含有l〇〇CCID 5(lEV71的在DMEM(1%FCS)中的病毒工作原种并 在37°C保温2小时。保温后，向每孔中加入100 μ 1含有250个细胞的在DMEM(10% FCS) 中的Vero细胞悬液。小心密封96孔培养平板并在5% 0)2环境中于37°C保温。每日读取 平板共8天，以检测每孔中影响Vero细胞的CPE的存在。每个血清样品的中和抗体的效价 通过具有不显不CPE的最尚稀释度的孔而确定。
[0070] 实施例2
[0071] 肠病毒71的冷适应型温度敏感性毒株（EV71 :TLLa，EV71 :TLLaP20, EV71 : TLL β，EV71 :TLL β P20和EV71 :TLL β P40)的表型和基因型特征结果
[0072] 用于衍生冷适应型毒株的3个原始亲代EV71病毒在以10Μ0Ι病毒接种物接种及 在37. 5°C保温后3天之内导致Vero细胞的完全CPE。以相同病毒接种物，原始亲代EV71 病毒在39. 5°C保温温度5天之内导致Vero细胞中的完全CPE。但是，衍生自在37. 5°C培养 的Vero细胞中前两个代次的所有3个原始亲代EV71病毒在10M0I病毒接种物和28°C保温 温度不导致Vero细胞中的CPE。在28°C 10天培养结束时的盲传代后也未观察到CPE。在 接种的Vero细胞中病毒复制的不存在进一步通过用抗EV71的商业检测单克隆抗体经间接 免疫荧光测定在10天结束时在培养物上清液中悬浮细胞存在的染色阴性而支持。
[0073] 在相继更低保温温度中超过90代之后，所有三个传代的EV71毒株在< 5M0I的 病毒接种物接种及28°C保温温度3天内能导致Vero细胞中的完全CPE。病毒株进一步在 28°C保温温度传代直至第100代。在第100代，衍生自从患者的口腔液体、脑干组织和粪便 样本分离的原始EV71的病毒株分别命名为EV71 :TLL、EV71 :TLLa和EV71 :TLL0。在温度 敏感性测定中，所有3个冷适应型毒株在28°C保温温度用10M0I病毒接种物在2天内导致 Vero细胞中完全CPE，但是在37 °C保温温度需要4天达到完全CPE。在39. 5 °C保温温度，在 10天培养后所有3个毒株均未观察到CPE。但是，在盲传代（blind passage)进在39. 5°C 保温的Vero细胞新鲜瓶中之后，EV71 :TLL在培养的第10天给出2+CPE。EV71 :TLLa和 EV71 :TLLf3甚至在两次进一步盲传代进在39. 5°C保温的新鲜Vero细胞瓶中之后也未观察 到CPE。在各自10天培养结束时，从用EV71 :TLLa或EV71 :TLLf3接种的培养上清包括那 些衍生自盲传代的培养上清收获的悬浮细胞均未给出用EV71检测单克隆抗体的阳性免疫 荧光染色。大约1%的收获自用EV71 :TLL接种的培养上清的悬浮细胞给出阳性染色，尽管 在10天培养后未观察到CPE。
[0074] 使用28°C和37°C的保温温度测定3个冷适应型毒株的病毒复制效价，测定重复至 少4次。当滴定的培养物分别在28°C和37°C保温时，EV71 :TLL的效价分别是IXIO8CCID5q/ ml 和 2-3X107CCID5Q/ml。在 28°C保温温度，EV71 :TLLa 给出病毒效价是 lXl〇8CCID5Q/ml，在 37°C效价是 l-2X105_5-6CCID5Q/ml。在 28°C保温温度 EV71 :TLL0 效价是 2-5X108CCID5Q/ml， 在 37°C 效价是 lX107CCID5Q/ml。
[0075] EV71 :TLLa和EV71 :TLL0的冷适应型的稳定性通过将两个病毒株在28°C保温 温度和IOMOI病毒接种物在Vero细胞中20次额外传代而评估。在额外20次传代后，EV71 : TLLa在PI 2天内导致在28°C保温的细胞中的完全CPE，但是甚至在2次盲传代后在37°C 保温的细胞中不导致CPE。其保持在28°C保温温度达到病毒效价为lX108CCID5(l/ml的能力。 EV71 :TLLf3在额外20次传代后在28°C和37°C保温温度的生长动力学和病毒效价方面保 持相同冷适应型表型。EV71:TLLf3的冷适应型的稳定性通过进一步在相同培养条件下再 传代20次（从第100代起40次额外传代）而评估，发现其保持类似的冷适应型温度敏感 性表型。
[0076] 从冷适应型温度敏感性表型的逆转评估通过在各个完全CPE的在37°C保温的 Vero细胞中6次依次传代病毒而在EV71 :TLL0 P20上进行。表1示出衍生自在37°C保温 的每个相应培养物的病毒在28°C、37°C和39. 5°C保温温度的生长动力学和病毒效价方面 的生长特征。在37°C保温的细胞中3次相继传代后，病毒保持在39. 5°C保温温度在Vero细 胞中不能产生活感染性颗粒（缺乏阳性免疫荧光染色细胞）及在第6次重复传代在39. 5°C 保温温度不能导致细胞培养物中的完全CPE。
[0077]表 1
[0078] 6次相继传代在37°C保温的Vero细胞后EV71 :TLL β P20的冷适应型温度敏感性 表型逆转的评估
[0080] 每一传代病毒的生长特征和效价在28°C、37°C和39. 5°C保温温度在Vero细胞中 培养或滴定。
[0081] Pl :传代 1
[0082] IFA :间接免疫荧光测定
[0083] EV71 :TLLa和EV71 :TLL0、它们各自的额外20代之后的毒株（EV71 :TLLaP20 和EV71 :TLLf3P20)及原始亲代野生型的完整基因组被测序和分析。EV71 :TLLaP20的核 苷酸序列如SEQ ID NO :6所示。EV71 :TLL0 P20的核苷酸序列如SEQ ID NO :7所示。表2 示出EV71 :TLLa、EV71 :TLLa P20和原始亲代野生型之间其基因每个区段的核苷酸变化数 目。表3示出原始亲代野生型、EV71 :TLL0、EV71 :TLL0P2O和EV71 :TLL0P4O(额外40次 传代）之间核苷酸变化数目。衍生自通过在37°C保温温度6次相继传代而温度敏感性逆转 研宄的病毒株的完整基因组也被测序，相对于EV71 :TLL β P20的核苷酸变化数目示于表4。
[0084] 表 2
[0085] 与其原始亲代野生型病毒的完整基因组相比在EV71 :TLLa和EV71 :TLLa Ρ20的 每个基因组区段中发生的核苷酸（NT)和相应氨基酸（AA)突变的数目
[0087] 表 3
[0088] 与其原始亲代野生型病毒的基因组相比在EV71 :TLL0、EV71 :TLL0 P20和EV71 : TLLβΡ40的每个基因组区段中发生的核苷酸（NT)和相应氨基酸（AA)突变的数目
[0089]
[0092] 实施例3
[0093] 人类肠病毒71的冷适应型温度敏感株（EV71 :TLLf3 P20)的猴研宄结果
[0094] 临床发现：每天早晚两次进行研宄的猴子的临床状态的一般观察和体温测量。所 有猴子被记录为活动的并且正常喂食。没有猴子产生任何敏感的局灶性神经学缺陷如肢体 无力、震颤或运动异常。只有被给予lX10 8CCID5(l/ml静脉内剂量的一只猴子（2247M)在接 种后第3天产生低烧（39. 3°C )。在深度麻醉下处死猴子时重新称重无一猴子体重减轻。
[0095] 尸体解剖及组织学发现：尸体解剖时所有猴子均未观察到大体死后损害。在收集 用于组织病理学检查的所有猴组织中未发现异常组织学发现。
[0096] 病毒学研宄：使用在28°C和37°C保温温度的Vero细胞在猴子血清、PBMC、粪便样 品和所有尸体解剖组织上进行病毒分离。尽管在培养10天后盲传代，从任何猴子样品均 未分离出病毒。对于血清、PBMC样品和经RT-PCR测试EV71阳性的那些组织匀浆在Vero 细胞中进行一次额外盲传代。尽管未分离到病毒，经间接免疫荧光测定（图la)用商业单 克隆抗体在衍生自PI第4天收集的两只猴子2891F(接受1X10 7CCID5QEV71 :TLLf3P20)和 2890M(接受1X108CCID5QEV71 :TLL0 P20)的肝素化血液的几个PBMC中检测到EV71抗原。 在收获自PI第8天采集的猴子的肝素化血液的PBMC中未检测到病毒抗原。
[0097] 通过RT-PCR在PI第4天和第8天收集的所有猴子的血清样品中检测到EV71特 异性基因组序列。在非神经元组织中，EV71基因组序列仅在2只猴子（2202F和2891F)的 脾匀浆中检测到（图Ib)。在任何神经元组织匀浆中均未检测到EV71基因组序列。提取和 完整测序存在于在PI第4天和第8天收集的两只猴子（2889M和2890M)的血清样品中的 EV71 :TLL0P2O基因组。表5示出与EV71 :TLL0P2O的基因组相比在血清中存在的病毒株 的每个基因组区段中发生的核苷酸（NT)和相应氨基酸（AA)突变或逆转数目。
[0098] 表5 :与EV71 :TLLf3 P20的完整基因组相比在PI第4天和第8天收集的两只猴 (2889M和2890M)的血清样品中存在的EV71的每个基因组区段中发生的核苷酸（NT)和相 应氨基酸（AA)突变的数目
[0101] 猴体液免疫应答：使用内部制备的感染的Vero细胞作为抗原经间接免疫荧光测 定进行被给予静脉内EV71 :TLLf3P20的猴血清中的结合抗体（IgM和IgG)存在的测定。表 6示出在给予等价静脉内加强剂量之前在PI第14天及在PI第30天（加强后16天）收集 的两只剩余猴子（2889M和2890M)的血液中存在的抗EV71IgM和IgG的效价。
[0102] 表6 :用内部制备的感染的Vero细胞作为抗原通过间接免疫焚光测定确定的给予 静脉内EV71 :TLLf3P20之后的猴的结合抗体（IgM和IgG)效价
[0104] 用微中和测定确定在PI第14天和第30天收集的两只猴子（2889M和2890M)的 血清样品中抗EV71基因型A(BrCr)、B3、B4、B5、Cl和C5的中和抗体效价。表7示出抗每 种EV71基因型的猴血清的中和抗体的各自效价。
[0105] 表7 :通过微中和测定确定的在给予静脉内EV71 :TLLf3P20之后在两只猴血清中 存在的抗一些EV71基因型（A，B3, B4, B5, Cl和C5)的中和抗体的效价
[0106]
[0107] 实施例4
[0108] 用于开发人类柯萨奇病毒A16的冷适应型温度敏感株的材料和方法
[0109] 材料和方法：通过在补加10%胎牛血清（FCS)的Dulbecco改良Eagles培养基 (DMEM)中定期传代而维持的Vero细胞（ATCC CCL-81)用于柯萨奇病毒A16的病毒培养、减 毒、滴定和评估温度敏感性表型。用于减毒过程的亲本野生型柯萨奇病毒A16(CA16)衍生 自具有手足口病（HFMD)的患者的口腔分泌物。根据先前描述的技术进行一次病毒噬斑纯 化。噬斑纯化之后，在Vero细胞中在37°C传代两次后制备命名为相应亲本野生型毒株的病 毒原种。所有病毒原种和相应传代毒株均保存在_80°C冰箱中。
[0110] 使用在含有1% FCS的DMEM中的幼龄新鲜铺满的单层Vero细胞使原始野生型 CA16适应在相继更低的保温温度中复制，从最初的低保温温度34°C开始。在完全细胞病变 效应（CPE)后将病毒传代到每个相继的新Vero细胞培养瓶中。病毒在变化为相继更低保 温温度时以20的较高感染复数（MOI)传代，在注意到其能够在接种后3天内导致完全CPE 后，再传代至少3个代次后，降低到5-10的较低MOI。在注意到其能够在5-10M0I接种后3 天内导致完全CPE，在再传代至少3次后，进行到下一个相继较低保温温度。每一相继传代 的培养物上清储存在-80°C冰箱中用于稍后分析。
[0111] 病毒滴定：根据世界卫生组织的Polio Laboratory Manual 2004所述方法稍作修 改通过在Vero细胞中的微滴定测定确定病毒效价，根据Reed&Munch (1938)的方法，病毒效 价计算为每毫升50%细胞培养物感染剂量（CCID5tl)。简言之，在用等体积氯仿处理分散病 毒聚集物之后，在含有1% FCS的DMEM中制备澄清病毒上清的10倍系列稀释液。在96孔 平底组织培养平板中的Vero细胞单层（IO4个细胞/孔）用100 μ 1系列稀释的每种病毒 原种接种，并且在5% CO2环境中在每种相应的保温温度保温5天，之后观察CPE的存在。
[0112] 温度敏感性测定：使用两种方法评估冷适应型病毒株在Vero细胞中在28°C、37°C 和39. 5°C的保温温度的生长特性。第一种方法评估病毒株在感染细胞中导致完全CPE所需 的天数（复制动力学），第二种方法评估病毒株在每种具体测试的温度下保温的细胞中的 效价。简言之，在第一种方法中，3个含有类似年龄的铺满的单层Vero细胞的T-25组织培 养瓶的生长培养基用维持培养基（具有1% FCS的DMEM)置