粪菌胶囊及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于粪菌移植技术领域，尤其涉及一种粪菌胶囊及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 粪菌移植（FMT)，也称为粪菌治疗或肠微生菌移植，是将健康人粪便中的功能菌 群，移植到患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的诊疗。 目前，粪菌移植已被视为一种特殊的器官移植，用于治疗难辨梭状芽胞杆菌感染、炎症性肠 病、肠易激综合征、代谢综合征、神经发育不良与神经退行性疾病、自身免疫性肠病、肠道食 物过敏等。粪菌移植在中国应用至少有1700年的历史，中国传统医学一直有用人大小便给 人治病的记载。公元300~400年间，东晋时期，葛洪《肘后备急方》（也称《肘后方》）即 有记载，用人粪清治疗食物中毒、腹泻、发热并濒临死亡的患者。书中描述"饮粪汁一升，即 活"，可见具有"起死回生"之奇效，但是该治疗方式却被中国的现代临床忽略了。现代医学 史上，最早的粪菌移植报道于1958年，美国外科医生BenEiseman等报道了他们对患有严重 伪膜性肠炎的4名患者实施粪便移植的结果。当时，伪膜性肠炎的死亡率为75%，抗生素相 关性腹泻的主要原因被认为是金黄色葡萄球菌感染。Eiseman等对这4名患者采用抗生素、 氢化可的松、益生菌等治疗，患者仍腹泻严重，并出现休克。无奈之下，医生、患者及其家属 商议，决定用患者健康家属的大便制成粪水，对患者进行灌肠。结果，其中3名垂危的患者 都在几天之内奇迹般的康复出院了，另1名患者在住院期间死于与肠道感染无关的其他疾 病。Bowden将此临床经验发表在《外科学》杂志。然而，在之后的20年里，几乎没引起人重 视。直至1981年，Bowden等报道用经小肠置管输入粪液的方法，成功治愈16例伪膜性肠 炎患者。现代粪菌移植技术主要是器械介入的方法，比如胃镜、胃管、肠镜、空肠管等，腹泻 型IBS、溃疡性结肠炎等治疗需要多次移植，而每次粪便菌群都需要通过导管经过胃、十二 指肠，注入十二指肠远端，过程复杂，患者有一定痛苦，应用受到限制。制备的粪菌样本在室 温存放时间短，需要立即进行移植，加入无菌甘油后虽然可以置于-80°C冰冻，但是取用不 便。
【发明内容】
[0003] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一目的在于提供一种粪菌胶囊及其制 备与应用。
[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0005] 本发明的第一方面，提供了一种粪菌胶囊的制备方法，包括如下步骤：
[0006] (1)粪菌液制备；
[0007] (2)将步骤（1)所得粪菌液加入冻干保护剂后，冷冻干燥，得粪菌冻干粉；
[0008] (3)将步骤（2)所得粪菌冻干粉装入胶囊中，得粪菌胶囊。
[0009] 优选地，步骤（1)中，粪菌液的制备方法为：
[0010] 1)初步搅拌：将供体粪便样本，加入无菌生理盐水进行初步均质处理，得到粪便 浆体；
[0011] 2)初步过滤：将步骤1)中所得粪便浆体过滤去除大颗粒物质；
[0012] 3)将步骤2)所得样本称重并在匀浆器中进一步匀质处理；
[0013] 4)将步骤3)所得样本逐级过滤或多次过滤；
[0014] 5)离心、悬浮：将步骤4)所得样本离心，将所得沉淀再悬浮于无菌生理盐水中，得 粪菌液。
[0015] 优选地，步骤1)中，粪便样本采用2h内的新鲜粪便样本。
[0016] 优选地，步骤1)中，100~150g粪便样本加入250ml无菌生理盐水进行初步均质 加工。更优选，120g粪便样本加入250ml无菌生理盐水进行初步均质加工。
[0017] 优选地，步骤2)中，采用不锈钢滤网过滤。
[0018] 优选地，步骤3)中，在氮气生物工程厨内进行称重和进一步匀质处理。
[0019] 优选地，步骤4)中，逐级过滤是指依次经过直径2. 0mm、I. 0mm、0. 4mm和0.1 mm的 滤网。多次过滤是指经过直径0.25mm的滤网2~3次。步骤4)的作用是去除未吸收的食 物残渣和小颗粒物质。
[0020] 为了更好地保护粪菌中的益生菌，提高细菌冻干存活率，本发明对冻干保护剂进 行了优化。
[0021] 优选的，步骤（2)中，所述冻干保护剂为复合冻干保护剂，所述冻干保护剂各组分 的质量体积浓度为：谷氨酸〇. 5~2. 0% ;脱脂乳6. 0~8. 0% ;甘露醇2. 0~3. 0% ;果糖 8. 0 ~10. 0% ;维生素 C 0· 2 ~0· 4%。
[0022] 质量体积浓度的单位为g/100ml。
[0023] 更优选的，所述冻干保护剂各组分的质量体积浓度为：谷氨酸1.0% ;脱脂乳 7.0% ;甘露醇2.5% ;果糖9.0% ;维生素 C 0.3%。
[0024] 所述冻干保护剂的溶剂为无菌生理盐水。
[0025] 所述冻干保护剂无药理活性，可在冻干和保存时维持粪便菌群的稳定性。并非任 意一种冻干保护剂对于粪便菌群都具有好的保护效果，而本发明的特殊冻干保护剂使得粪 菌中的6种菌群"双歧杆菌"、"乳酸菌"、"拟杆菌"、"肠球菌"、"肠杆菌"、"小梭菌"的冻干存 活率均超过90. 00%。
[0026] 为了进一步保护粪菌中的益生菌，本发明还对冻干方法进行了考察和优化。
[0027] 优选的，步骤（2)中，所述冷冻干燥包括如下步骤：
[0028] 1)预冻：通过"两步法"从25°C降至_80°C:第1步以1~2°C /min的速率进行降 温；第2步是以3~5°C /min的速率进行降温；总预冻时间为12~24h ;
[0029] 2)真空干燥：以真空度8~12pa，温度-40~-60°C，真空干燥24~48h。
[0030] 上述冷冻干燥方法，比常规一步预冻后真空干燥，能够更好地保护粪菌中各种重 要菌群的细胞结构。
[0031] 优选的，步骤（3)中，所述胶囊采用肠溶胶囊。
[0032] 更优选，DRcap耐酸型HPMC胶囊。所述DRcap耐酸型HPMC胶囊能够很好地保护 粪菌中各种益生菌。
[0033] 本发明的第二方面，提供了一种由前述方法制备获得的粪菌胶囊。
[0034] 本发明的第三方面，提供了前述粪菌胶囊制备方法或粪菌胶囊在粪菌移植中的用 途。
[0035] 本发明的第四方面，提供了前述粪菌胶囊制备方法或粪菌胶囊在制备炎症性肠病 (IBD)治疗药物中的用途。
[0036] 优选的，所述炎症性肠病溃疡性结肠炎（UC)或克罗恩病（CD)。
[0037] 本发明的有益效果为：
[0038] 1、菌群较为集中，可放于低温长久保存；
[0039] 2、便于菌群移植的实施，不需要侵入性的实施方式：如胃镜、肠镜、鼻空肠营养管 等；
[0040] 3、对于虚弱的患者，增加了安全性。
[0041] 4、本发明特殊冻干保护剂的使用对于粪便菌群都具有好的保护效果。冷冻干燥方 法，比常规一步预冻后真空干燥，能够更好地保护粪菌中各种重要菌群的细胞结构。二者的 配合，有效得提高了粪菌菌群的冻干存活率。
【附图说明】
[0042] 图1:胶囊耐酸曲线图。
[0043] 图2 :胶囊在胃肠部位的释放示意图。
[0044] 图3 :腹痛程度评分表。
[0045] 图4 :布里斯托大便分类法。
[0046] 图5 :对"粪菌胶囊"治疗后第1天、第2天、第3天，IBD患者血清学炎性指标进 行了观察，效果较为理想的患者其血中的炎症指标CRP于移植后第一天即出现了明显的下 降，下降幅度较大，此后3天，呈现一个持续下降状态，但下降幅度较第一天减少。而对于暂 时效果不明确的患者，其相关炎性指标也表现出下降趋势，但其下降趋势波动较大，CRP变 化趋势不明显。
[0047] 图6 :对"粪菌胶囊"治疗后第1天、第2天、第3天，IBD患者血清学炎性指标进行 了观察，效果较为理想的患者其血中的炎症指标IL-6于移植后第一天即出现了明显的下 降，下降幅度较大，此后3天，呈现一个持续下降状态，但下降幅度较第一天减少。而对于暂 时效果不明确的患者，其相关炎性指标也表现出下降趋势，但其下降