一种新城疫疫苗玉屏风多糖免疫增强剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于于畜禽免疫领域，提供了一种畜禽免疫佐剂，具体公开了一种新城疫 疫苗中药玉屏风多糖免疫增强剂。
【背景技术】
[0002] 随着中国经济的发展、畜牧业快速增长，动物疫病不仅给畜牧业生产造成巨大的 经济损失，而且某些人兽共患病，直接威胁着人类的生存和发展。现在人们已经认识到，机 体免疫系统的素乱更易发生感染。但由于化学药物有用药时间长、疗效持续时间短、药物残 留、环境污染等缺点，而且动物机体的免疫应答，有着极其复杂的过程，多种因素的参与，所 W免疫抑制产生时，常不是单一的化学免疫增强剂所能奏效，因此目前特别缺乏高效低毒 的免疫增强剂。而中药在运方面则有比较明显的特色和优势。许多中药及其复方W整体调 整、平衡阴阳为特点，使机体达到和维持免疫稳定，具有持续作用时间长、无残留、对动物 机体刺激小等优点，所W成为较理想的免疫增强剂。
[0003] 中药免疫增强剂与疫苗配合使用，能增强动物免疫功能，提高动物的抗病力和疫 苗的保护率，因而在预防和控制动物传染性疾病上有很大的推广价值。多糖因为其显著的 生物活性，己引起人们在研发上的极大兴趣。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的诸多不足，本发明提供了一种新城疫疫苗中药玉屏风多糖免 疫增强剂，主要采用黄巧、白术、防风按质量比3:1: 1，通过水煎-醇沉法制备而得，其重要 成分为玉屏风多糖；采用运种免疫增强剂，与疫苗配合使用，能增强动物免疫功能，提高动 物的抗病力和疫苗的保护率，因而在预防和控制动物传染性疾病上有很大的推广价值。 阳〇化]本发明的具体技术方案是：
[0006] -种新城疫疫苗中药玉屏风多糖免疫增强剂，成分为玉屏风多糖，所述的玉屏风 多糖采用黄巧、白术、防风按质量比3:1:1，通过水煎-醇沉法制备而得；
[0007] 其中所述玉屏风多糖是按如下方法提取的： 阳00引 W玉屏风散lOOOg计，将黄巧、白术、防风按质量比3:1:1配置成lOOOg玉屏风散， 加入8倍质量的水浸泡30min;之后煮沸比，过滤后药渣加入6倍质量的水煮沸比，过滤后 滤渣再次加入6倍质量的水煮沸Ih过滤，合并=次滤液，将滤液加热浓缩至lOOOmU冷却后 300化pm离屯、lOmin，除去杂质，蒸馈水定容制成1000血；使其终浓度为Ig/mL;
[0009] 之后用一步醇沉法提取，向上述浓缩液中缓慢加入95wt%乙醇使混合液中乙醇的 终浓度达80wt%，边加边揽拌，添加完成后静置2地，离屯、，取沉淀置于60°C烘干箱干燥，即 得玉屏风总多糖一YPF-PStc;
[0010] 为了达到免疫增强剂的要求，发明人进一步对上述获得的玉屏风总多 糖一YPF-PSt。进行了纯化，具体步骤如下：
[0011] 分别取YPF-PSt。500mg溶解于10血蒸馈水中，得到50mg.血1样品，之后层析柱 (1. 6cmX90cm)，介质为Se地adexA-25,流速0. 42血?min1上样，之后采用分部收集，用 0. 05mol?L心aCl和Imol?L心aCl各400血梯度洗脱，洗脱液经透析袋透析去除氯化钢和 杂质即得纯化多糖灯PF-PStp)。
[0012] 在获得上述的玉屏风总多糖一YPF-PSt。后，发明人采用RAMPSh、RAMPStp、各白术分 级多糖（RAMPSwe、RAMPS7。。和RAMPSSW作为对照对其免疫增强效果进行了评价，结果显示玉 屏风多糖免疫增强剂能显著增强新城疫疫苗免疫维鸡的血清抗体效价，促进外周淋己细胞 增殖，促进淋己细胞进入S期和G2/M期，提高CD4\CD8叮淋己细胞亚群的百分率，提高维鸡 免疫器官指数，能显著提高新城疫疫苗的免疫效果。 阳01引同时发明人将每个多糖设为5个浓度，分别为2、4、6、8、100mgmL1，在维鸡14天 时，滴鼻点眼新城疫苗，同时肌肉注射0. 5mL多糖，连续S天，28天时加强免疫，在初免后7、 14、21、28天时抽血测定抗体效价，来确定免疫效果最好的浓度为6mgmLi。所W我们需要 的玉屏风免疫增强剂的剂量为6mgmL1X0. 5血X3天。
[0014] 由此确定了玉屏风多糖作为新城疫疫苗免疫增强剂时的具体用量为：每单位剂量 疫苗配合9mg中药免疫增强剂使用。
[0015] 综上所述，采用运种免疫增强剂，与新城疫疫苗配合使用，能增强动物免疫功能， 提高动物的抗病力和疫苗的保护率，因而在预防和控制动物传染性疾病上有很大的推广价 值。
【附图说明】
[0016] 图1为各种多糖单独刺激外周血淋己细胞最高细胞增殖率的变化柱状图； 阳017] 图2为多糖协同PHA刺激时各组的最高淋己细胞增殖率的变化柱状图；
[0018] 图3为多糖协同PHA刺激在不同时间点对鸡淋己细胞周期分布的变化柱状图；
[0019] 图4为在不同时间点对鸡淋己细胞亚群CD4+的影响柱状图；
[0020] 图5为在不同时间点对鸡淋己细胞亚群CD8+的影响柱状图；
[0021] 图6为新城疫IV系弱毒苗免疫维鸡后血清ND-HI抗体效价的变化图（l〇g2,n= 6);
[0022] 图7为新城疫IV系弱毒苗免疫维鸡后各组胸腺指数的动态变化图（g.kg1，n= 4)；
[0023] 图8为新城疫IV系弱毒苗免疫维鸡后各组脾脏指数的动态变化图（g.kg1，n= 4)；
[0024] 图9为新城疫IV系弱毒苗免疫维鸡后各组法氏囊指数的动态变化图（g.kg1，n =4) 阳0巧]图10为新城疫IV系弱毒苗免疫维鸡后多糖在不同时间点对鸡淋己细胞周期分布 的变化柱状图（n= 4); 阳0%] 图11为新城疫IV系弱毒苗免疫维鸡后在不同时间点对鸡淋己细胞亚群CD4+的 影响柱状图；
[0027]图12为新城疫IV系弱毒苗免疫维鸡后在不同时间点对鸡淋己细胞亚群CD8+的 影响柱状图。
【具体实施方式】
[0028]W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容做进一步的详细说 明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
[0029] 实施例1多糖的制备
[0030] W玉屏风散lOOOg计，将黄巧、白术、防风按质量比3:1:1配置成lOOOg玉屏风散， 加入8倍质量的水浸泡30min;之后煮沸比，过滤后药渣加入6倍质量的水煮沸比，过滤后 滤渣再次加入6倍质量的水煮沸Ih过滤，合并=次滤液，将滤液加热浓缩至lOOOmU冷却后 3000rpm离屯、lOmin，除去杂质，蒸馈水定容制成lOOOmL;用一步醇沉法提取，向上述浓缩液 中缓慢加入95wt%乙醇使混合液中乙醇的终浓度达80wt%，边加边揽拌，添加完成后静置 2地，离屯、，取沉淀置于60°C烘干箱干燥，即得玉屏风总多糖一YPF-PStc。
[0031] 实施例2多糖的纯化
[0032] 分别取YPF-PSt。500mg溶解于10血蒸馈水中，得到50mg.血1样品，之后层析柱 (1. 6cmX90cm)，介质为Se地adexA-25,流速0. 42血?min1上样，之后采用分部收集，用 0. 05mol?L心aCl和Imol?L心aCl各400血梯度洗脱，洗脱液经透析袋透析去除氯化钢和 杂质即得纯化多糖灯PF-PStp)。
[0033] 实施例3体外免疫效果的比较
[0034] 方法：W玉屏风多糖为试验材料，WRAMPSt。、RAMPStp、各白术分级多糖（RAMPSe。。、 RAMPS,。。和RAMPSSW作为对照。首先测定3个方剂对外周血淋己细胞的安全浓度，然后将3 个方剂用细胞培养液（RPMI1640)分别稀释成62. 5、31. 25、15. 625、7. 813、3. 907yg?血1 一共5个工作浓度，分别加入到培养的鸡外周血淋己细胞中，在酶联免疫仪上检测570nm处 的吸光值（Ae,。值），作为淋己细胞增殖的指标。并按公式计算各多糖的最高细胞增殖率：最 高细胞增殖率=(多糖组最高A"。值一细胞对照组A"。值）/细胞对照组A57。值X100 %。 筛选出RAMPSe。。作为对照方1和RAMPStp作为对照方2,在流式细胞仪上检测各个时间点细 胞的周期分布W及CD4\CD8+T淋己细胞亚群的影响。
[0035]结果：
[0036] (1)多糖单独刺激时各组淋己细胞增殖的变化
[0037]YPF-PStc和RAMPStp在 15. 625-62. 5yg?血1、YPF-PStp在 7. 813-62. 5yg?血1、 RAMPS,。。在31. 25yg?血1时的A57。值显著高于细胞对照组（P<0. 05)(表1)，表明它们在 运些浓度均能显著促进鸡外周血淋己细胞增殖。 阳03引表1多糖单独刺激时各组淋己细胞增殖的变化（A"。值）
[0039]
W40] 注：同列数据标注不同字母者差异显著（P<0. 05) 下同。
[0041] 最高细胞增殖率：YPF-PStp在31. 25yg?血1时的细胞增殖率最高，为31. 148%; 其次为YPF-PSt。在15. 625yg?血1时，为24. 257%，两组显著高于其它多糖组（P<0. 05) (图1)，表明它们单独促进外周血淋己细胞增殖的效果较强。 阳0创 似多糖协同PHA刺激时淋己细胞增殖的变化
[0043] YPF-PSt。在15. 625-62. 5yg?血\YPF-PStp在15. 625-31. 25yg?血\RAMPStp在 3. 125yg.ml\RAMPS抑C在7. 813-15. 625yg.ml1的A的。值显著高于PHA对照组（P<〇.05)(表2)。表明它们在运些浓度能协同PHA促进鸡外周血淋己细胞增殖。 W44] 表2白术多糖协同PHA刺激时淋己细胞增殖的变化（A"。值）
[0045]
[0046] 最高细胞增殖率：RAMPSe。。在7. 813yg?血1时的细胞增殖率最高，为29. 897%， 其次RAMPStp在31. 25yg?血1时，为22. 159%，两组显著高于其它多糖组（P<0. ， YPF-PSt。和YPF-PStp的细胞增殖率显著高于RAMPS7。。、RAMPSs。。和RAMPSt。组（P<〇. 05)(图 2)。表明它们协同PHA促进外周血淋己细胞增殖的效果较强。
[0047] (3)多糖体外对鸡外周血淋己细胞周期的影响 W4引在72h之内未经任何处理的细胞大部分处于G0/G1期，其变化不明显。RAMPStp和YPF-PStp处理细胞48h、7化后，与RAMPSe。。相比较，G0/G1期细胞的百分比明显降低，S期 细胞百分比明显增多（P<〇. 05)(表3和图3)。在所有时间点，与PHA组相比，YPF-PStp和 RAMPStp对淋己细胞周期的SPF值、PI值的影响均显著（P<0. 05)。YPF-PStp和RAMPStp处理 细胞4化后，与RAMPSeoc相比较，SPF值和PI值显著升高（P<0. 05)(表4和5)。
[0049]YPF-PStp在作用于淋己细胞48h时升高S期细胞的百分比的效果最显著，其SPF 值、PI值也均最大，YPF-PStp效果最明显。
[0050] 表3在不同时间点对鸡淋己细胞周期分布的影响（n= 4)
[0051]
[0054]
[0057] (4)CD4叮淋己细胞亚群的变化
[0058] 在所有时间点，试验组的CD4+淋己细胞百分率均显著高于空白对照组（P<0. 05)， YPF-PStp和RAMPStp的CD4 +淋己细胞百分率显著高于PHA对照组（P<0. 05) ;YPF-PStp和 RAMPStp处理细胞4化后，CD4 +淋己细胞百分率显著高于