附图说明】
[0015]图1:原代脂肪来源许旺细胞；图2:纯化两次后的脂肪来源许旺细胞；图3:移植到损伤坐骨神经处的种子细胞，可见大量许旺细胞；图4:荧光显微镜下的图3;其中，(图1、2为100X,图3、4为40X),箭头标记的为许旺细胞,星号标记的为脂肪干细胞。
[0016]图5:术后3个月，损伤神经已经完全再生，无粘连、无血管畸形、无神经瘤；图6:荧光显微镜下的图5 ;图7:神经再生3个月，10 μ m组织薄片的显微镜观察；图8:荧光显微镜下的图7 ；
其中，三角形之间的为再生神经，箭头标记的为移植的GFP种子细胞。
[0017]图9:许旺细胞修复神经缺损，神经再生3月，许旺细胞标志物SlOO免疫荧光染色，可见绿色GFP许旺细胞和SlOO染色重叠；图10:图9中相应的GFP细胞；图11:图9中相应的SlOO免疫荧光染色；图12:神经再生6月，许旺细胞标志物MBP免疫荧光染色图，可见GFP许旺细胞形成髓鞘和髓鞘相关蛋白MBP共染(黄色部分);图13:图12中方框区域局部放大图，可见GFP许旺细胞形成环状髓鞘和MBP共染；图14:图13中的GFP许旺细胞，细胞呈环状；
图15:图13中相应的MBP免疫荧光染色，呈现环状结构，(200X)；
其中:箭头指示许旺细胞特异性标志物S100、MBP和GFP的许旺细胞共染部位。
【具体实施方式】
[0018]实施例1:分离、纯化、富集脂肪来源的许旺细胞
新生7天C57小鼠，常规处理后，放入75%酒精中，浸泡5-10分钟。
[0019]1.无菌条件下取林提的小鼠的脂肪组织，剪碎，用5-20倍组织量的质量体积比为
0.Γ0.2%的复合胶原酶ΝΒ4和0.05~0.1%的Dispase混合酶溶液消化碎块60分钟；
2.将步骤I中已经溶解的组织1500r，离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；
3.用许旺细胞培养液(含2μ M forskolin , 10ng/ml heregulin-β-1、10ng/ml BFGF的DMEM培养基)重悬步骤2得到的细胞，计数，按1x104-5x104个/cm2接种于培养皿。置37 0C，5%C02培养箱培养；
4.细胞培养48-72小时，用0.2%DIspase酶溶液纯化细胞，37°C、15分钟后，收集含有细胞的上清液，以600g离心5-10分钟，弃去上清；
5.用许旺细胞培养液重悬步骤4得到的细胞，培养48-72小时即可得到大量许旺细胞；
显微镜下可见脂肪来源的许旺细胞生长状态好，纯度高。
[0020]实施例2:脂肪来源的许旺细胞修复小鼠坐骨神经缺损实验
a)实施例1中步骤5中细胞培养48-72小时后，吸去培养液，采用0.25%胰酶消化许旺细胞，消化I分钟，DMEM中和胰酶，收集细胞悬液；
b)将步骤a得到的细胞悬液100r，离心5分钟，弃去上清；
c)将步骤b得到的细胞重悬浮于许旺细胞培养液(SCCM)和Matrigel胶的混合液，SCCM和Matrigel胶按1:1比例制成混合液；
d)将步骤c得到的混悬液用吸管反复吹打3飞分钟，充分混匀细胞，步骤c和d均需在4°C冰上操作；
e)采用5%水合氯醛(6ml/kg)腹腔麻醉小鼠，暴露右侧坐骨神经； f)在损伤神经处采用硅胶管制作人工神经室；
g)最后将带有许旺细胞的混悬液注射到损伤神经处的人工神经室中，注射量为1ml
左右；
h)3月和6月后，观察神经再生状态。
[0021]解剖显微镜观察结果显示:再生神经生长良好，无粘连、无血管畸形、无神经瘤、无瘢痕形成。
[0022]实施例3脂肪来源的许旺细胞和脂肪干细胞分别修复坐骨神经缺损一)脂肪来源许旺细胞和脂肪干细胞的获取
许旺细胞的获取:如实施例1中所述方法。
[0023]脂肪干细胞的获取:
1.小鼠常规处理，于75%酒精中浸泡10min后，无菌条件下取脂肪组织，置入一次性离心管中，剪碎至I mmXl mmX I mm大小；
2.加入10-15ml 0.2% NB4 和 5-10 ml 0.2% Dispase，振荡消化约 60 分钟；
3.将步骤2中已经溶解的组织1500rpm，离心5分钟，弃上清，得到细胞团块；
4.加入DMEM培养液8ml重悬细胞，按大约IX 1 Vcm2密度将细胞接种到培养瓶中，置于37°C、5% C02孵育箱培养；
5.待原代细胞长满至80%左右，吸去上清液。PBS漂洗一次后，加37°C、0.25%胰酶消化约I分钟，加入含血清的DMEM培养基终止胰酶消化；
6.收集步骤5所得上清液，以1500rpm、37°C、离心5 min，用DMEM培养液重悬，1:2的比例进行传代接种，置于37°C、5% C02培养箱继续培养；
7.待细胞增殖并覆盖瓶底80%左右时，用同样方法消化传代。
[0024]二)两种细胞修复神经缺损:步骤如实施例2中所述三)再生神经的鉴定
再生神经取材:神经再生3个月和6个月时，将再生神经放置于4%PFA，2h后，移入30%蔗糖溶液，4。C过夜，随后OCT包埋组织，冰冻切片机(Thermo Shandon, Cheshire, UK)切取10 μ m薄片，组织薄片置于阴凉处，过夜阴干；
免疫荧光法:组织经PBS洗去0CT，采用10%羊血清常温封闭30min吸掉羊血清，加入兔抗MBP (1:50; Abeam; UK)、兔抗 SlOO (1:500; Dako; Denmark)、4。C 过夜。PBS 冲洗后，样本中加入 Alexa Fluor? 555 羊抗兔 IgG (1:500; Invitrogen; USA),37°C、45 min。DAPI(1:500; Invitrogen; USA)染细胞核，90s。PBS洗涤后，激光共聚焦显微镜拍照(Leica;Germany)。观察MBP、S100和GFP许旺细胞以及GFP脂肪干细胞间的定位关，。分析许旺细胞和脂肪干细胞的作用；
激光共聚焦纤维镜观察结果显示=GFP许旺细胞和SlOO和MBP均存在共染现象，并且许旺细胞形成了典型的环状髓鞘结构，促进损伤神经的修复；脂肪干细胞和S100、MBP均不共染，说明脂肪干细胞没有形成髓鞘，没有发挥许旺细胞的生理功能。
[0025]上述实施例2和3的结果表明脂肪来源许旺细胞能成功修复缺损坐骨神经。
【主权项】
1.一种组织工程学修复神经缺损的方法，其特征在于，利用从脂肪组织中提取的许旺细胞修复周围神经缺损，其包括步骤: 1)无菌剥离离体的脂肪组织，用10-15ml0.2% NB4和5-lOml 0.2% Dispase酶溶液消化脂肪组织碎块45~90分钟，将溶解的组织1500rpm，离心5分钟，弃上清，得到细胞团块； 2)用许旺细胞培养液重悬步骤I)得到的细胞，以1x104-5x104个/Cm2接种于培养皿； 3)上述细胞培养48-72小时，用0.2%Dispase酶纯化细胞，收集细胞混悬液，以600g离心5-10分钟，弃去上清； 4)用许旺细胞培养液重悬步骤3)得到的细胞，培养48-72小时得到大量许旺细胞； 5)采用0.25%胰酶消化上述许旺细胞，消化I分钟，DMEM中和胰酶，收集细胞悬液，离心； 6)随后将细胞重悬浮于许旺细胞培养液(SCCM)和Matrigel胶的混合液，SCCM和Matrigel胶按1:1比例制成混合液； 7)将步骤6)得到的混悬液用吸管反复吹打3飞分钟，充分混匀细胞； 8)采用硅胶管制作人工神经室，置损伤神经中； 9)将带有许旺细胞的混悬液注入损伤神经的人工神经室中； 10)对再生神经进行免疫荧光检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪组织是5-7天C57小鼠的离体的腹部脂肪组织。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的消化酶的溶剂是DMEM培养基。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纯化细胞通过:吸去培养液，加入2~3ml质量体积比为0.2%的Dispase酶，置37°C、5%C02培养箱作用15~30分钟；然后水平轻轻振荡所得细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤9中，将许旺细胞按1χ106/100 μ I在SCCM和Matrigel胶混合液中混匀，装入Iml胰岛素针筒中，置于冰上，解剖显微镜下将混合液注入到神经导管中。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤:检测再生神经的许旺细胞标志物S100、MBP。7.根据权利要求1所述的方法，其中的脂肪来源许旺细胞作为神经种子细胞在制备组织工程再生神经中的用途。
【专利摘要】本发明属于细胞生物学领域，涉及组织工程学修复神经缺损的方法<b>，</b>具体涉及一种采用脂肪来源的许旺细胞修复人工周围神经缺损的方法及其应用。本发明利用从废弃的脂肪组织中获得的许旺细胞修复损伤的神经以及应用大量脂肪来源的许旺细胞和少量的脂肪干细胞共同修复神经缺损，经动物实验证实，能有效的促进损伤神经的再生。本方法提供了一种组织工程学中修复神经缺损的新方法，为损伤神经的修复提供了一种更优质的治疗参考方法。具有临床应用前景和临床价值。
【IPC分类】A61L27/38, A61L27/18
【公开号】CN105013015
【申请号】CN201410157219
【发明人】陈露露, 沈尊理, 秦金保
【申请人】上海市第一人民医院
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年4月20日