Br plates)/cm-1 3479(0-H), 3406(C-H), 1697(C = 0)，1614, 1439(C-H), 1393, 1228(C-0), 1191(C-0), 1083( C-0)，904, 808, 776, 719。
[0176]实施例2
[0177]实骀概沭:
[0178] 本实验是测量在32 °C在密封容器中由饱和氨基酸溶液产生的潮解相对湿度 (DRH) ;DRH越低，所测量的溶液的保水性越高。潮解相对湿度是化合物潮解的相对湿度，即 这样的相对湿度，在所述相对湿度，化合物吸收如此多的水以致其溶解在所吸收的水中。
[0179]设各:
[0180] 设备设置的示意图显示在图1中，图1显示用于测量饱和溶液的RH的实验设置。
[0181] 将装置维持在32°C。选择32°C作为外角质层的温度。由于氨基酸最终被递送至 皮肤的外层，那么，这些化合物在32°C的保水性是重要的。
[0182] 7ffe
[0183] 如上述地，通过在转动的同时将氨基酸加入到水（lmL，32°C )中来制备饱和溶液。 在添加到水中之前将总氨基酸称重，并称重剩余的氨基酸，由此可以确定所用的化合物的 质量。然后，将饱和溶液（lmL，32°C )转移到小瓶中，同样由于通过向水中加入氨基酸，部分 摩尔体积引起体积变化。
[0184] 每30分钟记录在温湿计上显示的温度和％ RH(%相对湿度），直到％ RH保持恒 定。温度证实样品所经历的温度是32°C。
[0185] 24小时的结果总结在表1中，其中S. D.是标准偏差。
[0186]表1
[0187]
[0188]
[0189] 可以看出，在这些检测中，a _羟基甘氨酸和L-高丝氨酸表现出特别有利的相对 湿度水平。更具体地，本发明的氨基酸在32°C有利地具有不超过80%的DRH。另外，还可以 看出，本发明的氨基酸具有至少〇. 7的0/C比。
[0190] 从上表中，从3次实验的平均值，24小时后水的相对湿度为100%，如预测地，其作 为对照。如预测地，L和D-丝氨酸具有相似的％ RH，原因在于它们是对映异构体。羟基甘 氨酸具有79. 7%的RH，优于丝氨酸。L-高丝氨酸在24小时具有71. 4%的RH，由此表现出 极好的潮解相对湿度ORH)测量。
[0191] 实施例3
[0192] 蛇研究
[0193] 流程
[0194] ?所有实验一式三份进行（即，三份单独的溶液，三片皮肤，每份溶液一片）。所用 的皮肤来自玉米蛇（Elaphe guttata)(美国玉米蛇）的背部
[0195] ?通过在水（lmL)中搅拌氨基酸（甘氨酸0? 1008g, L-丝氨酸0? 1395g, D-丝氨酸 0. 1400g, L-高丝氨酸0. 1582g, a -羟基-甘氨酸〇. 1213g)而制备浓度为1. 33M的各种氨 基酸的溶液。
[0196] ?将来自同一供体的顶部（背侧）的蛇皮切成~1cm2的片。将每片称重，并直接 放置在所述氨基酸溶液之一中，每个溶液一片蛇皮。
[0197] *1小时后，从所述溶液中取出蛇皮，并在滤纸上吸干。记录蛇皮的重量，之后将同 一蛇皮放回到氨基酸溶液中。
[0198] ?再过23小时后（总共24小时），再次将蛇皮在滤纸上吸干并称重。
[0199] ?然后，将现在已经吸收了测试氨基酸的蛇皮在真空干燥器中在二氧化硅（0% RH)上放置48小时，之后称重。现在所述皮肤是干燥的，并且包含测试氨基酸。
[0200] ?然后将蛇皮放置在40% RH(用饱和硝酸锌溶液控制）的干燥器中，以确定该皮 肤能够从这一湿度水平的大气吸收多少水分。
[0201] ?然后再次称重各皮肤样品。
[0202] 附图2显示同一化合物在40% RH 24小时后，相对于DRH(潮解相对湿度）的与水 相比的平均百分比重量增加。图2显示将皮肤用测试氨基酸饱和、干燥、然后暴露于40%湿 度后24小时的DRH。
[0203] 附图3显示对于每种测试氨基酸，在用1. 33M氨基酸溶液处理24小时后在40% RH 24小时后的平均百分比重量增加。
[0204] 同样地，可以看出，在这些检测中，a_羟基甘氨酸和L-高丝氨酸表现出特别有利 的性质。
[0205]流稈 B
[0206] ?通过在水（lmL)中搅拌化合物（100mg)而制备每种化合物的10% w/w浓度溶液。 分开制备每种化合物的三份独立的溶液，以使实验可以同时一式三份地进行。在使用商购 霜剂的情形中，将霜剂样品（l〇〇mg)放置在小瓶中。
[0207] ?将来自同一供体的顶部的蛇皮切成1cm2的片。将每片称重并且直接放置在所述 化合物溶液之一中。每份溶液一片蛇皮。将蛇皮直接放置在溶液的上部，以使仅有一面与 所述溶液接触。当将蛇皮放置在溶液中时，需要小心，以使所述皮肤平整地放置在溶液表面 上。
[0208] ?1小时后，将蛇从所述溶液取出并在滤纸上吸干。记录蛇皮的重量，之后将同一 蛇皮放回到同一化合物溶液中。
[0209] ?再过23小时后（总共24小时），再次将蛇皮在滤纸上吸干并称重。
[0210] ?然后将蛇皮在真空干燥器中在二氧化硅（0%相对湿度（RH))上放置48小时，之 后称重。在被放置在真空干燥器中之前，二氧化硅应该干燥24小时。
[0211] ?然后将蛇皮放置在特定RH(40 % RH是用饱和硝酸锌溶液控制的；70 % RH是用 1:1 NaCl:Na2C03饱和溶液控制的；100%RH是用水控制的）的干燥器中。每个室应该在将 蛇皮样品放置在所述室中前48小时制备，并且用湿度计检测RH。
[0212] 附图10显示对于每种测试氨基酸，在用10% w/w氨基酸溶液处理24小时后在 70% RH 24小时后的平均百分比重量增加。
[0213]实施例4
[0214] 研宄了用本发明的氨基酸制剂预处理皮肤以增强具有不同生理化学性质的三种 化合物的渗透性的效果。所述三种化合物为：
[0215] 阿昔洛韦
[0216] 甲硝挫，和
[0217]双氯芬酸二乙胺（Diclofenac diethylamine)
[0218] 方法
[0219]使用 Waters Alliance Separations Module 和 Waters 检测器，用 HPLC 分析阿昔 洛韦、甲硝唑和双氯芬酸二乙胺〇)DEA)。柱和样品的温度分别保持在45±2°C和5. 0±2°C。 使用具有保护柱（Phenomenex USA，C_184.0x 3.0mm)的 Kinetix? C_18(Phenomenex，USA) 柱（150mm x 4.6mm 5 ym粒度）作为固定相。移动相是三个部分：移动相A，水；移动相B， 甲醇；和移动相C，10mM磷酸铵缓冲液pH 2. 5。移动相使用流速为0. 8mL/min的梯度流（表 2)运行。样品运行12分钟，注入体积为10 y L。阿昔洛韦、甲硝唑和DDEA在276nm波长下 处理，大概的保留时间分别为4. 7、6. 5和8. 7min。由通过连续稀释制备的一系列标准物连 同分别制备的质量对照（quality controls)构建校准曲线。标准物和QC' s用收集流体 (磷酸缓冲盐水）稀释。记录数据并用Empower Pro3软件分析。
[0220] 表2.用于分析方法的流动梯度。
[0221]
[0222] 在去离子水中以10 % w/v制备N-羟基丝氨酸、L-高丝氨酸、N-羟基甘氨酸和N-羟 基丝氨酸、L-高丝氨酸、N-羟基甘氨酸的1:1:1比例的组合的预处理用溶液。
[0223] 通过用API饱和溶剂系统（50:50, PEG-400:水）约16小时而制备ACV、甲硝唑和 DDEA的供体溶液。在体外渗透性实验中用药前，将所述供体溶液离心。
[0224] 人表皮膜制备自整形还原手术（cosmetic reduction surgery)(腹壁成形术 (abdominoplasty))后的皮肤。将完整厚度的皮肤在环境温度下解冻直至可延展。通过钝 剥离机械去除皮下脂肪。在去除脂肪后，将皮肤在热的去离子水（60±3°C )中浸没45s。用 带手套的手指将表皮膜（包含角质层和表皮）从下面的真皮上取下，并且弃掉真皮。然后 将表皮膜漂浮（角质层侧向上）在滤纸上的去离子水中。从表面去除过量的水分，并且将 组织安装在Franz型扩散池中。每个池具有大约0. 60cm2的平均表面积和大约2. OmL的容 积。设置水浴温度以保持皮肤表面温度为32°C，以代表体内皮肤。
[0225] 进行三次实验，各API (阿昔洛韦、甲硝唑和DDEA) -次。在每个实验过程中，每个 API准备总计32个池。用电阻评估表皮膜的完整性，以确保表皮膜是完好无损的。将所述 池各自用100 U L的N-羟基丝氨酸（n = 6)、L-高丝氨酸（n = 6)、N-羟基甘氨酸（n = 6) 的10% w/v溶液和组合预处理溶液（n = 6)预处理过夜（约16h)，n = 6个池未进行预处 理。另外，还制备空白池（没有预处理）和安慰剂池（用组合预处理溶液预处理），以评估 分析测定的任何潜在的干扰。在预处理期后，从表皮膜的表面去除预处理溶液，并且将表面 干燥。将下部的接收室用接收流体（磷酸缓冲盐水）填充，并且使用预先校准的正移液器 (positive displacement pipette)给所述池施用 6mg 剂量（即 10mg/cm2)的每种 API 饱 和的供体溶液，例外的是空白池和安慰剂池。在〇, 1，2, 4, 6, 24, 30和48h时间点，从取样臂 取出接收流体的样品（200 yL)。在取出各样品后，替换以等体积的预先温育的接收流体。 使用HPLC分析样品，并且定量已经渗透的各API的水平。
[0226] 结果
[0227] 观察到，自所有已经用本发明的氨基酸预处理的池的双氯芬酸渗透显著更高（图 4和5)。在用N-羟基甘氨酸预处理表皮膜（t = 24小时）后观察到渗透的双氯芬酸的最 高量，观察到双氯芬酸渗透的最大增强是没有进行预处理的表皮膜的18. 79倍。
[0228]图4显示在48小时的实验期间双氯芬酸通过表皮膜的累积渗透。每个条棒表示 平均渗透+SEM，n = 5-6。
[0229] 图5显示48小时后双氯芬酸通过表皮膜的累积渗透。每个条棒表示平均渗透 +SEM，n = 5-6。
[0230]
[0231] 在表4中，观察到，在t = 2h时间点后，自所有已经用本发明的氨基酸预处理的池 的甲硝唑渗透显著更高（图6和7)。在用N-羟基丝氨酸预处理表皮膜（t = 30小时）后 观察到渗透的甲硝唑的最高量，观察到甲硝唑渗透性的最大增强是没有进行预处理的表皮 膜的14. 72倍。
[0232] 图6显示在48小时的实验期间甲硝唑通过表皮膜的累积渗透。每个条棒表示平 均渗透 +SEM，n = 5-6。
[0233] 图7显示48小时后甲硝唑通过表皮膜的累积渗透。每个条棒表示平均渗透+SEM， n = 5_6〇
[0234]
[0235]在表5中，在已经用本发明的氨基酸预处理的池中较早地观察到在接收流体中的 阿昔洛韦渗透（图8和9)。在用L-高丝氨酸预处理表皮膜（t = 48小时）后观察到渗透的 阿昔洛韦的最高量，观察到阿昔洛韦渗透的最大增强是没有进行预处理的表皮膜的11. 72 倍。未能计算t = 48小时之前的增强比，原因是缺少在该点之前的自未处理的皮肤的阿昔 洛韦渗透。
[0236] 图8显示在48小时的实验期间阿昔洛韦通过表皮膜的累积渗透。每个条棒表示 平均渗透+SEM，n = 5-6。
[0237] 图9显示48小时后阿昔洛韦通过表皮膜的累积渗透。每个条棒表示平均渗透 +SEM，n = 5-6。
[0238]
[0239] 总结
[0240] 用本发明的氨基酸预处理表皮膜增强药物在其上的渗透。
[0241] 取决于药物的物理化学性质，本发明的不同氨基酸具有不同的增强效果。
[0242] 药物吸收增强因子的图表显示在图11中。由该图可以清楚看出，增强随着增加的 Log P而增加。在这一点上，增强因子和Log P如下：
[0243]
[0244] 实施例5
[0245] 使用混合物和组合将水吸收到蛇皮中：
[0246] 常规制剂与基质（base)的组合
[0247] 使用实施例3所述的流程，唯一的区别在于蛇皮最终在~75% RH的溶液（使用 1:1 NaCl:Na2C03饱和溶液制备）中再水化。所有样品为10% (透明质酸除外，其中一个样 品以1%使用，并且单独测试赋形剂）。结果显示在图10中。
[0248] 从该结果可以看出，本发明的氨基酸与Oilatum的组合在其增湿能力方面是特别 有益的。
[0249] 实施例6
[0250] RHE刺激评估法1
[0251] 1.1 介绍
[0252] 本实验的目的是研宄a-羟基甘氨酸（a-H-G)和L-高丝氨酸（L-h-S)引起皮 肤刺激的潜力。本方法是基于根据0E⑶指南测试号439:体外皮肤刺激（0E⑶guideline Test No. 439: In Vitro Skin Irritation)的验证的用于 "SkinEthic 皮肤刺激测试-42 双测定（The SkinEthic Skin Irritation Test_42bis assay)" 的 SOP。所述流程提 供在第1.2节中。关于该方法的进一步的详情可见于SkinEthic? RHE SOP, Version 2.1 (2009 年 7 月),SkinEthic skin irritation test_42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals:42minutes app1ication+42hours post-incubation (用于预测化学品的急性皮肤刺激的SkinEthic皮肤刺激测试-42双测试 法：42分钟施用+42小时后温育）。可从[http://ecvam. jrc. ec. europa. eu]找到。在该 流程中，少于50%的阴性对照的组织生存力评分表明测试溶液是刺激性的。
[0253] 另外，进行另一个实验，其中测试溶液与组织的接触时间增加至24小时。在该点 后，使用MTT测定来确定组织生产力和测试溶液引起刺激的潜力。
[0254] 1. 2SkinEthic皮肤刺激测试-42双测定流程
[0255] 1. 2. 1RHE刺激测试流程
[0256] 1. 2. 1. 1. 1预温育步骤
[0257] 在收到组织时，完成下述步骤：
[0258] ⑴将6孔平板的孔填充以lmL生长培养基。
[0259] (ii)将组织从其包装中取出，清洁，以去除转运琼脂糖，并且检查损坏迹象；弃掉 损坏的组织；
[0260] (iii)将组织转移到生长培养基中，然后在37°C，5% C02温育，直到施用测试溶 液。
[0261] 1. 2. 1. 1. 2制备磷酸缓冲盐水（PBS)
[0262] ⑴将PBS片（x 5)加入到500mL容量瓶中。
[0263] (ii)将来自步骤⑴的容量瓶用去离子水（18. 2MQ)定容，并用PTFE磁力搅拌器 搅拌，直到观察到PBS片溶解。
[0264] (iii)需要时使用PBS。
[0265] 1. 2. 1. 1. 3 制备 MTT 溶液
[0266] ⑴称重3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯基四唑溴化物（MTT) (100. 0±5. Omg)到20mL容量瓶中。产生的溶液具有5mg/mL的标称MTT浓度。
[0267] (ii)将来自步骤⑴的容量瓶用PBS定容。
[0268] (iii)向来自步骤（ii)的容量瓶添加PTFE磁力搅拌器，并且搅拌溶液直到完全溶 解。
[0269] (iv)用0. 2 ym滤器将来自步骤（iii)的溶液直接过滤到无菌管中。
[0270] (v)在需要之前，该储液避光，并保存在-20 °C。
[0271] (vi)需要时，将MTT溶液解冻，并用预先温育的保持培养基稀释，以得到多至lmg/ mL的浓度。
[0272] 1. 2. 1. 1. 4制备阳性对照（5% SDS)溶液
[0273] ⑴称重十二烷基硫酸钠（SDS，100±5. Omg)到20mL容量瓶中，并且用去离子水 (18. 2MQ)定容。
[0274] (ii)将来自步骤⑴的容量瓶用离子水（18. 2MQ)定容，并用PTFE磁力搅拌器搅 拌，直到SDS完全溶解。
[0275] (iii)将溶液用无菌的0? 2 ym滤器PES滤器过滤除菌。