(含有杆状病毒质粒和辅助质粒)。其中供体质 粒pFastBac上含有苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)的强效启动子PH&控制基因表达，此表达框被 Tn7左、右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型 的Tn7 ;同时宿主菌DHlOBac内的杆状病毒穿梭质粒上含有微型attTn7靶位点。将之前构 建的重组VLP基因克隆到pFastBac载体上后，将含有外源片段的pFastBac质粒转化进入 DHlOBac内，在辅助质粒的帮助下，在微型Tn7单位和微型attTn7靶位点之间就会发生转 座，从而产生重组杆粒，然后转入昆虫细胞获得重组杆状病毒，重组杆状病毒再次感染细胞 即可表达蛋白。
[0023] 下面结合实施例和附图对本发明进一步详细说明。
[0024] 1、CAP-BTB序列和CAP-B序列的获得 通过重叠PCR (合成的BTB基因N端有CAP基因C端一部分序列）获得CAP-BTB序列， 测序确认。从测序正确的CAP-BTB序列上扩增出CAP-B序列，测序确认后分别保存。
[0025] 2、重组质粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB的构建 将CAP-B基因和pFastBacl载体分别用BamH I和Xho I双酶切，回收后进行连接，将 连接产物转入感受态DH5 a后，挑取阳性克隆测序确认，抽取质粒并命名为PFB-CAP-B ;同 样方法获得pFB-CAP-BTB。
[0026] 3、重组杆状病毒质粒rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB的获得 分别将质粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB转化入DH1 OBac感受态细胞内，借由质粒上 的Tn5转座单位和细胞内辅助质粒的功能将目的基因转座到杆状病毒载体Bacmid上。经 由抗生素(卡那霉素，四环素，庆大霉素）和蓝白斑筛选后，提取重组质粒，分别利用目的 基因的特异性引物和载体上的M13通用引物进行PCR鉴定，分别命名为rBAC-VLP+B和 rBAC-VLP+BTB。
[0027] 4、重组杆状病毒质粒的获得及鉴定 挑选转座后白斑抽取重组质粒，分别获得rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB ;分别利用M13 引物(杆粒上自带引物，见图1A)和序列对应的特异性引物进行PCR鉴定；M13引物PCR产 物理论大小分别为3100bp和3200bp，特异性引物PCR产物结果分别为771bp和930bp，结 果见图1B。均在目的大小位置看到对应条带，说明重组杆粒构建成功。
[0028] 5、重组杆状病毒的获得 用rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB分别转染sf9细胞，3-4天后细胞停止生长，体积变大， 内部出现颗粒体(小泡)，晚期细胞脱落或破碎，大量死亡；阴性对照组细胞正常生长，说明 重组病毒转染成功，见图2。
[0029] 6、重组蛋白的表达 将2种重组质粒分别转染至对数期Sf9昆虫细胞，当细胞出现明显病变时，收获培养基 上清，500g离心5-10min收取上清，即为P1代毒株；再用P1代毒株感染细胞获得滴度较高 的P2代毒株；P2代毒株再次感染细胞（M0I=l-5)即可表达重组蛋白，分别命名为CAP-B和 CAP-BTB。
[0030] 使用P2代毒株感染细胞，收获细胞获得重组蛋白。
[0031] 7、重组病毒样颗粒的电镜观察 表达的2种重组蛋白经过负染后，在透射电镜下观察结构。PCV2病毒颗粒大小理 论上为17-20nm，预估插入了外源片段后，CAP-B的大小为20nm-25nm，CAP-BTB大小为 20nm-30nm。图3、图4中可以分别观察到预测大小的颗粒，证明了重组病毒形成了 VLPs结 构。
[0032] 8、类病毒粒中重组蛋白的免疫原性检测SDS-PAGE和Western-Blot结果 使用P2代毒株感染细胞，从中收获类病毒粒子获得重组蛋白。其大小分别为30KD和 36KD啊（图5A)，使用豚鼠抗FMDV MYA98亚型血清作为一抗进行Western Blot，在实验组目 的大小处可以观察到特异性条带，而阴性对照均无对应条带(见图5B)，结果说明本发明所 获得的类病毒颗粒中所展示的FMDV抗原表位具有免疫原性。
[0033] 9、两种类病毒粒子苗对豚鼠的免疫保护效果 将上述重组蛋白按照一定浓度与弗氏佐剂混匀后制成疫苗进行豚鼠保护实验。第一次 免疫所用佐剂为完全弗氏佐剂，每只豚鼠注射〇.3ml ;2周后进行第二次免疫，佐剂为不完 全弗氏佐剂，每只豚鼠注射〇. 3ml ;3周后按照100ID5。剂量攻毒，记录10d内豚鼠发病情况， 见表1。
[0034] 表1 rBAC-VLP+B和rBAC-VLP+BTB苗对豚鼠的免疫保护效果
结果表明，实验组CAP-B和CAP-BTB中8组豚鼠均各有3只未发病，即都为37. 5%的保 护率；对照组中8只豚鼠全部发病，保护率为0%。
【主权项】
1. 一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗，其特征在于：以猪圆环病毒PCV的外壳 蛋白CAP基因作为载体，将抗口蹄疫病毒的抗原表位基因插在CAP基因的C端，二者联合组 成抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗。2. 根据权利要求1所述的类病毒粒子VLP疫苗，其特征在于，所述类病毒粒子VLP疫 苗是由含有将抗口蹄疫病毒的抗原表位基因和作为载体的猪圆环病毒PCV的外壳蛋白CAP 基因的重组杆状病毒在表达体系中形成的；所述表达体系选自大肠杆菌，酵母，昆虫细胞， 植物或者哺乳动物细胞中任一种。3. 根据权利要求1或2所述的类病毒粒子VLP疫苗，其特征在于：所述抗口蹄疫病毒 的抗原表位基因来自O型、A型或亚洲I型的口蹄疫病毒。4. 根据权利要求1或2所述的类病毒粒子VLP疫苗，其特征在于：所述抗口蹄疫病毒的 抗原表位基因为 VPl 的 141~160aa、21~40aa、200~213aa，VP2 的 74~88aa，VP3 的 26~39aa、 VP4的20~35aa或者为上述抗原表位的组合。5. 根据权利要求1或2所述的类病毒粒子VLP疫苗，其特征在于：所述抗原表位选自O 型口蹄疫病毒Mya98毒株的VPl蛋白抗原表位141~160aa，其氨基酸序列为SEQ No. 1，核苷 酸序列为如SEQ No. 2 ;或者VPl蛋白抗原表位20~40aa，其氨基酸序列为SEQ No. 3,核苷酸 序列为SEQ No. 4 ;或者VPl蛋白抗原表位200~213aa ;或者上述VPl蛋白抗原表位20~40aa 和VPl蛋白抗原表位141~160aa的串联组合，其氨基酸序列为SEQ No. 5,核苷酸序列为SEQ No. 6 〇6. -种如权利要求1所述的抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗的制备方法，其特征 在于：其包括：基因制备、重组质粒构建、重组杆状病毒制备、重组蛋白获取和制苗步骤，具 体步骤如下： (1) 分别克隆出CAP、单表位、串联表位基因； (2) 利用重叠PCR获得重组VLP基因； (3) 将上一步的基因克隆入杆状病毒载体获得重组杆状病毒质粒并鉴定； (4) 将上一步质粒转入昆虫细胞内，收获重组杆状病毒； (5) 扩增重组杆状病毒，使用扩增后的病毒感染细胞表达重组蛋白； (6) 利用SDS-PAGE，Western-Blot和电镜鉴定重组蛋白； (7) 将重组蛋白按一定浓度与佐剂1 :1混匀后制成疫苗，免疫动物检测效果。
【专利摘要】本发明属于遗传工程技术领域，具体为一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗及其制备方法。本发明涉及的类病毒粒子（VLP）疫苗是由含有口蹄疫病毒的抗原表位基因和作为载体的猪圆环病毒（procine？circovirus，PCV）的外壳蛋白CAP基因的重组杆状病毒连接形成的，其中口蹄疫病毒的抗原基因可以是任何毒株的抗原表位基因。该重组杆状病毒转入表达体系后传代到第三代可以收获重组病毒粒子，提取出的类病毒粒子便是抗口蹄疫病毒的VLP疫苗。该疫苗免疫口蹄疫模式动物豚鼠后，可以使37.5%的豚鼠免受口蹄疫病毒的感染。
【IPC分类】C12N15/62, C12N15/42, C12N15/866, C12N15/34, A61P31/14, A61K39/135
【公开号】CN105056227
【申请号】CN201510428078
【发明人】刘明秋, 苗巍男, 郑兆鑫
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月21日