一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子vlp疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于遗传工程技术领域，具体的说，涉及一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子 VLP疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。 多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。预防接种是 控制该病毒的主要手段。在各种预防口蹄疫的疫苗中，用基因工程技术制备亚单位疫苗是 近几十年较为成功的方向，已有产品在市场销售。但是近年来发现免疫原性最强，效果最好 具有广阔应用前景的基因工程疫苗是类病毒粒子（VLP)疫苗。
[0003]制备抗口蹄疫病毒的类病毒粒子有多条技术路线，其中一个重要方向是用能在细 胞中自动装配为类病毒粒子的病毒蛋白基因为载体，在该载体表面插入抗口蹄疫病毒的抗 原表位基因，置入昆虫细胞培养并表达类病毒颗粒。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒 子VLP疫苗及其制备方法。本发明首次采用同为常见家畜病毒的猪圆环病毒（PCV)作为载 体，插入口蹄疫病毒单个表位或不同抗原表位组合从而构建类病毒颗粒。这种类病毒粒子 具有很强的免疫原性，能诱导体液免疫和细胞免疫，可制备成安全、稳定、多价，高效的抗口 蹄疫病毒病亚单位疫苗。
[0005] 本发明以猪圆环病毒（procine circovirus，PCV)的外壳蛋白CAP基因为载体，以 抗口蹄疫病毒的抗原表位基因作为抗原蛋白基因，通过遗传工程技术将上述基因连接并利 用表达系统构建重组杆状病毒粒子，将重组杆状病毒粒子转入细胞，在细胞中合成类病毒 粒子，提取出的类病毒粒子便是抗口蹄疫病毒的疫苗。
[0006] 抗原表位（epitope)是指抗原分子表面具有特殊结构和免疫活性的化学基团， 其能刺激机体产生抗体或促进淋巴细胞增殖并能被其识别，又称抗原决定簇（antigenic determination)。按表位结构不同，可分为线型表位和构象型表位；按结合的受体细胞不同 可分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。B细胞表位既有线型表位，又有构象型表位，而 T细胞表位一般只有线型表位。
[0007] 本发明具体技术方案介绍如下。
[0008] 本发明提供一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗，以猪圆环病毒PCV的外壳 蛋白CAP基因作为载体，将抗口蹄疫病毒的抗原表位基因插在CAP基因的C端，二者联合组 成抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗。
[0009] 本发明中，所述类病毒粒子VLP疫苗是由含有将抗口蹄疫病毒的抗原表位基因和 作为载体的猪圆环病毒PCV的外壳蛋白CAP基因的重组杆状病毒在表达体系中形成的；所 述表达体系选自大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，植物或者哺乳动物细胞中任一种。上述每个表 达体系统均有其特点，例如大肠杆菌系统表达量高，但糖基化等蛋白修饰程度差；哺乳动物 细胞系统表达量低，成本高，但其能进行复杂的蛋白翻译后修饰；昆虫细胞系统既能进行一 定的蛋白修饰，也有较高的表达量，但其蛋白的纯化有一定的难度。本发明所运用的表达体 系可以是任一符合条件的常用体系 本发明中，所述抗口蹄疫病毒的抗原表位基因来自0型、A型或亚洲I型的口蹄疫病毒。
[0010] 本发明中，所述抗口蹄疫病毒的抗原表位基因为VP1的G-H环（141~160aa)、 21 ~40aa、200 ~213aa，VP2 的 74~88aa，VP3 的 26~39aa、VP4 的 20~35aa 或者为上述抗原 表位的组合。
[0011] 本发明中，所述抗原表位选自〇型口蹄疫病毒Mya98毒株的VP1蛋白抗原表位 141~160aa，其氨基酸序列为SEQ No. 1，核苷酸序列为如SEQ No. 2;或者VP1蛋白抗原表 位20~40aa，其氨基酸序列为SEQ No. 3,核苷酸序列为SEQ No. 4 ;或者VP1蛋白抗原表位 200~213aa ;或者上述VP1蛋白抗原表位20~40aa和VP1蛋白抗原表位141~160aa的串联组 合，其氨基酸序列为SEQ No. 5,核苷酸序列为SEQ No. 6。
[0012] 本发明还进一步提供上述抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗的制备方法，其特 征在于：其包括：基因制备、重组质粒构建、重组杆状病毒制备、重组蛋白获取和制苗步骤， 具体步骤如下： (1) 分别克隆出CAP、单表位、串联表位基因； (2) 利用重叠PCR获得重组VLP基因； (3) 将上一步的基因克隆入杆状病毒载体获得重组杆状病毒质粒并鉴定； (4) 将上一步质粒转入昆虫细胞内，收获重组杆状病毒； (5) 扩增重组杆状病毒，使用扩增后的病毒感染细胞表达重组蛋白； (6) 利用SDS-PAGE，Western-Blot和电镜鉴定重组蛋白； (7) 将重组蛋白按一定浓度与佐剂1 :1混匀后制成疫苗，免疫动物检测效果。
[0013] 本发明的有益效果在于：本发明是第一次将FMDV的抗原表位以单个表位或串联 表位插入猪圆环病毒（procine circovirus，PCV)的外壳蛋白CAP基因。含有上述二种基 因的质粒可在不同细胞（昆虫细胞）中能合成类病毒粒子，提取出的类病毒粒子具有免疫原 性，该类病毒粒子对抵抗FMDV感染效果已经显现。本发明的口蹄疫病毒的抗原表位基因序 列来自任何一型的口蹄疫病毒，包括0型、A型、亚洲I型。因此抗口蹄疫病毒的类病毒粒 子（VLP)疫苗可以是单价的也可以是多价的。即一种疫苗可以同时抗0型、A型、亚洲I型 口蹄疫病毒的感染。
【附图说明】
[0014] 图1为重组杆粒的PCR鉴定；A. CAP-B和CAP-BTB的M13引物PCR鉴定结果；1 泳道为CAP-B结果，2泳道为阴性对照结果，3泳道为Marker，从上到下分别为7000, 5500， 3000, 2000bp，4泳道为CAP-BTB结果；B. CAP-B和CAP-BTB的特异性引物PCR鉴定结果， 1泳道为CAP-B结果，2泳道为CAP-BTB结果，3泳道为Marker，从上到下分别为1200,900， 700, 500bp图上标出目的条带附近的marker的大小。
[0015] 图2为转染后Sf9细胞的病变情况（X100); A为正常细胞对照，B为病变细胞。
[0016] 图3为重组蛋白CAP-B电镜观察结果；标尺放大倍率为100000X，标尺长200nm。
[0017] 图4为重组蛋白CAP-BTB电镜观察结果；标尺放大倍率为100000X，标尺长200nm。
[0018] 图5为组蛋白的SDS-PAGE和Western-Blot结果；A :泳道1为空细胞对照，2为杆 状病毒感染细胞对照，3,5分别为04?-8,04?-818实验组，4泳道为1&^1?^出 ：1，3￡9细胞 对照；2,空杆状病毒感染对照，3, CAP-B实验组，5, CAP-BTB实验组，4泳道为Marker。
【具体实施方式】
[0019] 本发明实例中的两种抗原基因按照FMDV 0型MYA98亚型毒株（0/BY/CHA/2010)的 核苷酸序列（GenBank: JN998085. 1)经化学法合成。VP1上的141~160aa的抗原表位基因 命名为B基因，将141~160aa21~40aa--141~160aa串联的基因命名为BTB基因。
[0020] 本发明所涉及的抗原表位组合方式参考了 0型口蹄疫基因工程多肽疫苗(专利 号：02137011. 7)。组合方式为141~160aa20~40aa(或其他表位)141_160aa串联结 构，在肽段连接处加入适当氨基酸多肽作为接头，如实例中采用的141_160aa-Pro-Gly- 21_40aa-Gin-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val--Pro-Ser-Arg- 141_160aa 的抗原多肽结构，前后两个接头分别是2个和11个氨基酸。
[0021] 本发明选用的载体基因为PCV2的CAP基因（GeneBank :ACZ06084. 1)，从含有猪圆 环病毒（procine circovirus，PCV)0RF2 编码的 Cap 蛋白基因（GeneBank :ACZ06084. 1)的 重组质粒上扩增获得。
[0022] 本实例米用invitrogen公司的bac to bac体系，其在重组杆状病毒构建时，使 用供体质粒pFastBac和宿主菌DHlOBac