域内 是公知的。可以例如利用荧光激活细胞分类法（FACS)来实现对特定类型的淋巴细胞（例如 ⑶4 +T细胞）的数目的测量。细胞毒性和CTL测定可以是如例如Raz等人（1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523中所描述的。可以例如通过ELISA来测量细胞因子浓度。评 估针对免疫原的免疫应答的此类和其它测定在本领域内是公知的。参见，例如，SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUN0L0GY(1980)Mishel 1 和 Shi igi，eds.，W.H. Freeman and Co ? 〇
[0174] 试剂盒
[0175] 还提供了包括一个或多个无菌容器的试剂盒，所述一个或多个无菌容器含有本申 请中描述的佐剂组合物的组分。单个组分可存在于分开的无菌容器中，或者两种或更多种 组分可存在于单一的容器中。任选地，所述试剂盒还可包括含有所需抗原的容器。
[0176] 在一些实施方案中，无菌容器可任选地具有用于抽取特定体积/量的组分的接入 口（access port)，例如，用于引入注射器以抽取一定体积的药学上可接受的油的口。
[0177] 在一些实施方案中，含有本申请中描述的佐剂组合物的组分的容器可以不是无菌 的但是相当干净的。
[0178] 所述试剂盒还可包括一套适当的说明书（通常为书面说明书），所述说明书涉及 佐剂组合物用于免疫调节的用途（例如，改善传染病的症状，增加IFN- y水平，增加IFN- a 水平或改善IgE-相关的病症）。
[0179] 所述试剂盒可包括包装在任何方便、适当的包装中的佐剂组合物的组分。例如， 如果组分是干制剂（例如，冻干的或干燥的粉剂），那么可使用具有弹性塞子的小瓶，从 而可通过经所述弹性塞子注射液体来容易地重悬浮所述组分。具有无弹性的可移除封口 (closures)(例如，密封的玻璃）或弹性塞子的安瓿瓶可被用于所述佐剂组合物的液体组 分。还包括的是与特定装置、粘膜施用装置（例如吸入器）、经鼻施用装置（例如喷雾器） 或眼滴剂组合使用的包装。
[0180] 涉及佐剂组合物的用途的说明书通常包括关于用于免疫调节的剂量、给药方案和 施用途径的信息。含有佐剂组合物的组分或预混合的佐剂组合物的容器可以是单位剂量、 批量包装（例如，多剂量包装）或亚单位剂量。本申请中公开的试剂盒中所提供的说明书 通常是标签或包装说明书（例如，试剂盒中包括的纸页）上的书面说明书，但也可包括机器 可读的说明书（例如，磁盘或光盘上携带的说明书）。 实施例
[0181] 提供了下列实施例以进一步阐明本发明的优势和特征，但无意限制本发明的范 围。虽然它们是可能被使用的典型实施例，但备选地可使用本领域技术人员已知的其它过 程、方法或技术。
[0182] 材料和方法
[0183] 下列材料和方法用于实施例1 一 4。
[0184] 佐剂和疫苗制备物。以0. 5 y g/剂使用A/Caledonia/20/99 (H1N1)-样病毒 (储液浓度〇.33yg/yl)的重组HA蛋白。将维生素A(VA;视黄酸，Sigma-Aldrich; Cat#R2625)、维生素 E(VE;a 生育酚，Sigma-Aldrich/Fluka Biochemika;Cat#95240)和 儿茶素水合物（Cat;Sigma-Aldrich，C1251，同义名：（+)-儿茶素-3,（2R，3S)-2-(3,4-二 羟苯基）-3, 4-二氢-1 (2H)-苯并吡喃-3, 5, 7-三醇）溶解在200酒精度的无水乙醇 (Sigma-Aldrich, Cat#459844)中。储液浓度为 3 y g/ y 1 (对于 VA)、2000 y g/ y 1 (对 于VE)和50 y g/ y 1 (对于儿茶素水合物）。将维生素C(VC ;Sigma-Aldrich，Cat#A4544) 以100 yg/yl (pH 5. 5)的浓度溶解在碳酸氢钠缓冲液（pH 10.6)中。芥子油（M0)购自 Botanic Oil Innovations Inc. (Spooner, WI)〇
[0185]用于疫苗接种的各剂量的量为30 y g (对于VA)、500 y g (对于VC)、2000 y g (对于 VE)和120yg(对于Cat)。用于各頂大腿剂量的总体积为lOOyl(用Dulbecco's磷酸缓 冲盐溶液（PBS) (Cat#21-030-CV)调整的）。利用无内毒素的试剂并且在无内毒素的2. 0ml 管（Eppendorf biopur safe-lock微量离心管）中制备全部疫苗。
[0186] -共制备22种不同的具有疫苗的佐剂组合。没有M0而制备前11组，利用M0 (50 % 的总体积）制备后11组。对于具有M0的全部组合，以0.1%的终浓度加入Tween?:-20(Sigma, Cat#P1379)用于乳化。通过使用BD的l/2CCl/2In. 27G结核菌素注射器 (Cat#305620)反复抽出-释放至少15次来乳化具有M0的组合。对于各个组合制备4剂。
[0187] 22组HA疫苗的组合显示在下面的表2中。各组包含重组的HA蛋白。
[0188] 表 2
[0189]
[0190] 动物和免疫。将66只6至8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成22组（3只小鼠/ 组）。按照IACUC指导方针在Murigenics Inc.的动物饲养所（Vallejo, CA 94592)中饲养 小鼠。用异氟醚麻醉小鼠，并使用与用于乳化的相同的结核菌素注射器在两个大腿上通过 肌内（頂）注射而进行疫苗接种。各小鼠接受100 y 1的疫苗制备物，即，各大腿上50 y 1。
[0191] 免疫后1天收集的血清中的细胞因子的测试。在疫苗接种后1天，对小鼠进行眶 后采血，并从单只小鼠制备血清。按照制造商的说明书，使用来自Biolegend的ELISA Max? Deluxe装置就TNF a和IL-12 (分别为Cat#433606和Cat#430906)测试血清。为了增强测试 的灵敏度，使用了由PerkinElmer生产的ELAST?ELISA放大系统（Cat_EP116E001EA)。 简要地，在于Biolegend试剂盒中进行抗生物素蛋白-HRP步骤后，加入生物素化的酪胺 (10 y 1/ml于酪胺稀释剂中）。将平板在室温下温育15分钟。在用PBS-Tween20 (PBS-T)洗 涤5次后，以2 y 1/ml加入封闭溶液（1 %山羊血清和PBS中的0. 02% Tween-20)中的链霉 抗生物素蛋白-HRP。在室温下温育30分钟后，用PBS-T洗涤平板5次，加入底物TMB (BioFX Laboratories, Cat#TMBS-0100-01)。密切观察显色，当背景颜色开始出现在空白孔中时，立 即用 IN H2S04终止显色。使用 Molecular Devices UV max 动力学酶标仪（Sunnyvale, CA) 在 450nm 处读取吸光度。使用 Softmax Pro 软件（Molecular Devices, Sunnyvale, CA)并 且基于试剂盒制造商提供的标准测定各样品中各个细胞因子的浓度。
[0192] 通过ELISA进行的血清抗体的测试。在疫苗接种后3周，对小鼠进行眶后采血。收 集单只小鼠的血清并且在测试之前将血清保存在-20°C。为了进行IgGlELISA，以0. 66 y g/ ml (于PBS中）的浓度用100 y 1的重组HA蛋白在4°C包被nunc maxi SQrp# 96孔微量 培养板过夜。在用PBS-T洗涤4次后，用200 y 1封闭溶液（1 %山羊血清，PBS中0. 02%的 Tween-20)在室温下封闭平板1小时。起初在封闭溶液中将血清样品以1/600稀释，然后对 于各个样品在96孔微量培养板的各列中进行3倍的系列稀释。第1列用作空白。分别在 第2和3列中以相同的方式稀释阳性参考血清和阴性参考血清。在加入和稀释血清样品后， 将平板在室温下温育2小时。然后用PBS-T洗涤平板5次，随后加入100 y 1在封闭溶液中 1/8000 稀释的山羊抗-小鼠 IgGl-HRP 缀合物（Southern Biotech, Cat#1070-05)。将平板 在室温下温育1小时。在用PBS-T洗涤5次后，加入100 y 1 TMB底物进行显色。在30分钟 时通过加入100 y 1 1N的硫酸终止显色。使用酶标仪（Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 在450nm处读取平板。截止值被确定为背景值（空白孔的平均值）的2.5倍。使用基 于log-logit曲线的软件自动计算各血清样品的滴度。对于IgG2a滴定，除了二抗缀合 物外，所有步骤和试剂与用于IgGlELISA的相同。使用了以1/8000稀释的山羊抗-小鼠 IgG2a-HRP 缀合物（Southern Biotech, Cat#1080-05)。对于 IgA 滴定，除了起初将血清样 品以1/20稀释，然后在各列中进行3倍系列稀释并使用了以1/8000稀释的山羊抗-小鼠 IgA-生物素（Southern Biotech, Cat#0106_08)之外，所使用的步骤和试剂与上述步骤和 试剂相同。还需要用抗生物素蛋白-HRP进行的额外步骤。
[0193] 脾细胞培养物和通过ELISA测试上清液中的细胞因子。在第二次疫苗接种后1 周，处死66只小鼠，收集脾（SP)和阴道灌洗。将各个单个的脾挤压通过Falcon 70um尼龙 滤网（Cat#353910)，然后用约4. 5ml含有5% FBS和抗生素的完全RPMI1640培养基（完 全RPMI)冲洗所述滤网。将细胞收集到50ml离心管中，然后将其转移至5ml Nalgene管 (Cat#5000-0050)中。在4°C下于Eppendorf台式离心机（5702R)中以600xg离心5分钟 后，将细胞轻轻地重悬浮在4.5ml完全RPMI中。离心细胞，将其再次重悬浮。为了进行细 胞计数，将20 y 1细胞悬浮液与180 y 1 PBS混合以产生1/10的稀释，将10 y 1稀释的细胞 悬浮液与10 y 1台盼蓝混合，然后利用血细胞计数器将10 y 1的混合物用于细胞计数。在 计数后，将各脾样品中的细胞浓度稀释至2X106/ml的终浓度。
[0194] 对于细胞培养，使用Corning24-孔细胞培养板（Cat#3526)。将0.5ml的细胞加 入至各孔（1X106个细胞/ml)。对于各个样品使用2个孔。一个孔含有0. 5ml的完全RPMI 1640,另一个孔含有0? 5ml具有2 y g/ml HA蛋白（从而导致1 y g/ml的终浓度）的完全 RPMI 16490。在于C02培养箱中在37°C温育24小时后，收获细胞和上清液（SN)，以600x g 离心5分钟。将上清液收集在2ml微量离心管中，于-20°C下贮存并在1周内进行测定。
[0195] 为了测试上清液中的细胞因子，按照制造商的说明书，使用来自Biolegend的 ELISA Max? Deluxe 装置测试 IFNy、IL-5、IL-10(分别为 Cat#430806、Cat#431206 和 Cat#431406)。为了增强测试的灵敏度，使用由PerkinElmer生产的ELAST?ELTSA放大 系统，并且步骤与上文所述的步骤相同。
[0196] 通过ELISA进行的阴道灌洗中IgGl和IgA的测试。使用自动移液器通过在阴道 穹窿内抽吸约100 y 1 PBS 5至7次从单只小鼠收集约100 ii 1阴道灌洗。将阴道灌洗保 持在干冰上以待以后使用。在收集阴道灌洗后无菌地从单只小鼠中移除脾脏，立即将其置 于4.5ml冷RPMI 1640基础培养基（UCSF细胞培养设施）中。将上述收集的阴道洗液融 化，涡旋，然后以3000x g离心5分钟。将各组中的3份阴道灌洗集中，并对于单个组进 行测试。除了 IgGl和IgA的初始稀释为1/3继而进行3倍的系列稀释外，以与上文中针 对血清IgGl和IgA所描述的方式相似的方式进行ELISA测试。测试也采用了上文中描 述的PerkinElmerELAST?ELISA放大系统以增加灵敏度。对于IgGl，在山羊抗小鼠 IgGl-HRP步骤后加入生物素化的酪胺。对于IgA，在抗生物素蛋白-HRP步骤后加入生物素 化的酪胺。
[0197] 实施例1:单次肌内（頂）沣射后的免痔调节
[0198] 观察到在用HA+选择的组分疫苗接种后血清IgGl抗体应答的显著增强。虽然与 单独的HA相比较，HA+M0增强了应答，但含有其它的组分时有进一步的增强。一般地，与单 一维生素、cat或cat+VE相比，M0的加入增强了 IgGl应答（图1)。与单独利用PBS中的 HA的疫苗接种相比，M0产生的增强在用HA+cat+MO疫苗接种的组中最高（其诱导15倍的 增强），然后是HA+cat+VE+MO和HA+VA+M0(图1)。用表1中所列的其它组合物疫苗接种的 小鼠组与单独的PBS中的HA相比，不显示增强的血清IgGl抗体应答。这些结果表明在测 试的全部22种组合物中，与HA混合的cat+M0诱导最高的IgGl应答。有趣地，含有维生素 C的佐剂组合物似乎抑制免疫应答。然而，假设的是对免疫应答的抑制可能是由向小鼠施用 的维生素C的高剂量或含有维生素C的佐剂组合物与不含维生素C的佐剂组合物相比之间 一个pH单位的差异引起的假像。
[0199] 将血清抗-HA IgG2a应答作为TH1应答的潜在替代而测量。与IgGl应答相反，在 只用VA疫苗接种的组中测量到了最高的血清IgG2a应答（图1)。
[0200] 实施例2:两次肌内（頂）沣射后的免痔调节
[0201] 与在单次頂疫苗接种后3周获得的数据相比较，在第二次頂疫苗接种后1周，血 清抗-HA IgGl应答通常增加到至少10倍（图2)。与单次頂疫苗接种后的结果相似，与单 独使用PBS中的HA的疫苗接种相比，抗-HA IgGl应答在用HA+M0、HA+M0+VA和HA+MO+Cat 疫苗接种的组中更高。此外，与单独的PBS中的HA相比，用HA+M0+VE疫苗接种的组也显示 增强的IgGl应答。向任意的所述组中加入M0增强了 IgGl应答。与单独的PBS中的HA相 比（数据未显示），表1中所列的其它组合物中没有一种引起IgGl应答的增强。这些数据 显示在两次頂疫苗接种后，与只使用PBS中的HA的疫苗接种相比，当将M0与cat、VA或VE 混合时，血清抗-HA应答得到显著地增强。
[0202] 在用HA+VA+M0进行了第二次頂疫苗接种后，与第一次疫苗接种后测量的IgG2a 应答相比，IgG2a应答增强了（图1和2)。
[0203] 为了确定用各种组分进行的疫苗接种是否引起重链同种型转换为IgA，测定了血 清抗-HA IgA应答。与单独的PBS中的HA相比，用HA