乳液微流化和/或均化期间的组分循环的制作方法
【专利说明】
[0001] 本发明专利申请是国际申请号为PCT/IB2010/003394,国际申请日为2010年12月 03日，进入中国国家阶段的申请号为201080062766. 2,名称为"乳液微流化和/或均化期间 的组分循环"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求2009年12月3日提交的美国临时专利申请61/283, 518的优先权，其 全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及通过微流化制备疫苗的水包油乳液佐剂领域。 技术背景
[0004] 称作'MF59' [1-3]的疫苗佐剂是一种鲨烯、聚山梨酯80 (也称作吐温80)和去水 山梨糖醇三油酸酯（也称作司盘85)的亚微米水包油乳液。它也可包含柠檬酸根离子，如 10mM柠檬酸钠缓冲剂。该乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0. 5%吐温80和约0. 5% 司盘85。参考文献4的第10章、文献5的第12章、文献6的第19章更详细地描述了该佐 剂及其制备。
[0005] 如参考文献7中所述，MF59的商业规模的制备是通过将司盘85分散在鲨烯相中且 吐温80分散在水相中，然后高速混合得到粗乳液。然后将这种粗乳液重复通过微流化机， 产生具有均一油滴尺寸的乳液。如文献6所述，然后将微流化乳液滤过0. 22ym膜，以除去 任何大油滴，得到乳液的平均液滴尺寸在4°C下保持至少3年不变。可如文献8所述测定最 终乳液中的鲨烯含量。
[0006] 水包油乳液含有油滴。这些乳液中含有的较大油滴可作为聚集的成核位置，引起 储存过程中的乳液降解。
[0007] 本发明的目的是提供制备微流化水包油乳液（例如MF59)的进一步和改良方法， 特别是适用于商业规模和提供改良的匀化和微流化以产生含较少大颗粒乳液的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种生产含有鲨烯的水包油乳液的方法，所述方法包括步骤（i)用匀 浆器形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，其中第一乳液是通过使第一乳液组分循环通 过匀浆器多次形成的。
[0009] 本发明还提供生产含鲨烯的水包油乳液的方法，该方法包括步骤：(b)微流化具 有第一平均油滴尺寸的第一乳液，形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的 第二乳液，其中第二乳液是通过循环第二乳液组分形成的，所述循环通过将第二乳液组分 从第一乳液容器经第一微流化装置转移到第二乳液容器，然后通过第二微流化装置，其中 第一和第二微流化装置相同。
[0010] 任选地，本发明方法包括早期步骤（a)形成具有第一平均油滴尺寸的第一乳液。
[0011] 任选地，本发明方法包括步骤（c)过滤所述第二乳液。
[0012] 如下文详述，第一乳液可具有5000nm或以下的平均油滴尺寸，例如平均尺寸在为 300nm-800nm。如下所述，第一乳液中尺寸>1. 2ym的油滴数量可为5xlOn/ml或以下。尺 寸>1. 2ym的油滴是不利的，因为它们可由于液滴聚集和凝结而导致乳液不稳定[14]。
[0013] 形成后，第一乳液可随后至少通过一次微流化，形成平均油滴尺寸减小的第二乳 液。如下所述，第二乳液中的平均油滴尺寸为500nm或以下。如下所述，第二乳液中尺寸 >1. 2ym的油滴数量可为SxK^/ml或以下。为了实现这些特征，必须将乳液组分通过微流 化装置多次，例如2、3、4、5、6、7次。
[0014] 然后第二乳液可滤过例如亲水聚醚砜膜，得到可适用作疫苗佐剂的水包油乳液。 过滤后产生的水包油乳液的平均油滴尺寸可为220nm或以下，例如135-175nm，145-165nm， 或约155nm。过滤后产生的水包油乳液中存在的尺寸>1.2ym的油滴数量可以是5x10s/ ml或更少，例如5x107/ml或更少，5x106/ml或更少，2x106/ml或更少，或5x105/ml或更 少。
[0015] 过滤后形成的最终水包油乳液与第一乳液相比尺寸>1. 2ym的油滴可少至少102 倍，理想的是至少少1〇3倍（例如少10 4倍）。
[0016] 在一些实施方式中，在步骤（iii)之间进行一轮以上的步骤（i)和（ii)。类似地， 可多次重复独立步骤（i)和（ii)。
[0017] 通常，在20-60°C，理想地在40+5°C进行本方法。虽然第一和第二乳液组分可能在 较高温度下也相对稳定，但一些组分的热分解仍然会发生，因此优选较低温度。
[0018] 乳液组分
[0019] 可用动态光散射技术，如参考文献13所述测定平均油滴尺寸（即乳液油滴的平均 直径数）。动态光散射测量机的一个例子是Nicomp380亚微米粒度分析仪（来自PSS公司 (ParticleSizingSystems))。
[0020] 可用颗粒计数器，例如Accusizer? 770(来自PSS公司）测定尺寸>1. 2ym的颗 粒数。
[0021] 本发明的方法用于制备水包油乳液。这些乳液包含三种核心成分：油；水性组分； 和表面活性剂。
[0022] 由于乳液要用于药学应用，油通常应该是可生物降解的（可代谢的）和生物相容 的。
[0023] 油优选包含鲨烯，其是一种支链不饱和萜类鲨鱼肝油（C3I]HM;[(CH3)2C[= CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2;2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳己 烯；CASRN7683-64-9)。鲨烯特别适用于本发明。
[0024] 本发明的油可包括油的混合物（或组合），例如包含鲨烯和至少一种其他油。
[0025] 替代（或除了）使用鲨稀，乳液可含有来自例如动物（如鱼）或植物来源的油。植 物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的 示例。也可使用获自（例如）霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽 油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕 麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制 备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳液 的脂肪和油可代谢并因而可以使用。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方 法的过程为本领域熟知。
[0026] 大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸 油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支 链油，其总称为砲类。也可采用鲨稀的饱和类似物鲨烧。包括角鲨稀和角鲨烧在内的鱼油， 易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。
[0027] 其他有用的油为生育酚，特定是和鲨烯结合。当乳液的油相包含生育酚时，可采用 a、0、丫、5、e或|生育酚中的任何一种，但优选a-生育酚。可同时采用D-a_生育 酚和DL-a-生育酚。优选的a-生育酚是DL-a-生育酚。生育酚可取多种形式，例如不 同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。如果采用这种生 育酚的盐，那么优选的盐是琥珀酸盐。可使用包括鲨烯和生育酚（如DL-a-生育酚）的油 组合。
[0028] 所述水性组分可为淡水（如w.f.i.)或可包括其他组分如溶质。例如，可包含盐 以形成缓冲液，例如柠檬酸或磷酸盐，例如钠盐。常用缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓 冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸缓冲剂。包含的缓冲剂一 般是 5_20mM。
[0029] 表面活性剂优选是可生物降解（可代谢）和生物相容性的。可通过'HLB'（亲水 /亲脂平衡）对表面活性剂分类，其中1-10范围内的HLB表示表面活性剂比起水更易溶于 油，而10-20范围内的HLB表示比起油更易溶于水。乳液优选包含至少一种HLB为至少10， 例如至少15或优选至少16的表面活性剂。
[0030] 可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表 面活性剂（通常称为吐温），特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX?出售的 环氧乙烷（E0)、环氧丙烷（P0)和/或环氧丁烷（B0)的共聚物，如直链EP/P0嵌段共聚物； 重复的乙氧基（氧-1，2-乙二基）数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9 (曲通 (Triton)X-100,或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）；
[0031](辛基苯氧基）聚乙氧基乙醇（IGEPALCA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰胆碱（卵磷 脂）；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（称为苄泽表面活性 剂），如三乙二醇单月桂基醚（苄泽30);聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯（通常 称为司盘），如去水山梨糖醇三油酸酯（司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含 的优选表面活性剂是聚山梨酯80 (吐温80 ;聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯）、司盘85 (去 水山梨糖醇三油酸酯）、卵磷脂和曲通X100。
[0032] 所述乳液中可包括这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物或吐温 80/曲通-X100混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯（吐 温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇（曲通X-100)的组合也适用。另一种 有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合 物可包括HLB值为10-20的表面活性剂（如吐温80,HLB为15. 0)和HLB值为1-10的表面 活性剂（如司盘85,HLB为1. 8)。
[0033] 第一乳液的形成
[0034] 微流化步骤前，可混合乳液组分形成第一乳液。
[0035] 第一乳液中油滴的平均尺寸可以是5000nm或以下，例如4000nm或以下，3000nm 或以下，2000nm或以下，1200nm或以下，lOOOnm或以下，例如平均尺寸为800-1200nm或 300nm-800nm〇
[0036] 在第一乳液中，尺寸>1. 2ym的油滴数可以是5x10n/ml或更少，例如SxK^/ml 或更少，或5x109/ml或更少。
[0037] 然后，微流化第一乳液形成平均油滴尺寸小于第一乳液和/或尺寸>1. 2ym的油 滴更少的第二乳液。
[0038] 可通过将第一乳液组分在匀浆器中混合得到第一乳液的平均油滴尺寸。例如图 1所示，可将其在混合容器（12)中混合，然后将混合组分引入（13)机械匀浆器，例如转 子-定子匀浆器（1)。
[0039] 可以垂直和/或水平方式操作匀浆器。为了方便在商业配置中使用，优选直列式 勾衆器。
[0040] 将组分引入转子-定子匀浆器，并接触含有槽或孔的迅速旋转的转子。组分以类 似栗的方式向外离心甩出，通过槽/孔。在一些实施方式中，匀浆器包括多种转子和定子的 组合，例如梳齿环同心排列，如图1的特征（3)和（4) ; (5)和（6)以及（7)和（8)及图2所 示。用于大规模匀浆器的转子可以在水平方向的多刃叶轮上具有梳齿环（例如图1中的特 征（9))，彼此精密排列，以配合静态衬里中的齿。第一乳液通过转子和定子之间空隙中发生 的湍流、空化和机械剪切组合形成。以与转子轴平行的方向有用地引入组分。
[0041] 转子-定子匀浆器中的重要性能参数是定子的叶尖速度（圆周速度）。该参数是 转速和转子直径的函数。至少10ms1的叶尖速度是有用的，且理想上更快，例如彡20ms\ 彡30ms1、彡40ms1等。可用小型勾衆器在10,OOOrpm轻易实现40ms1的叶尖速度，或用较 大的匀浆器在较低转速（例如2,OOOrpm)实现。合适的高剪切匀浆器可市售获得。
[0042] 对于商业规模生产，匀浆器应理想地具有至少300升/小时，例如彡400升/小 时，彡500升/小时，彡600升/小时，彡700升/小时，彡800升/小时，彡900升/ 小时，彡1000升/小时，彡2000升/小时，彡5000升/小时，或甚至彡10000升/小 时的流速。合适的高性能匀浆器可市售获得。
[0043] 优选的匀浆器提供3xl05和1x106s1的剪切速率，例如3x10 5-7xl05s\ 4xl05_6xl05s\ 如约 5xl05s丄。
[0044] 虽然转子定子匀浆器在操作过程中产热较少，但在使用中也可冷却匀浆器。理想 的是，第一乳液的温度在匀浆过程中维持于60°C以下，例如45°C以下。
[0045] 在一些实施方式中，可对第一乳液成分匀浆多次（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、 30、40、50或更多次）。为了避免对一长串容器和匀浆器的需求，也可另外循环乳液成分（例 如图1中特征（11)所示）。具体说，可将第一乳液组分循环通过某一匀浆器多次（例如2、 3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100次等）来形成第一乳液。然而，太多次循环