包含季铵盐类化合物和siRNA的组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物领域，具体涉及包含季铵盐类化合物和SiRNA的组合物。
【背景技术】
[0002] 自10多年前RNA干扰（RNA interference，RNAi)技术发现以来，RNAi已经成为 细胞遗传的关键调节器和阐明机体生长、发病机制和衰老的有力工具。siRNA与相关的蛋 白质结合成RNA。RISC通过siRNA的引导识别并降解靶基因的信使RNA(messenger RNA， mRNA)，使特定蛋白的表达受到抑制，进而特异性导致基因沉默。RNAi成功的关键在于是否 能将siRNA完整地转染入靶细胞，与靶基因 mRNA结合，其中siRNA在体内的稳定性具有重 要意义。研究表明：通过对siRNA结构进行化学修饰和对siRNA骨架进行载体修饰是提高 siRNA体内传递稳定性的2个重要途径。
[0003] siRNA发挥作用时具有高度的序列特异性和很强的靶向性。RNAi具有级联放大 效应，极少量的双链核糖核酸（double-stranded RNA，dsRNA)便可降解比自身浓度大得多 的mRNA，但体内注射siRNA后，复合物必须经过全身循环系统，尽可能避免肾脏肾小球的滤 过，吞噬细胞的吞，血清蛋白吸附和内源性核酸酶的降解，以及网状内皮系统（RES)的滞 留才能到达靶细胞。siRNA在血清中的稳定性较差，容易被核酸酶RNase降解。静脉注射 siRNA后，siRNA通过血液循环分布到各大器官，同时经历消除。siRNA经血管进入组织间质 (外渗），然后横跨间质到达靶细胞，到达靶细胞后通过内吞摄取。在此过程中，siRNA被内 涵体启动的内吞小囊泡包埋，必须从内涵体逃逸，释放到细胞质中，并加载至RISC方能发 挥作用。siRNA的外渗和穿透能力取决于靶组织的物理结构，而它的胞内摄取量还与siRNA 与载体的表面性质有关。将siRNA传递到靶部位的最大障碍是内涵体对siRNA和载体的包 埋和溶酶体对siRNA和载体的降解。
[0004] 裸siRNA自身带负电，分子量大，极性强，很难穿过细胞膜、血管内皮，容易在脾脏 滞留，在生物体内容易被核酸酶降解，半衰期短，转染效率低，甚至会产生强烈的炎症反应 等。因此，siRNA的体内稳定性对其疗效的发挥至关重要。利用各种载体的协助，将siRNA 通过不同的手段高效地递送到靶细胞是当前研究的重点。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种包含季铵盐类化合物和siRNA的组合物，组合物包含siRNA序列 和季铵盐类化合物或具有季铵盐类化合物功能的脂质。
[0006] 优选地，所述的组合物还包含磷脂和胆固醇-聚乙二醇中的一种或两种以上的组 合。
[0007] 优选地，所述的组合物，按照质量份数计算，所述的SiRNAO. 5-3份和季铵盐类化 合物或具有季铵盐类化合物功能的脂质1-8份。
[0008] 优选地，所述的组合物，所述的s i RNA序列为HBV s i RNA :
[0009] 正义链：[mC] CG [mU] GUG [mC] ACUUCGCUU [mC] A [dT] [dT];
[0010] 反义链：UGAAGCGAA⑶G[mC]A[mC]ACGGUC。
[0011] 优选地，所述的组合物，按照质量份数计算，所述的siRNAO. 5-3份，季铵盐类化合 物或具有季铵盐类化合物功能的脂质1-5份。
[0012] 优选地，所述的组合物，按照质量份数计算，所述的siRNAO. 5-3份、季铵盐类化合 物或具有季铵盐类化合物功能的脂质1-5份，磷脂0-1份和脂质-聚乙二醇3-6份。
[0013] 优选地，所述的组合物，按照质量份数计算，所述的SiRNAl份、季铵盐类化合物或 具有季铵盐类化合物功能的脂质1. 5份，磷脂0. 1份和脂质-聚乙二醇4份。
[0014] 优选地，所述的组合物，所述季铵盐类化合物或具有季铵盐类化合物功能的脂质 选自三甲基[2,3-(二亚油烯基氧基）丙基]氯化铵、轮环藤宁、DDODMA、DODAP、DSDMA、 DOTAP、DDAB、DC-Chol、DMRIE、DLinDMA、DLenDMA、GL-67、GL-53、GL-89 中的一种或几种；
[0015] 所述磷脂选自DPPE、DPPC、DPPG、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂，磷脂酰肌醇和心肌磷脂中 的一种或几种；
[0016] 所述脂质-聚乙二醇选自胆固醇-聚乙二醇、双肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇、1，2-二 亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸乙醇氨、双棕榈酰基甘油聚乙二醇和双硬脂基甘油聚乙二醇 中的一种或几种。
[0017] 所述季铵盐类化合物的结构通式如下：
[0018] 其中，R优选为亚油烯基、油烯基、亚油酰基、油酰基、正十二 ，+. 烷基、正十四烷基、正十八烷基；
[0019] 所述季铵盐类化合物优选为三甲基[2, 3-(二正十六烷氧基）丙基]氯化铵、三甲 基[2, 3-(二正十四烷氧基）丙基]氯化铵、三甲基[2, 3-(二正十二烷氧基）丙基]氯化 铵、三甲基[2, 3-(二油烯基氧基）丙基]氯化铵和三甲基[2, 3-(二油烯基氧基）丙基] 氯化铵中的一种或两种以上的组合；化合物的制备方法，包括以下各步骤：1)醇与对甲苯 磺酰氯反应生成对甲苯磺酸酯，其中所述醇通式为R〇H，R为C6~24的烷基、C6~24的烯 烃基；
[0020] 2)对甲苯磺酸酯与3_(二甲胺基）_1，2-丙二醇反应生成通式为 化合物；
[0021] 与碘甲烷反应生成通式为 的化合物；
[0022]
与二氯甲烷或二溴甲烷反应生成所述用于脂质体的化合物。
[0023] 步骤1)中R优选为亚油烯基、油烯基、正十二烷、正十四烷、正十六烷。
[0024] 在具体合成时，上述制备方法的步骤1)为将醇、三乙胺、4-二甲氨基吡啶加入二 氯甲烷中，保持在_5°C以下，搅拌16h，然后将对甲苯磺酰氯滴加于二氯甲烷中溶解，并缓 慢升温至室温后，反应15h，检测无醇后，分离有机相，水相二氯甲烷萃取2次，取有机相干 燥，除去溶剂，得对甲苯磺酸油脂。
[0025] 步骤2)为在氩气保护下，将氢化钠与四氢呋喃混合搅拌均匀，然后滴加3_(二甲 胺基）-1，2-丙二醇，再滴加对甲苯磺酸油脂，然后升温至66°C，微回流反应24h，降至室温 后抽滤，石油醚萃取滤液、合并水洗有机相、干燥、除去溶剂，得黄色油状物，然后硅胶柱层 析分离得
[0026] 步骤3)为在
加入碘甲烷，室温下搅拌反应24h，除去溶剂后，得
[0027] 步骤4)为将
溶于二氯甲烷或二溴甲烷中，加入717树脂，搅拌反应 72h后抽滤得粗品，硅胶柱层析分离得所述用于脂质体的化合物。
[0028] 本发明的另一技术方案是提供一种包含季铵盐类化合物和siRNA的组合物的制 备方法，包括以下步骤：
[0029] (1)将所述siRNA序列溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一；
[0030] (2)称取季铵盐类化合物或具有季铵盐类化合物功能的脂质、磷脂、胆固醇、月旨 质-聚乙二醇，并将这些组分溶解于溶剂中得溶液二；
[0031] (3)将溶液一与溶液二相互混合均匀后，于室温下进行真空抽滤，使其中的溶剂逐 渐蒸发；
[0032] (4)待大部分的溶剂蒸发后，进行均质，得到悬浮液；
[0033] (5)再对悬浮液进行高压均质、冻干，形成干燥物，即得所述包含季铵盐类化合物 和siRNA的组合物。
[0034] 优选地，所述的组合物制备方法中，所述溶液一与溶液二的体积比为 1: (0. 25-0.8)〇
[0035] 优选地，所述的组合物制备方法中，所述溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯 中的一种或两种以上的组合。
[0036] 优选地，所述的组合物制备方法中，所述步骤（3)中，均质后的悬浮液中的颗粒大 小为 40-240nm。
[0037] 本发明的可包含季铵盐类化合物和siRNA的组合物可提高siRNA治疗的药动学特 征，改变生物分布、胞内摄取量、靶向性和转染效率，减少不良反应等。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1
[0039] 1)将亚油醇（顺-9，12-十八（碳）二烯醇）13.358，三乙胺7.788,4-二甲氨基 吡啶0.732g加入0.25L三口烧瓶中，加入二氯甲烷30ml，于-10度低温循环栗中搅拌，降 至-5度以下，将对甲苯璜酰氯13. 35g溶于二氯甲烷20ml于恒压滴液漏斗中滴加，保持液 温-5度，90mins滴毕，5ml二氯甲烷冲洗恒压滴液漏斗，缓慢升温，室温反应15h后，TLC石 油醚：乙酸乙酯5:1监测无亚油醇，分离有机相，水相二氯甲烷萃取2次，取有机相用无水 硫酸镁干燥，旋蒸脱溶，得无色油状物20。
[0040] 2) 500ml四口烧瓶中加入氢化钠 I. 5g，四氢呋喃50ml，搅拌均匀，氩气保护。将 3_(二甲胺基）-1，2-丙二醇Ig通过恒压滴液漏斗滴加，IOmins滴毕，滴加对甲苯磺酸亚油 醇脂9g，0. 5h内滴毕，升温至66度，微回流反应24h，颜色淡黄，降温后，布氏漏斗抽滤，石 油醚萃取滤液，合并水洗有机相，无水硫酸镁干燥，旋蒸脱溶，得红色油状物l〇g。硅胶柱层 析，洗脱剂二氯甲烷：甲醇10 :1分离得2. 73g淡黄色油状物。
[0041] 3)将N，N，二甲基-2, 3-(二亚油烯基氧基