含酸的脂质制剂的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200880112354. 8的中国专利申请的分案申请，原申请是2008 年08月22日提交的PCT国际申请PCT/GB2008/002857于2010年4月20日进入中国国家 阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于控制释放肽活性剂（例如胰高血糖素样肽-1，GLP_1)和/或其类 似物的原位形成组合物的制剂前体（预制剂），以及利用所述制剂的治疗方法。具体而言， 本发明涉及用于胃肠外施用的两亲性组分和至少一种GLP-1或类似活性剂的高载量预制 剂，所述预制剂在暴露于水性流体（例如体液）后发生相变，从而形成控制释放基质。
【背景技术】
[0003] 许多生物活性剂包括药物、营养物、维生素等都具有"功能窗"。也就是说具有一个 浓度范围，在该范围内可观察到这些物质提供某些生物学作用。当身体适当部位中的浓度 (例如局部或如血清浓度）降至某一水平以下时，所述物质就不再产生有益作用。类似地， 一般而言存在浓度水平上限，在该水平以上增加浓度也不再产生进一步的益处。在一些情 况下，使浓度增加至特定水平以上将导致不期望或甚至危险的作用。
[0004] -些生物活性剂具有长的生物半衰期和/或宽的功能窗，因此可间断性施用，从 而在相当长的时间段（例如6小时至数天）内维持功能性生物学浓度。在另一些情况下，清 除速率高和/或功能窗窄，因此使生物学浓度维持在该窗口内需要定期（或甚至连续）施 用少量的剂量。当期望或必须以非口服途径施用（例如肠胃外施用）时，这可能尤其困难， 因为自我施用可能很困难，因此造成不便和/或顺应性差，在这样的情况下，通过单次施用 以在需要活性的整个期间提供治疗水平的活性剂会是有利的。
[0005] 使用肽（包括蛋白质）治疗对象的多种疾病状态以及预防和改善其一般健康状况 具有巨大的潜力。然而，由于生物利用度差（这是由于肽和蛋白质在生物流体中快速降解 而引起的），所施用的肽剂的性能通常受到限制。这使得所必须施用的剂量增加并且在许多 情形下限制了有效施用途径。肽和蛋白质穿过生物膜的渗透性常常有限，这进一步加大了 这些影响。
[0006] 施用给哺乳动物体的肽和蛋白质（例如口服、肌肉内等）被机体内存在的多种蛋 白水解酶和体系所降解。众所周知的肽酶活性部位包括胃（例如胃蛋白酶）和肠道（例如 胰蛋白酶、糜蛋白酶等），但是另一些肽酶（例如羧肽酶A、B和C)的活性部位遍及全身。口 服施用后，胃肠降解减少了可能通过肠表面衬层吸收的肽或蛋白质的量，从而降低了其生 物利用度。相似地，哺乳动物血流中的游离肽和蛋白质也受到酶促降解（例如通过血浆羧 妝酶等）。
[0007] 有许多基于肽的活性剂，其中一些在下文中进行讨论。在这些活性剂中，特别感兴 趣的一种是GLP-1。
[0008] 胰高血糖素样肽1 (GLP-1)是高效的葡萄糖调节激素，其从肠L细胞释放进入循 环以响应营养摄取以及神经和内分泌刺激。在结构上，GLP-1前体是一种分子量（MW)为 4. 2KDa的37个氨基酸的肽，具有不同物种间高度保守的序列。在所述前体的前六个氨基酸 的翻译后切割后，产生了两种等效形式的GLP-l((7-37)和（7-36)酰胺）。GLP-1通过包括 以下的行为来参与改变葡萄糖体内平衡：葡萄糖刺激胰岛素分泌和生物合成的增强，以及 胰高血糖素分泌、胃排空和食物摄取的抑制。GLP-1刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素释放 的能力是葡萄糖依赖性的；因此施用GLP-1造成血糖过低的风险很低。GLP-1在临床前糖 尿病模型中还增加0细胞的量，其机理包括：刺激P细胞增殖和新生，以及抑制P细胞凋 亡。在动物和人中的研究表明GLP-1还可在心血管系统中起到保护作用。
[0009] GLP-1的组合作用已经引起了对使用该肽作为治疗剂治疗II型糖尿病的 很大兴趣。但是，天然GLP-1的治疗潜力受限于其非常短的血浆半衰期（2分钟以 下）。这是由于蛋白水解酶二肽基肽酶（DDP)-IV造成的快速失活和肾清除导致 的。因此，已经开发了长效的抗DPP-IV的GLP-1类似物用于临床应用，包括艾塞那 肽（Exenatide)(Byetta，Amylin_Lilly)，利拉鲁肽（liraglutide)(NovoNordisk)， CJC-1131(ConjuChem),AVE010(ZealandPharma-Sanofi-Aventis),LY548806 (Lilly), TH-0318(TheraTechnologies)和B頂 51077(Ipsen-Roche)。所有这些都是每天施用一次或 两次的产品；控制释放（一周）的艾塞那肽产品（ExenatideLARAlkermes-Amylin-Lilly) 目前在临床研究中。这些GLP-1模拟物以相似或更高的亲和力与GLP-1受体结合并产生等 同于天然GLP-1的生物作用，但是能抗DPP-IV介导的失活和肾清除。这些化合物能在体内 更长时间内施加更持续的GLP-1样活性。一种用于延长天然GLP-1作用的替代治疗途径是 抑制DPP-IV的活性，从而防止GLP-1降解。几种抑制DPP-IV活性的口服活性剂也正在针 对II型糖尿病的治疗进行评估。
[0010] 下面显示了GLP-1的结构和序列以及一些已知的类似物，以两个等效的天然形式 开始。用直观的体系描述GLP-1的片段和类似物。例如，Arg34-GLP-l(7-37)表示形式上源 于GLP-1前体的GLP-1类似物，通过删除第1到6个氨基酸残基并用Arg来取代34位的天 然氨基酸残基（Lys)而得到。
[0011] 天然（人）GLP-l(7-37)
[0012] His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-G ln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly37
[0013] 天然（人）
[0014] GLP-1 (7-36)酰胺
[0015] NovoNordisk(利拉鲁妝）
[0016] Arg34Lys26_ (N-e- (y-Glu(N-a-十六烷酰基）））-GLP-1 (7-37)
[0017] ConjuChem(CJC-1131)
[0018] D_Ala8Lys37_ (2_ (2_ (2_马来酰亚胺基丙酰胺基（乙氧基）乙氧基）乙酰 胺））-GLP-l(7-37)
[0019] Sanofi-Aventis/Zealand (AVE-010 (ZP10))
[0020] His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A la-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr 〇-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
[0021] EliLilly(艾塞那肽）
[0022] His7-Gly-Giu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Leu-Ser-Lys-Gln-Met20-Glu-Glu-G lu-Ala-Val25-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu30-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro37-Ser-Ser-Gly-Al a-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser_ 酉先胺
[0023] 本文所用的"天然GLP-1"表示人GLP-1 (7-37)和/或人GLP-1 (7-36)酰胺，术语 "利拉鲁肽"，"CJC-1131"，"AVE-010"和"艾塞那肽"用于表示上述各活性组分，在上下文允 许的情况下，包括它们生理学可接受的盐、酯和衍生物。所有这些（包括天然GLP-1)序列均 包括在本文所用的术语"GLP-1类似物"中。其它合适的GLP-1类似物描述于例如Knudsen etal.J.Med.Chem. 2000,43,1664-1669;KnudsenJ.Med.Chem. 2004,47,4128-4134;Hui等 DiabetesMetab.Res.Rev. 2005, 21，313-331 以及Holz和ChepurnyCurr.Med.Chem. 2003， 10,2471-2483中。这些引用文献的全部内容在此通过引用并入本文，尽管本文引用了具 体章节，但是任何这些文献中所指的所有GLP-1类似物序列和所有GLP-1受体激动剂均适 用于本发明。本文所指的GLP-1受体激动剂包括上文所述和上文所引用参考文献的所有 GLP-1类似物。
[0024] 对于施用来说，诸如正在发展中的II型糖尿病的病症，任何治疗方案通常都将涉 及持续数月或数年的长期治疗。当前可用的GLP-1疗法通常是注射剂，其需要在治疗期间 每天施用大约两次。这通常是由病人自己施用的。由于长期频繁注射并不是最佳的施用策 略，因此GLP-1使用者受益于长效持续释放制剂是显然的，所述制剂的施用频次可能大大 减少。
[0025] 已知正在开发中的唯一的长效GLP-1产品是艾塞那肽LAR，它是由 Alkermes，Amylin和Lilly合作开发的。它使用由生物可降解聚合物微球组成的 Alkermes[Vledisorb?递送系统。此释放系统包含悬浮于水中的聚（dl-丙交酯）（pdll) 聚合物微球制剂，其捕获所述GLP-1类似物艾塞那肽。艾塞那肽LAR中的艾塞那肽负载水 平通常为0. 8-2mg/每周施用剂量。显然，正在经受GLP-1受体激动剂治疗的患者将通常需 要治疗数月或数年，能负载并长期控制释放更大剂量的贮库（depot)系统将提供相当大的 优点。
[0026] 聚合物微球制剂通常必须通过相当大的针（通常为20号（gauge)或更宽）来施 用。通常为聚合物悬浮液的所用聚合物施用系统的本身形状决定了这是必需的。显然，提 供低粘度系统将是有利的，例如均相溶液、细微颗粒的分散体或L2相，其易于通过窄的针 施用，因此降低了患者在该过程中的不适。在II型糖尿病的情况下，这种施用的便利性是 尤其明显，因为大多数病人目前处于自施用的模式。提供持续几天的持续制剂，但是其足够 复杂以致施用需要通过健康护理专业人员来处理，这对于每天超过两次或每天一次自施用 的所有患者来说并不是有利的，并且很可能更昂贵。提供具有足够长的持续时间以合理地 拜访健康专业人员来施用的制剂和/或可自施用的制剂，以及减少健康护理专业人员或患 者在实际施用前的准备时间都是非常重要的事情。
[0027] 聚乳酸酯、聚乙醇酸酯和聚乳酸酯-共-乙醇酸酯聚合物通常用于降解持续释放 制剂，并且其用于所述唯一已知的GLP-1持续释放产品，也是至少在一些患者中引起某些 刺激的原因。特别地，这些聚合物通常包含一定比例的乙酸杂质，其会刺激施用时的注射部 位。当所述聚合物随后分解时，乳酸和乙醇酸是降解产物从而导致进一步的刺激。由于宽针 施用和刺激成分的组合效应，施用部位的不适和结缔疤痕组织的形成要比所预期的要大。
[0028] 从药物递送的观点来看，聚合物贮库组合物通常具有仅接受相对较低药物负载量 和具有"突释/滞后"释放特性的缺点。当所述组合物第一次施用时，所述聚合物基质（尤 其是当作为溶液或预聚物施用时）的性质导致药物释放的初始突释。随后为低释放阶段， 同时所述基质开始降解，然后释放速率最终增加至所期望的持续释放特性。该"突释/滞 后"释放特性会导致活性剂的体内浓度在施用后迅速突释到高于功能窗，然后在达到一段 时间的持续作用浓度之前在滞后阶段中下降回到功能窗的底部。显然，从功能和毒理学的 角度来看，该"突释/滞后"释放特性是不期望的并且可能是危险的。由于在所述"峰"值 点的不良作用的危险，可能所能提供的平衡浓度也受到限制。在由所述贮库提供的活性剂 的浓度低于起作用浓度的时候，滞后期的存在可能还需要在贮库治疗的开始阶段通过重复 注射来补充施用，以维持治疗剂量。
[0029] 显然，在GLP-1类似物的情况下，重要的是在施用后立即的"突释"阶段不会显著 地导致对象的低血糖。GLP-1在这方面比胰岛素要安全得多，但是一些GLP-1类似物的临床 试验已经显示了使用非持续释放制剂的低血糖效应，并且当制剂设计为持续几周的时候所 注射的剂量会相应地更高。因此，在施用GLP-1类似物组合物时使立即的"突释"效应最小 化将是相当有利的。
[0030] 对某些现有的贮库系统来说，PLGA微珠和悬浮液的制备是另一个相当大的难点。 特别地，由于所述微珠为颗粒状，并且聚合物阻塞膜，所以它们通常不能过滤灭菌，并且，由 于PLGA共聚物在约40°C熔化，所以它们不能通过热处理灭菌。因此，复杂的制备过程必须 全部在高度无菌的条件下进行。
[0031] 使用生物可降解聚合物微球的其它问题包括注射前复杂的再构建和有限的储存 稳定性，这是由于所述递送系统和/或活性剂的聚集和降解造成的。
[0032] 另外，W02006/131730中描述了GLP-1及其类似物的基于脂质的持续释放组合物。 这是非常有效的制剂，但是所述制剂中可包含的GLP-1类似物的浓度受到所述（肽）活性 剂的溶解度的限制。显然，较高浓度的活性剂可允许更长作用时间的贮库产品、维持较高全 身浓度的产品以及具有较小注射体积的产品，所有这些因素在适当情形下相当有利。因此， 建立可使得较高浓度的GLP-1或GLP-1类似物包含在基于脂质的贮库型制剂中的方法将是 相当有意义的。
【发明内容】
[0033] 本发明人现在通过提供一种在例如分子溶液的低粘度相中包含非聚合物缓慢释 放载体、至少一种肽活性剂（例如至少一种GLP-1受体激动剂）、至少一种脂溶性酸和生物 可耐受溶剂的非水性预制剂，可以产生能克服已知贮库型制剂的许多不足的预制剂，并且 所述预制剂可用于提供GLP-1受体激动剂贮库。特别地，所述预制剂易于制备，可以过滤灭 菌，具有低粘度（允许简便和较少痛苦的通常通过窄针的施用），允许引入相比于之前更高 水平的生物活性剂（由此潜在地允许使用较少量的组合物），需要浅的注射和/或形成所期 望的具有体内可控"突释"或"非突释"释放特性的非层状贮库型组合物。所述组合物也可 由无毒的、生物可耐受的和生物可降解的材料形成，所述组合物可通过肌内注射（i.m.)或 皮下注射（s.c.)来施用并且适于自施用。显然，这些优点同样适用于其它合适的活性剂， 特别是肽。
[0034] 在第一个方面，本发明提供了一种非水性预制剂，其包含以下物质的低粘度混合 物：
[0035] i)非聚合物缓慢释放基质；
[0036] ii)至少一种生物相容性（优选含氧的）有机溶剂；
[0037] iii)至少一种肽活性剂；以及
[0038] iv)至少一种脂溶性酸。
[0039] 在一个优选的方面，所述肽活性剂是GLP-1受体激动剂，所述非聚合物缓慢释放 基质是基于脂质的缓慢释放基质。因此，在另一个方面中，本发明提供了一种非水性预制 剂，其包含以下物质的低粘度混合物：
[0040] i)基于脂质的缓慢释放基质；
[0041] ii)至少一种生物相容性（优选含氧的）有机溶剂；
[0042] iii)至少一种肽活性剂，例如GLP-1受体激动剂；以及
[0043] iv)至少一种脂溶性酸。
[0044] 在又一个方面中，本发明提供了一种非水性预制剂，其包含以下物质的低粘度混 合物：
[0045]a)至少一种中性二酰基脂质和/或生育酚；
[0046] b)至少一种磷脂；
[0047] c)至少一种生物相容性（优选含氧的）有机溶剂；
[0048]d)至少一种肽活性剂，例如GLP-1受体激动剂；以及
[0049]e)至少一种