融合时，弃去旧培养液，用适量的0.lmol/LPBS(pH7. 4)漂洗细胞2次后向瓶内加入 适量0. 25%的胰酶（pH7. 4)的0.lmol/LPBS配制，过滤除菌。消化，以刚好盖住细胞培养瓶 底部为宜，光镜下观察，待细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入新鲜的培养液终止消化， 并用吸管轻轻反复吹打，使细胞脱离瓶底形成细胞悬液；调整细胞浓度，吸取适量细胞悬液 加入新培养瓶中，加入6mL新鲜培养基，显微镜下观察，放置于细胞培养箱。
[0022] 2、细胞增殖活力检测
[0023] 利用CCK-8法检测TrichinenlideA对三种乳腺癌细胞增殖活力的影响。CCK-8 试剂盒（CellCountingKit-8)是由日本同仁化学研究所开发的检测细胞增殖的试剂盒， CCK-8试剂中含有WST-8 [2- (2-甲氧基-4-硝基苯基）-3- (4-硝基苯基）-5- (2，4-二磺酸 苯）-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS) 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物 的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活 细胞数量。
[0024]具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常规传 代，细胞计数，以2. 5XIO5AiL细胞浓度接种于96孔细胞培养板内，每孔200yL，培养过夜， 待细胞贴壁且生长良好。实验分5组，每组作6个平行孔，分别加入不同量的Trichinenlide 八，使其终浓度分别为200、150、100、5011^/1^，对照组加等量蒸馏水，培养2411，弃掉培养 液，以PBS洗3次，加入新鲜培养液每孔200yL，然后每孔加入10yLCCK-8,培养4h收 获细胞，以酶标仪检测450nm处光密度值[D(450)]，以蒸馏水空白调零，计算不同浓度 TrichinenlideA作用的增殖抑制率。
[0025] 细胞增殖抑制率=[对照D(450)-实验组D(450)]/对照D(450)X100%
[0026] 3、细胞凋亡的检测
[0027] 利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测TrichinenlideA对乳腺癌细胞 MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453凋亡的影响。实验严格按照AnnexinV凋亡检测试剂盒操 作说明进行。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常 规传代，细胞计数，以IO5AiL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mL，培养过夜，待细 胞贴壁且生长良好。实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的Trichinenlide A，使其终浓度分别为150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，用 4°C预冷的PBS(pH7. 2)洗细胞3次，常规胰酶消化，制作单细胞悬液，离心，用250yL稀释 的binding缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为IX106/mL，取100yL的细胞悬液于5mL流 式管中，加5yLAnnexinV/FITC溶液，静置5min，加入20yg/mL的PI溶液10yL，混匀 后于室温避光放置lOmin，在反应管中加400yLPBS，利用流式细胞仪上机检测各组荧光状 况。细胞根据AnnexinV和PI染色情况分别分至4个相，AnnexinV和PI染色均阴性细胞 为正常存活细胞，PI染色阳性、AnnexinV染色阴性为机械损伤或破裂细胞，AnnexinV和 PI染色均阳性为坏死或晚期凋亡细胞，AnnexinV染色阳性、PI染色阴性判定为早期凋亡细 胞。
[0028] 4、细胞线粒体膜电位的检测
[0029] 利用细胞线粒体膜电位分子探针JC-I和激光共聚焦扫描显微镜检测 TrichinenlideA对乳腺癌细胞MBA-MD-453线粒体膜电位的影响。具体操作为：将对数 生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以IO5AiL细胞浓度接种于6孔细 胞培养板内，每孔5mL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好实验分5组，每组作3个平行孔， 分别加入不同剂量的TrichinenlideA，使其终浓度分别为150、100、50mg/mL，对照组加等 量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，用4°C预冷的PBS(pH7. 2)洗细胞3次，加入I.OmLPBS，加 入10yL2. 5mmol/L的JC-1，使其终浓度为25ymol/L，在37°C、5%CO2培养箱内避光孵育 20min，用PBS洗涤3次，激光共聚焦扫描显微镜检测分析。
[0030] 5、数据的统计分析
[0031] 所有数据均以平均数士标准差(t士S)表示，采用SPSS12. 0统计软件，对实验结 果进行单因素方差分析，P〈〇. 05认为两者间存在显著差异。
[0032] 三、结果及结论
[0033] 1、细胞增殖活力检测结果
[0034] 利用CCK-8法检测不同浓度TrichinenlideA作用对三种乳腺癌细胞增殖活力的 影响，结果表明，TrichinenlideA作用可使三种乳腺癌细胞增殖活性均降低，且随作用浓 度的增加降低程度增加，显示出剂量-效应关系，100、150和200mg/mL组与对照组相比均 出现显著性差异（P〈〇. 05,P〈0. 01)，TrichinenlideA作用可显著抑制乳腺癌细胞MCF-7、 MDA-MB-23UMDA-MB-453的增殖，显示出较强的体外细胞毒性，表明TrichinenlideA具有 较强的体外抗乳腺癌效应。结果见图1和表1。
[0035] 2、细胞凋亡的检测结果
[0036] 利用Annexin V/PI双染流式细胞分析技术检测Trichinenlide A对乳腺癌细胞 MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453凋亡的影响，凋亡分析结果显示，Trichinenlide A作用 24h可使三种乳腺癌细胞的凋亡率均升高，显示出促凋亡效应，且具有剂量-效应关系，100 和150mg/mL组与对照组相比具有显著差异（P〈0. 05)表明Trichinenlide A可显著诱导乳 腺癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。结果见图2。
[0037] 总结，本研究通过对TrichinenlideA抗乳腺癌作用研究，发现TrichinenlideA可 使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外 抗乳腺癌效应。
[0038] 表1不同剂量TrichinenlideA对乳腺癌细胞增殖的抑制率（％ )
【主权项】
1. TrichinenlideA在制备治疗乳腺癌药物中的应用，所述TrichinenlideA化学结构 式如下，2. 根据权利要求1所述的TrichinenlideA在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在 于：所述乳腺癌为乳腺癌MCF-7、乳腺癌MDA-MB-231和乳腺癌MDA-MB-453。
【专利摘要】本发明公开了Trichinenlide？A在制备治疗乳腺癌药物中的应用，属于药物领域。通过对Trichinenlide？A抗乳腺癌作用研究，发现Trichinenlide？A可使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺癌效应，可以进一步研究开发成制备治疗乳腺癌的药物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/4433
【公开号】CN105078980
【申请号】CN201510578916
【发明人】金丽秋
【申请人】金丽秋
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月13日