包含非天然吸湿性氨基酸的皮肤组合物的制作方法

包含非天然吸湿性氨基酸的皮肤组合物的制作方法
【专利说明】包含非天然吸湿性氨基酸的皮肤组合物
[0001] 本申请涉及适于增强皮肤的水化和增湿的物质和组合物。
[0002] 干燥病（Xerosis)，或干性皮肤，是大部分人在其一生中的某个点经历的常见病 症。季节性的干燥病在寒冷干燥的冬季月份中常见，并且证据表明干燥病随年龄变得更流 行（Whit-Chu, 2011)。多种炎性皮肤病症，如特应性皮炎（atopic dermatitis)、刺激性接 触性皮炎（irritant contact dermatitis)和银肩病（psoriasis)，引起局部面积的干燥性 皮肤。另外，一些患者具有遗传性病症，如鱼鳞病（ichthyosis)，导致慢性干性皮肤。
[0003] 天然保湿因子（NMF)的重要作用是维持充分的皮肤水化。角质层的充分水化起到 三个主要作用：（1)其保持皮肤的可塑性，防止其受损伤；(2)其允许水解酶在脱皮过程中 起作用（Rawlings, 1994)，以及（3)其有助于最适宜的角质层屏障功能。
[0004] NMF主要由游离氨基酸和这些氨基酸的多种衍生物组成，所述衍生物如羧酸吡咯 烷酮钠（焦谷氨酸盐，2-氧代-吡咯烷酮羧酸，或PCA)，尿刊酸（天然的紫外[UV]光吸收 剂），无机盐，糖，和乳酸以及脲（表2) (Clar，1981)。目前与NMF相关的无机盐包括氯化 物、磷酸盐以及钠、钾、钙和镁的柠檬酸盐。NMF包装在角质细胞（corneocytes)中，占角质 细胞质的约10%和角质层干重的20%至30%。
[0005] NMF成分是高度有效的湿润剂，其吸收并结合来自大气或来自较深皮肤层的水分， 将水分汲取到角质细胞中。这一过程甚至可以在相对湿度低至50%时发生，允许角质细胞 在低湿度环境中保持充足的水分水平。水分的吸收是如此有效的，以致NMF基本上溶解在 其所吸收的水中（Rawlings,1994)。水化的NMF，特别是中性和碱性的氨基酸，形成与角蛋 白纤维的离子相互作用，减少纤维之间的分子间力，并且由此增加角质层的弹性。这种弹性 起作用使得皮肤看起来健康柔软，并且有助于防止由机械应力引起的开裂或剥落。另外， NMF允许角质细胞平衡由围绕其的细胞内"水泥（cement) "施加的渗透压。
[0006] 保持溶质浓度平衡对于防止大量水分注入（如在长时间洗浴后在发皱的皮肤中 观察到的）和水分流出（其将引起角质细胞收缩）二者。
[0007] 传统上，认为角质层不是活的组织。尽管这在技术上是真实的，但角质层是一种动 态结构，其中多种酶仍然起作用，并且这些酶需要特定量的游离的或液态的水来发挥作用。 结合NMF的水提供大量的这种必需水，并且这些酶中的多种参与脱皮过程，破坏在皮肤的 大部分表层中将角质细胞保持在一起的多种键和力。研宄表明这些脱皮酶的活性受组织内 水分水平的影响（Harding, 2000)。
[0008] NMF减少或缺少NMF已经与多种角质层异常相关，所述角质层异常在临床上表现 为具有起皮、剥落或者甚至皲裂和开裂的干性皮肤区域。这些病症包括特应性皮炎、银肩 病、寻常性鱼鳞病（ichthyosis vulgaris)和干燥病。在特应性皮炎中，已经证明皮肤中 NMF的量通常减少（Palmer, 2006)，而在银肩病皮肤和鱼鳞病（ichthyosis)中，NMF基本上 不存在（Harding，2000)。在更常见的皮肤病症，如干燥病中，也观察到减少的NMF水平。已 经表明常规的肥皂清洗皮肤从角质层的表层去除NMF。事实上，最外层典型地表现出减少 的NMF水平，这主要是由于洗浴或暴露于UV光。另外，衰老似乎急剧减少角质层中的氨基 酸含量。研宄已表明皮肤水化与其氨基酸含量之间的显著相关性（Horri，1989)。所有这些 病症表现出异常的脱皮特征，角质细胞积聚，导致干性皮肤明显的干燥、粗糙、起皮和剥落 性质（Harding, 2000)。
[0009] NMF的来源是大量时间的深入研宄的主题。关于尿刊酸和PCA的大量研宄确定这 些化合物来源于如上文所述被假定不包含活性酶的角质层中的氨基酸。作为该研宄的结 果，现在认识到，尽管角质层在生物学上是死亡的，但是其在生物化学上非常有活性。分析 角质层的氨基酸组成最终导致这样的发现：NMF成分是由聚丝蛋白蛋白水解产生的分解产 物（Scott,1982)。
[0010] 聚丝蛋白是一种位于新形成的角质细胞中的存在于颗粒层上方的角质细胞层中 的大的富含组氨酸的蛋白。聚丝蛋白的功能是聚集纤丝，并且具体地是将表皮的和毛根内 鞘角蛋白纤丝排列成高度有序的线性阵列或粗原纤维。
[0011] 聚丝蛋白具有一种高分子量前体，即聚丝蛋白原，其源于颗粒层的透明角质颗粒。 当粒细胞分化成角质化细胞时，聚丝蛋白原去磷酸化并且降解成高碱性、低分子量的聚丝 蛋白。正是在这一阶段聚丝蛋白起作用聚集纤丝，催化角蛋白纤维之间的二硫键形成。这 些聚集的纤维形成包绕进入角质层的细胞的包膜的一部分，允许其保持角质细胞特有的极 扁平的形状（Scott, 1982)。
[0012] 一旦角蛋白纤维已经形成，聚丝蛋白经受几乎是立即的蛋白水解和降解攻击。该 降解过程中最初的步骤之一是聚丝蛋白精氨酸残基转化为瓜氨酸残基。该过程增加聚丝蛋 白分子的酸性，导致聚丝蛋白/角蛋白复合物的松懈，并且增加蛋白水解酶的接入。在这一 点上，聚丝蛋白分子完全降解成其各自的氨基酸和衍生物，这将占角质层中存在的游离氨 基酸及其衍生物的70-100% (Scott, 1982)。
[0013] 随着角质细胞向角质层的更表层移动，发生聚丝蛋白向NMF的转化。聚丝蛋白加 工的时间和在角质层中的准确深度取决于角质细胞内的水活性和外部的相对湿度。在潮湿 的环境中，当没有干燥作用时，聚丝蛋白的水解几乎在最外面的表面发生。在低湿度中，水 解在较深的层中发生，在此处，NMF的作用是防止皮肤脱水（Harding, 2000)。已经证明，敷 到皮肤上的闭合贴片可以完全防止聚丝蛋白降解。
[0014] 聚丝蛋白转化为NMF还受角质细胞内水活性的控制，并且仅在狭窄范围内发 生-如果水活性太高，聚丝蛋白是稳定的，而如果其太低，水解酶将不能作用并且降解聚丝 蛋白（Harding, 2000)。由此，皮肤的水化状态影响聚丝蛋白的降解过程。
[0015] 重要地，NMF的产生在角质细胞内产生很大的渗透压。因此，直到角质细胞已经成 熟且加强，并且向角质层的更表面层迀移时，才发生降解过程，在角质层的更表层中周围的 脂质和其他细胞外成分平衡所产生的渗透压（Harding，2000)。
[0016] 通常认为NMF包括通过对丙酮/醚处理的角质层进行30分钟水处理释放的可水 提取的物质（Jokura, 1995)。所述可水提取的物质被认为是在角质层内发现的全部的天然 保湿因子。典型地，匪？的组成大致为：氨基酸48.3%丨0410.2% ;尿酸2.1%;乳酸10.1%; 柠檬酸7. 9% ;其他有机酸2% ;尿素14%，和无机离子5. 2%。占NMF的5%的无机离子 包括钾、钠和钙。钙离子和钾离子在表皮的终末分化中是重要的，并且在屏障受扰时消失， 而镁离子加速角质层中皮肤屏障的恢复（Nakagawa，2004)。羧酸R比略烧酮钠（PCA)和乳酸 都是高度吸湿性的，并且充当有效的保湿剂，二者大约占NMF的10%。最大百分数的NMF是 占48 %的氨基酸，其中中性氨基酸占34. 5 %，酸性氨基酸占5 %，碱性氨基酸占其余的8 %。
[0017] 丝氨酸是在NMF内发现的最大的游离氨基酸，并且占NMF中发现的所有游离氨基 酸的36%。甘氨酸是第二大游离的氨基酸，占22%，接下来是丙氨酸，占NMF中游离氨基酸 的13%。组氨酸（8% )、鸟氨酸（7% )、瓜氨酸（6% )、精氨酸（6% )和脯氨酸（2% )也都 存在于NMF中。
[0018] 尽管自二十世纪六十年代以来一些皮肤研宄者就已经了解NMF在皮肤水化中的 重要性，在二十世纪八十年代确定了 NMF与聚丝蛋白加工的关系，但是，仅随着最近聚丝蛋 白功能丧失突变的鉴定才理解相关性的充分显著性。
[0019] 已经表明遗传的聚丝蛋白基因（FLG)的功能丧失突变引起中度-至-重度寻常性 鱼鳞病，并且使患者容易患特应性皮炎，包括复发的或持续到成年期的早发型特应性湿瘆 (early-onset atopic eczema)。在特应性皮炎中，已经表明PCA、尿刊酸和组氨酸的水平 与FLG基因型相关，其在携带多种FLG突变的患者中减少。已经鉴定了 FLG基因中的多个 突变；这些变体中仅有两种由约百分之九的源于欧洲的人携带，表明聚丝蛋白突变在特定 人口中的流行性。携带功能丧失的聚丝蛋白突变的患者在角质层中在所有深度都具有显著 减少的NMF水平。另外，与非携带者相比，聚丝蛋白突变的携带者表现出增加的经表皮水分 流失。
[0020] 聚丝蛋白蛋白水解异常可能响应环境因素发生。如上文所示，低湿度减弱水解酶 使聚丝蛋白分解为NMF的能力，因此产生皮肤表面干燥。另外，已经证明UV辐射减弱聚丝 蛋白向其NMF成分的天然降解。此外，皮肤中NMF水平随年龄下降，并且这种下降已经归因 于在老年人中减少的聚丝蛋白原合成和减少的屏障功能。
[0021] 如上所示，角质层中所包含的大约三分之一的水是结合水，其余的是游离水。增加 游离水的水平对角质层的弹性没有影响，并且是结合NMF的水为皮肤提供其弹性性质。已 经证明，通过外部施用含有NMF的保湿剂替代或补充皮肤中的NMF供应是成功的治疗干燥 病皮肤的方法（Weber, 2012)。
[0022] -些NMF成分已经用于增湿赋形剂（moisturising vehicles)有几十年了， 却并不知晓它们为什么具有一些作用。例如，尿素早在1943年就已经包含在保湿膏中 (Harding, 2000)。然而，直到1966年才测量正常和特应性患者的皮肤尿素水平，现在已知 该水平在患有特应性皮炎的患者和老年人皮肤中是减少的。已经表明局部施用尿素或其前 体精氨酸校正尿素的不足。乳酸盐是在1946年首先报道用在保湿剂中作为鱼鳞病的治疗。 已经表明，与不含乳酸盐的保湿剂相比，其改善并且防止干性皮肤症状的重现。L-乳酸和 D，L-乳酸似乎是通过刺激角质层中的神经酰胺合成而起作用。PCA是最常见的单一 NMF成 分，并且已经表明，由于肥皂清洗和/或年龄的原因而在皮肤的最外层中减少。已经广泛地 报道局部应用PCA减轻干性皮肤的症状（Harding, 2000)。
[0023] 在皮肤内，水可以通过被动扩散从角质层迀移到大气。水的这种正常的迀移称为 经表皮水分流失（TEWL)。这是由于对水渗透没有绝对的屏障而导致的。在健康的表皮中， 在颗粒层/角质层接界处的含水量应该约为40%，在皮肤表面含水量应该为15% -25%。 当含水量约为10%以下时，发生明显的皮肤起皮。
[0024] 实践皮肤病学（Practical Dermatology) (2012年7月，24 - 26)提到一种酪氨酸 衍生物，但没有公开该衍生物的性质，发现该衍生物当局部施用时在相对短的时间内显著 增加（build)皮肤基质的体积。没有提供进一步的限制。
[0025] 现在令人惊讶地发现非天然的吸湿性氨基酸可用于水化，并且另外地增强皮肤和 角质结构（keratinaceous structures)的水分保持和摄取性质。这些性质还使得这些氨 基酸能够充当可以与其他渗透增强剂协同作用的渗透增强剂。
[0026] 因此，在第一方面，本发明提供用于增强动物外部角质结构的水化和/或水分保 持和/或摄取性质的非天然的吸湿性氨基酸。优选的所述结构是皮肤，但是本发明的氨基 酸可以用在指甲、角、毛发和眼睛上。
[0027] 本发明还提供非天然的吸湿性氨基酸用于增强动物的外部角质结构的水化和/ 或水分保持和/或摄取性质的用途。
[0028] 本发明还提供用于增强动物的外部角质结构的水化和/或水分保持和/或水分摄 取性质的方法，所述方法包括向所述皮肤施用有效量的非天然的吸湿性氨基酸。
[0029] -个令人惊讶的发现是本发明的单个氨基酸能够增强基本上亲脂性的药物的渗 透或经皮吸收，观察到对于增加亲脂性的增加的作用。本领域常规的渗透增强剂对不能充 分渗透皮肤的那些药物表现出最大的作用。然而，本发明的氨基酸的增强作用表现为随log P增加，以致该作用不如对那些具有更加亲水的性质的药物那样大，但是随着增加的亲脂性 而增加。
[0030] 用于本文时，术语"药物"是指可以需要局部或经皮施用的任意药理学活性剂。
[0031] 因此，进一步提供非天然氨基酸作为旨在用于局部施用的药物的渗透增强剂的用 途。示例性的此类药物包括留体和保留在角质层中并且与其粘合或结合到角蛋白的其他分 子，以及log P>3的那些，但是渗透增强作用适用于所有用于局部施用的药物，优选那些较 亲水性具有更多的亲脂性的药物。
[0032] 三种优选的药物和氨基酸组合为：甲硝唑（metronidazole)和N-羟基丝氨酸； 双氯芬酸二乙胺（diclofenac diethylamine，DDEA)和N-羟基甘氨酸；以及阿昔洛韦 (acyclovir)和L-高丝氨酸。然而，通常，本发明优选的氨基酸也优选作为渗透增强剂，对 于本发明的大部分氨基酸，特别是具有至少〇. 7的0/C比的那些氨基酸，观察到有益的作 用。1以上的0/C比是有益的。
[0033] 用作渗透增强剂的优选的氨基酸包括N-羟基丝氨酸、N-羟基甘氨酸、L-高丝氨酸 和a-羟基甘氨酸。其他适当的药物如下：
[0034]
[0035]
[0036]
[0037]
[0038]
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] 尽管在下文中常提到皮肤，但是，应该理解，该术语包括对任意其他角质结构（诸 如指甲）以及其他外部膜（诸如角膜）的指代，除非上下文另外清楚指明。
[0044] 用于本文时，非天然氨基酸是这样的：其不是由待治疗的皮肤的宿主合成的，或者 不与专门的宿主tRNA相关联。此类氨基酸、特别是不是由宿主合成的那些的优点在于，它 们较少经受代谢，诸如通过天然存在的酶进行的代谢，以致它们比天然存在的氨基酸更久 地保留在皮肤中，由此可以延长任何湿润或渗透增强作用。
[0045] 术语"增湿"、"水分保留"和"水分摄取"以及相关的术语在举例说明本发明时在 本文中可互换使用，并且提及一个就包括对其他的指代，除非上下文另外清楚指明。个别来 说，所述术语具有具体的意思。术语"增湿"是一个综合性术语，并且表示导致干燥皮肤的 湿度水平的平衡或趋向平衡的过程的物质或条件。增强的"水分保持"表示减小的皮肤允 许水分逸散的倾向性，并且"水分保持"表示皮肤保留水分的倾向性。"水分摄取"是皮肤从 环境（如湿空气）吸收水分的性质。术语"水化（hydration)"包括皮肤中的水的水平以及 水摄取到皮肤中的过程，诸如水分摄取，同前所述。
[0046] 用于本文时，术语"吸湿性"表示能够在32°C从相对湿度（RH) < 50%、并且优选 40%以下的大气吸收并保持水分的氨基酸。
[0047] 对于吸湿性的化合物，其必须能够与水形成非键合的缔合（non-binding association)。硫酸镁是非常吸湿性的，并且在水的氧原子和镁原子之前形成非键合相互 作用。对什么使得化合物具有吸湿性的进一步的研宄导致在土壤样品和气溶胶上进行的工 作。在气溶胶内发现的最丰富的游离氨基酸是甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。这些也是在NMF 内发现的三种最丰富的游离氨基酸。在大气气溶胶实验中腐殖物质的吸湿性导致对所观察 到的吸湿性与腐殖质的化学结构之间的研宄（Sasaki，2007)。通过该工作，确定了具有较高 的氧/碳比（0/C)的化合物通常表现出更大的吸湿性性质（Sasaki, 2007)。例如，L-丝氨 酸具有3个氧原子和3个碳原子，以致其具有O/C = 1. 0。
[0048] 本发明的氨基酸在32°C能够潮解。优选地，本发明的氨基酸在32°C具有不大于 80%的潮解相对湿度〇)RH)。本发明优选的氨基酸具有在32°C的不大于80%的DRH和至少 0. 7 的 0/C 比。
[0049] 天然存在的氨基酸是动物中的L-氨基酸，并且要用本发明治疗的优选的动物是 哺乳动物。优选的哺乳动物是具有暴露的或无毛的皮肤（不管是完全的还是部分的）的那 些，特别优选是人。
[0050] 非天然氨基酸通常是D-氨基酸，但是在待治疗的动物中不合成的L-氨基酸可以 包括少有的L-氨基酸，如a -羟基甘氨酸和L-高丝氨酸。
[0051] 在本发明的氨基酸是新的情形下，则提供这些氨基酸作为本发明的方面和实施方 案。
[0052] 本发明的氨基酸是包含通过一个或两个并且优选一个碳原子与酰亚胺或更优选 地与胺基团连接的C00H基团的任意分子。尽管优选本发明的氨基酸处于其游离的、两性离 子形式，但是，它们还可以以溶液中的盐形式或者作为离子对提供。
[0053] 本发明的氨基酸可以以任何适当的形式施用到皮肤，所述形式诸如霜剂、洗剂、凝 胶、油膏、软膏、摩丝（mous