r>[0055] (实施例 2_3)
[0056] 在羟磷灰石（HA)上的生物膜形成
[0057] HA盘使用将牛的牙齿以表面被牙釉质被覆的方式成形为7_X7_X1. 5_的形 状而得的产物。将HA盘用高压釜灭菌后，用PBS在室温下平衡1小时，将400 y 1无菌采集 的人唾液在室温下静置1小时而形成菌膜，用PBS清洗后用5mg/ml的BSA溶液在室温下封 闭30分钟而得的产物用于试验。
[0058] 生物膜形成用24孔微量滴定板进行。向各孔中添加400 y 1的0. 5%蔗糖添加 2XTSB培养基、200 y 1试验样品、80 y 1的125mM 丁酸、80 y 1供试菌悬浮液、40 y 1的PBS， 将HA盘置于各孔，按照实施例2-1进行了培养。
[0059] (实施例 2_4)
[0060] HA上的生物膜形成量的定量
[0061] 按照实施例2-3进行了培养后，将HA盘用镊子取出，用PBS浸渍一次后清洗。清 洗后的HA盘放入新的孔中，添加600 y 1番红溶液，静置15分钟而对生物膜染色。将HA用 镊子取出，用去离子蒸馏水清洗后置于新的孔中添加600 y 1的70%乙醇，振荡30分钟而溶 出番红，将300 y 1该溶出液移至96孔微量滴定板并按照实施例2-2对生物膜量进行了定 量。
[0062] 在通过上述实施例形成了菌膜的羟磷灰石上，对日本芜菁冷水提取物的生物膜形 成抑制活性进行评价而得的结果示于图3。日本芜菁冷水提取物在羟磷灰石上也与96孔上 同样显示内氏放线菌生物膜形成抑制活性。
[0063] (实施例3)
[0064] 放线菌临床分离株的分离
[0065] (实施例 3-1)
[0066] PCR/ 多重 PCR
[0067] PCR 通过向 PCR 管中添加 lOXEx Taq 缓冲液 2. 5 y 1、DNA 模板 1 y l、dNTP2 y 1、引 物各0.025 4 1、￡1七39〇.125 111、]\%(：122 111、1120 16.88 111而进行。多重？0?通过将上 述的组成改为50 yM正向引物3个、反向引物3个各0.1 yl、H20 16. 75 yl而进行。反应 条件为在95°C热处理10分钟后进行30个循环的95°C ? 30秒、50°C ? 30秒、72°C ? 30秒， 最后在72°C用7分钟完成延伸反应。多重PCR以53°C的退火温度进行。
[0068] (实施例 3-2)
[0069] 临床分离株的分离
[0070] 从任意选择的健康男女7人（男：3人，女：4人）采集牙菌斑，用放线菌选择培养 基（CFAT琼脂培养基）培养，对形成的菌落革兰氏染色后，通过显微镜观察筛选革兰氏阳性 杆菌。
[0071] 从各革兰氏阳性杆菌用基因组提取试剂盒（西格玛）提取基因组，按照实施例3-1 进行PCR，扩增16SrRNA基因的上游的约500bp。用于PCR的引物序列示于表1。
[0072] PCR产物用PCR Clean-Up试剂盒（普洛麦格）纯化，碱基序列分析对外委托微基 因日本株式会社（（株）Y夕口 9工> 9々Ay社）进行。对获得的16SrRNA基因的碱基序 列进行与GenBank上的数据库的同源性检索而鉴定菌。对于上述中鉴定为放线菌属的菌， 将atpA按照实施例3-1用多重PCR扩增，碱基序列分析同样对外委托微基因日本株式会社 进行。使用的引物序列示于表1。将获得的碱基序列与数据库上的atpA的碱基序列一起 进行系统分析，从而进行种的鉴定，将获得的内氏放线菌、口腔放线菌作为放线菌临床分离 株。
[0073] [表 1]
[0074] 表1引物序列
[0075]
[0076] 通过上述实施例，从人口腔内进行临床分离株的分离，结果从7人成功分离共计9 株放线菌临床分离株（内氏放线菌：4株，口腔放线菌：5株）。进一步对分离得到的放线 菌临床分离株中的7株评价了日本芜菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性，结果生物膜形 成量根据菌株而不同，但是日本芜菁冷水提取物对全部的临床分离株显示生物膜抑制活性 (图5)。结合图3的结果，提示日本芜菁冷水提取物在人口腔内也显示生物膜形成抑制活 性的可能性高。
[0077](实施例4)
[0078] 使用流动池的日本芜菁冷水提取物的生物膜抑制评价
[0079] 上述的实施例中，使用96孔板的采用静止体系的评价中，显示日本芜菁冷水提取 物具有内氏放线菌生物膜抑制活性。然而，若考虑实际的口腔内，唾液不断分泌，口腔内存 在唾液的流动。于是，为了对日本芜菁冷水提取物在口腔内是否也显示内氏放线菌的生物 膜抑制活性进行评价，使用模拟口腔环境的流动池系统，对日本芜菁冷水提取物的内氏放 线菌生物膜抑制活性进行了评价。
[0080] 评价方法
[0081] (实施例4-1)评价菌株
[0082] 使用内氏放线菌ATCC19039株。
[0083] (实施例4-2)日本芜菁提取物的制备
[0084] 购入市售的日本芜菁，通过冷冻干燥制备日本芜菁的干燥叶。相对于18细碎粉碎 的日本芜菁干燥叶用50ml去离子蒸馏水在4°C条件下进行2小时的提取。将通过抽滤和离 心除去日本芜菁残渣而得的上清冷冻干燥，回收日本芜菁冷水提取物。
[0085] (实施例4-3)使用流动池的生物膜形成试验
[0086] 将内氏放线菌用5ml的BHI培养基培养一晚，离心集菌后，用PBS进行离心清洗， 用BHI培养基调至0. D. 66_= 0. 4,将其作为供试菌液。将400 y 1供试菌液接种于流动池室 (ACCFL0001:斯托瓦尔生命科学公司（STOVALL LIFE SCIENCE社）），室的朝向设定为生物 膜形成面位于下侧后，在37°C的条件下静置3小时，使菌附着于生物膜形成面。静置后，室 的朝向设定为生物膜形成面位于上侧，通过蠕动泵使添加了 0. 25%蔗糖、60mM 丁酸的TSB 培养基以3ml/小时的流速流动的同时进行48小时的培养，形成生物膜。日本芜菁冷水提 取物的生物膜抑制活性通过将最终浓度lmg/ml的日本芜菁冷水提取物添加于上述培养基 同样地进行培养来评价。
[0087] (实施例4-4)生物膜的观察
[0088] 将所形成的生物膜用去离子蒸馏水进行清洗，用LIVE/DEAE生物膜生活力试剂盒 (英杰公司）进行Live/Dead染色后，通过共聚焦激光显微镜观察生物膜。
[0089] 通过上述的实施例在使用流动池的流动体系的条件下对日本芜菁冷水提取物的 生物膜形成抑制活性进行了评价，结果日本芜菁冷水提取物抑制了内氏放线菌的生物膜形 成（图6、7)。此外，根据采用共聚焦激光显微镜的观察，在添加日本芜菁冷水提取物的条件 下形成的生物膜中，死菌所占的比例减少（图7)。
[0090] 更具体来说，使用流动池的评价中，添加丁酸后，内氏放线菌的生物膜形成也增 加，该生物膜中活菌和死菌以同等程度存在。构成生物膜的死菌的比例比未添加丁酸的情 况高。在lmg/ml的日本芜菁冷水提取物的存在下，内氏放线菌的生物膜形成量被抑制，特 别是死菌的附着量减少。因此，确认日本芜菁冷水提取物抑制依存于丁酸的内氏放线菌的 生物膜形成。
[0091] (实施例5)
[0092] 日本芜菁冷水提取物的分离
[0093] (实施例 5-1)
[0094] 透析
[0095] 将日本芜菁冷水提取物溶解于去离子蒸馏水，以13000Xg、10分钟离心而回收上 清，加入分离分子量10kDa的透析用纤维素管（亚速旺株式会社（7久' 7 > ))中，对于去离 子蒸馏水在低温室内进行2天的透析。将透析内液和透析外液的一部分冷冻干燥并回收。 [0096] 为了如上所述对日本芜菁冷水提取物的分子量进行推定，通过分离分子量10kDa 的透析用纤维素管透析日本芜菁冷水提取物，对透析内液和外液的生物膜形成抑制活性进 行了评价，结果透析内液的活性更高。提示活性成分的分子量在l〇kDa以上（图8)。
[0097] (实施例 5-2)
[0098] 日本芜菁冷水提取物的透析内液的阴离子交换层析
[0099] 将样品溶解于10mM磷酸钾缓冲液（pH7. 4)，将离心分离后的上清上样至 DEAE-TOYOPEARL 650M( iH. 6X70cm)。用同一缓冲液清洗后，通过0~0? 5M的NaCl线性 梯度洗脱，各部分分别分取5ml。全部的操作以lml/分钟的流速进行。
[0100] 将日本芜菁冷水提取物的透析内液通过阴离子交换层析分离，对依存于哪个成分 的洗脱而显示活性进行了评价（图9)。其结果是，在蛋白质的第1峰至第2峰的范围内，依 存于蛋白质的洗脱图案而显示了活性。由此提示活性成分可能是蛋白质。
[0101] (实施例 5_3)
[0102] 硫酸铵分离
[0103] 将按照实施例5-1制备的日本芜菁冷水提取物的透析内液样品溶解于PBS，将硫 酸铵的浓度按30 %、45 %、60 %、75 %逐级提高，将各浓度下的沉