口腔用组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对于引发口腔疾病的口腔生物膜的牙周病改善效果良好的口腔用组 合物。
【背景技术】
[0002] 牙周病是出现在牙周组织的疾病的总称，狭义上指牙龈炎、牙周炎和咬合性外伤 之类的疾病。牙周病是主要由牙菌斑引起的口腔内感染症。人的口腔内存在700种以上的细 菌，在健康的口腔内，牙齿表面附着有链球菌（Streptococcus)属和放线菌（Actinomyces) 属等初期附着菌。其中的内氏放线菌（Actinomyces naeslundii)被认为是出血性牙銀 炎致病菌，初期附着的内氏放线菌形成生物膜而生成牙菌斑，从而使牙龈发生炎症。有报 道称，放线菌导致的牙龈的炎症是通过菌体膜上的核蛋白介以牙龈上皮细胞和巨噬细胞 的TLR2产生IL-8和TNF-a而导致的。如果牙龈发生炎症，则形成牙周袋，并伴随出血和 銀沟渗出液的渗出，形成作为牙周病病原性细菌已知的牙銀卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis)和伴放线放线杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、齿垢密螺旋 体（Treponema denticola)等在牙周袋生存的环境。此外，内氏放线菌不仅附着于牙齿表 面，而且与大量的口腔内细菌共凝集，从而成为牙周病病原性细菌向牙菌斑附着的基础。由 于这些原因，内氏放线菌使初期牙菌斑转变为后期牙菌斑（牙周病生物膜），因此近年来作 为与牙周病发生相关的重要的细菌引发关注。
[0003] 以往的牙周病预防中，杀灭牙龈卟啉单胞菌等牙周病病原性细菌来抑制牙周病是 主流的想法，但牙周病病原性细菌与生物膜一起存在于牙周袋的深处，因此抗菌物质不易 渗透，大多无法获得预期的效果。
[0004] 为了改善这一点，专利文献1中揭示了通过将（A)N-酰基肌氨酸或其盐和（B)异 硫氰酸苄酯混合且使（AV(B)的质量比为0.5~20,显示口腔生物膜抗菌效果和牙龈炎改 善效果。然而，专利文献1中，耐药菌出现的危险性依然很高。
[0005] 牙周病因发生牙銀炎而加重，因此可通过预防牙銀炎而更有效地预防牙周病。因 此，抑制内氏放线菌的生物膜形成的原材料可期待有效的牙周病预防效果。
[0006] 本发明人等确认了内氏放线菌的生物膜形成因酸压力而被促进，日本芜菁和小松 菜等5种十字花科植物和冰叶日中花的提取物具有使内氏放线菌的酸诱导性生物膜形成 量下降50~90%的活性（专利文献2)。
[0007] 本申请中，将确认了生物膜形成抑制活性的植物提取物中活性最高且容易获得的 日本宪菁（日本宪菁，Brassica rapa var.nipposinica)作为候选原材料，进行了详细的 活性评价并对其活性成分的性状确定进行了详细研宄。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1:日本专利特开2008-174542号公报
[0011] 专利文献2:日本专利特开2013-056855号公报
[0012] 发明的概要
[0013] 发明所要解决的技术问题
[0014] 牙周病病原性细菌与生物膜一起存在于牙周袋的深处，一直以来使用以某种牙周 病病原性细菌为靶细菌的抗菌剂的牙周病抑制法中，口腔生物膜阻碍抗菌剂的渗透，难以 发挥所设想的牙周病抑制效果。此外，出现抗药菌的危险性高，抗菌剂的使用不理想。因此， 与采用抗菌剂的牙周病病原性细菌的控制相比，进行初期牙周病病原性细菌的生物膜形成 的控制被认为是更安全且有效的牙周病预防法。
[0015] 解决技术问题所采用的技术方案
[0016] 本发明人等进行了认真研宄，发现日本芜菁的提取物对由酸诱导的内氏放线菌的 生物膜形成具有抑制效果。提取温度越低，该抑制效果越高。对日本芜菁的活性成分进行 了分离，推测活性成分为分子量10kDa以上的成分，发现活性部分中所含的成分的80%以 上为蛋白质，从而完成了本发明。日本芜菁提取物对内氏放线菌的增殖不产生影响，因此被 认为作用机理与抗菌作用不同。
[0017] 内氏放线菌是从牙龈炎和根面龋部位被发现的革兰氏阳性杆菌，被认为是初期的 牙周病病原性细菌。由于与链球菌和牙周病病原性细菌共凝集，因此是向牙周病菌斑的菌 群迀移的关键细菌，认为内氏放线菌的控制可用于牙周病预防。本发明人等的研宄中，确认 生物膜形成因牙周病病原性细菌产生的丁酸等酸而增加。
[0018] 发明的效果
[0019] 本发明的包含日本芜菁提取物的口腔用组合物显著地抑制初期牙周病病原性细 菌的生物膜形成，所以可用作比抗菌剂更安全且有效的牙周病预防法。
[0020] 附图的简单说明
[0021] 图1为基于提取温度的不同的生物膜形成抑制活性的比较。
[0022] 图2为基于提取温度的不同的生物膜形成抑制活性的比较。
[0023] 图3为日本芜菁冷水提取物的在羟磷灰石上的生物膜形成抑制活性。
[0024] 图4A为口腔内临床分尚株的系统分析。
[0025] 图4B为口腔内临床分尚株的系统分析。
[0026] 图5为日本芜菁冷水提取物对临床分离株的生物膜形成抑制活性。
[0027] 图6为流动池中的日本芜菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性。
[0028] 图7为采用共聚焦激光显微镜的生物膜观察图。
[0029] 图8为日本芜菁冷水提取物、日本芜菁冷水提取物的采用透析处理的透析内液、 透析外液的生物膜形成抑制活性的比较。
[0030] 图9为日本芜菁冷水提取物透析内液的阴离子交换层析的结果。
[0031] 图10为日本芜菁冷水提取物透析内液的硫酸铵分离部分的生物膜形成抑制活 性。
[0032] 图11为日本芜菁冷水提取物透析内液的硫酸铵分离物的阴离子交换层析的结 果。
[0033] 图12为掺入日本芜菁冷水提取物的口香糖的生物膜形成抑制活性。
[0034] 实施发明的方式
[0035] 本申请的发明涉及包含日本芜菁提取物的口腔用组合物。
[0036]另外，本申请的发明涉及所述日本芜菁提取物为冷水提取物的口腔用组合物。 [0037] 此外，本申请的发明涉及包含日本芜菁提取物的牙周病生物膜形成抑制剂。
[0038]另外，本申请的发明涉及所述日本芜菁提取物为冷水提取物的酸诱导生物膜形成 抑制剂。
[0039] 此外，本申请的发明涉及由上述口腔用组合物形成的漱口剂、牙膏剂、吸入剂、含 片剂和食品。
[0040] 以下，通过实施例对本发明进行具体说明。本申请的发明并不局限于这些实施例。 实施例
[0041](实施例1)
[0042] 日本芜菁提取物的制备方法：
[0043] 购入市售的日本芜菁（茨城县产），冷冻干燥，从而制备日本芜菁干燥叶。将日 本芜菁干燥叶细碎粉碎，以lg该粉碎的日本芜菁干燥叶对应50ml去离子蒸馏水的比例在 70°C、室温和4°C下进行2小时的提取。抽滤所得的提取液，以13000Xg ? 10分钟离心，将 其上清冷冻干燥后的产物作为日本芜菁提取物供于试验。
[0044] (实施例2)
[0045] 生物膜形成试验
[0046] (实施例 2_1)
[0047] 使用96孔微量滴定板的生物膜形成
[0048] 将内氏放线菌ATCC19039或放线菌临床分离株用5ml的脑心浸液（BHI)液体培养 基在37°C的厌氧条件下培养一晚至稳定期，以llOOXg ? 10分钟离心而集菌。以同样的条 件用PBS离心清洗3次，将用PBS调至0. D. 66tol= 0. 3的产物作为供试菌悬浮液供于试验 体系。
[0049] 生物膜形成用96孔微量滴定板进行。向各孔中添加100 y 1的0. 5%蔗糖添加2X 胰酪胨大豆肉汤（TSB)培养基、50 y 1试验样品、20 y 1的125mM丁酸、20 y 1供试菌悬浮液、 10 y 1的PBS，以37°C、5% C02的条件下进行16~20小时的培养。
[0050] (实施例 2-2)
[0051] 96孔微量滴定板上的生物膜形成量的定量
[0052] 将按照实施例2-1培养而得的培养上清倾析，用200 y 1的PBS清洗各孔后添加 100 y 1的0. 25%番红溶液（日水制药株式会社），静置15分钟而对生物膜染色。将番红溶 液倾析后用去离子蒸馏水清洗2次，干燥后添加100 y 1的70%乙醇，振荡30分钟而溶出番 红，用酶标仪测定492nm的吸光度，对生物膜量进行定量。
[0053] 通过上述的实施例，对从日本芜菁以70°C、室温、4°C的各条件下提取而得的各日 本芜菁提取物的单位重量的比活性进行了评价，结果在4°C的条件下提取而得的冷水提取 物的比活性最高（图1和图2)。此外，日本芜菁冷水提取物对内氏放线菌的增殖未显示影 响。
[0054] 因此，以日本芜菁冷水提取物作为放线菌生物膜抑制原材料的候选材料，对在人 口腔内是否有显示活性的可能性进行进一步的研宄。