含有从谷皮中提取的神经酰胺作为活性成分而具有抗特应性活性的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有从谷皮中提取的神经酰胺作为活性成分而具有抗特应性活性的 组合物，具体地，涉及含有从谷皮中提取的神经酰胺作为活性成分，同时显示抗特应性、抗 炎、抗过敏活性，从而能够从根本上治疗特应性的药物组合物或化妆品组合物。
【背景技术】
[0002] 特应性是源自拉丁语中表示"古怪"的一词atopia的词语，特应性（atopy)皮肤 炎是以重度瘙痒症、皮肤干燥及湿疹、慢性皮疹为特征的疾病，是婴幼儿时期湿疹的最常见 形态。
[0003] 此外，特应性的症状持续时间长，因而患者无法忍受瘙痒而挠抓，从而产生伤口而 导致2次感染，不仅症状加重而且还引起患者心理上的不安状态。特应性在敏感性皮肤、干 性皮肤及经常暴露于外部环境的皮肤、免疫力弱的皮肤中多见，且其程度多为更严重。
[0004] 特应性的原因到目前为止还没有明确的解释，但从患有特应性的人通常对灰尘、 尘螨、动物的毛、食物、花粉或霉菌等外部环境的异物具有过敏反应，且伴随过敏性鼻炎、哮 喘、结膜炎等现象来看，推测其可能是因为免疫系统的紊乱而发生。
[0005]目前使用的治疗药中类固醇类药品虽然在消炎效果和免疫抑制效果上优异，但长 期使用时会导致涂抹部位的皮肤萎缩，皮肤色素变少且皮肤变薄等副作用。
[0006] 最近，为了使以往化学药品的副作用最小化而提出了以下技术。韩国公开专利 第10-20060093626(公开日期2006年8月25日）号涉及一种用于抑制瘙痒症和/或 缓解特应性的组合物，该组合物含有抑制介导瘙痒症的组胺的游离且阻碍瘙痒的主媒介 P(SubstanCeP)-NK1受体结合的桑黄提取物，其使用桑黄作为原料而在费用方面负担很 大，且具有仅对特应性的基本症状瘙痒显示出效果，而无法适用于特应性的根本的治疗的 局限性。
【发明内容】
[0007] 发明目的
[0008] 因此，本发明需要实现的目的是提供一种环保且费用低廉，具有抗炎、抗过敏效果 的同时能够从根本上治疗特应性的组合物。
[0009] 技术方案
[0010] 为了实现上述目的，本发明提供含有从谷皮中提取的神经酰胺作为主成分的显示 抗特应性活性的药物组合物或化妆品组合物。
[0011] 根据本发明的组合物，所述谷皮是选自米糠、麸子及大豆柏中的一种以上，优选米 糠。
[0012] 此外，根据本发明的组合物，从所述米糠中提取的神经酰胺可以是N-2-羟基二十 酰基-1-0-β-D-吡喃葡萄糖基-十八碳鞘氨醇-4-反式-8-顺式/反式-二烯（N-2- Hydroxyeicosanoyl-1-〇-beta-D-glucopyranosyl-〇ctadecasphinga-4-trans-8-cis/ trans-diene)〇
[0013] 发明效果
[0014] 根据本发明的组合物，以从谷皮提取，优选从米糠、麸子或大豆柏中提取的神经组 胺作为活性成分，因此既环保且费用低，还具有抗炎、抗过敏效果的同时能够从根本上治疗 特应性。
【具体实施方式】
[0015] 以下详细说明实施本发明的具体内容。此外，作为谷皮的例子虽然例举了米糠、麸 子、大豆柏，但是源自其他谷皮的神经酰胺具有与此类似的结果是显而易见的，因此本发明 不应当解释为仅限于上述三种谷皮。
[0016] 实施例1 :神经酰胺的制备及精制
[0017] 将米糠、麸子、大豆柏分别粉碎后，取100g，用肉豆蘧酸异丙酯：乙醇（1 : 1，体 积）混合溶液500ml提取后，减压浓缩去除乙醇，为了得到生成的沉淀物进行了离心分离 (5000rpm，30分钟）。去除上清液，向剩下的沉淀物中添加0. 4M的Κ0Η乙醇溶液250ml后， 在37°C下反应4小时。在该反应液中添加450ml的氯仿和145ml的蒸馏水，进行分液萃取， 从而获得了以高浓度含有各个谷物的神经酰胺的氯仿层。为了去除氯仿中的Κ0Η，使用纯 化水200ml洗涤3次。将神经酰胺分液（fraction)通过闪蒸系统（flashsystem)柱层析 (展开溶剂：氯仿：甲烷：蒸馏水=99 : 11 : 1 (体积/体积/体积），流速：500ml/分 钟，检出试剂：铜-磷酸）进行精制，得到了米糠神经酰胺、麸子神经酰胺及大豆柏神经酰 胺。
[0018] 在这些神经酰胺中活性优异的米糠神经酰胺使用5ml的氯仿：甲烷：蒸馏水= 99 : 11 : 1 (体积/体积/体积）溶解后，以100μ1为单位使用HPLC(氯仿：甲烷：蒸 馏水=99 : 11 : 1 (体积/体积/体积），流速：3ml/分钟，检测仪：ELSD(管温度：40°C， 气体流速：1. 61/分钟））进行分离，精制出了N-2-羟基二十酰基-1-0-β-D-吡喃葡萄糖 基-十八碳鞘氨醇-4-反式-8-顺式 / 反式-二烯（N-2-Hydroxyeicosanoyl-l-O-beta-D -glucopyranosyl-〇ctadecasphinga-4-trans-8-cis/trans-diene)〇为了I：匕较平价，贝勾买 市售的神经酰胺III(EV0NIK公司）使用。
[0019] 实施例2 :神经酰胺的抗特应性活性评价
[0020] 1.角质形成细胞中的细胞毒性评价
[0021] 实验方法 [0022] 细胞培养
[0023] 将人角质形成细胞系（Humankeratinocytecellline)的HaCaT细胞使用含有 1%的抗生素（antibiotic)和10%的胎牛血清（fetalbovineserum)的达尔伯克改良伊 格尔培养基（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)，在 37°C、5%C02 恒温器中进打培 养，每4天进行一次传代培养。
[0024] 细胞生存率测定（MTT分析）
[0025] 利用添加10%FBS的DMEM培养基，将HaCaT细胞以3.OX105细胞/ml的浓度接 种到96孔板，培养18小时之后，处理了不同浓度的试料继续培养24小时。然后添加50μ1 的MTT溶液反应4小时。完全去除培养基之后，添加200μ1的二甲亚砜完全溶解培养基， 使用全自动定量绘图酶标仪（microplatereader)测定540nm的吸光度。求出各个试料组 的平均吸光度值，与对照组的吸光度值进行比较，从而评价细胞生长率。
[0026] 实验结果
[0027] 将人角质形成细胞HaCaT细胞以3.OxlO5细胞/孔接种于在24孔板，培养24小 时。然后以200yg/ml以下的浓度处理神经酰胺培养24小时后，利用MTT分析确认细胞生 存率，并将其结果示于下表1中。参照表1可以知道均显示出90-100%的生存率，由此可以 确认在测定的浓度范围内没有显示细胞毒性。
[0028]【表1】
[0029]
[0031] 2.用UVB刺激的角质形成细胞中的细胞保护效果
[0032] 实验方法
[0033] 向人角质形成细胞HaCaT细胞照射UVB，为了确认细胞存活率，以3.OxlO5细胞/ml 的密度接种于96孔板，并在37°C，5%C02恒温器中培养18小时。然后弃去培养基，用PBS 洗涤2次，去除全部培养液，加入100μ1的PBS防止细胞干燥，并照射UVB150mJ/cm2,然后 弃去PBS，加入新的PBS洗涤2次后，重新加入培养液培养24小时。在培养结束之前，将溶 于PBS的2mg/ml的MTT溶液以50μ1为单位添加到各孔中，在黑暗条件下，在37°C，5%C02 恒温器培养4小时。完全去除培养基之后，添加200μ1的二甲亚砜完全溶解沉淀物，使用 全自动定量绘图酶标仪测定540nm的吸光度。求出各个试料组的平均吸光度值，与对照组 的吸光度值进行比较，从而评价细胞生长率。
[0034] 实验结果
[0035] 为了测定通过UVB的皮肤角质细胞保护效果，向HaCaT细胞照射UVB紫外线 150mJ/cm2,并将测定细胞存活率的结果示于表2中，参照下表2,可以看到相比对照组神经 酰胺III均具有优异的紫外线保护效果，特别是米糠神经酰胺在100μg/ml以下的浓度显 示出细胞保护效果，相比麸子神经酰胺、大豆柏神经酰胺显示出更优异的紫外线保护效果。
[0036] 特别是，可以确认米糠神经酰胺成分N-2-羟基二十酰基-l-0-β-D-吡喃葡萄糖 基-十八碳鞘氨醇-4-反式-8-顺式 / 反式-二烯（N-2-Hydroxyeicosanoyl-l-O-beta-D-glucopyranosyl-〇ctadecasphinga-4-trans-8-cis/trans_diene)显不出比米糖神经醜胺 更高的紫外线保护效果。
[0037]【表2】
[0040] 3.在肥胖细胞中的细胞毒性评价及对炎症性细胞因子（TNF-α)表达的抑制活性
[0041] 实验方法
[0042] 细胞培养
[0043] 将肥胖细胞RBL-2H3细胞使用含有1 %的抗生素（antibiotic)和10 %的胎牛血 清（fetalbovineserum)的DMEM培养基，在37°C，5%C02恒温器中培养，每3天进行一次 传代培养。
[0044]细胞存活率测定（MTT分析）
[0045] 将肥胖细胞RBL-2H3细胞利用添加了 10%FBS的DMEM培养基，以3.OX105细胞 /ml接种于96孔板培养18小时后，处理了不同浓度的各个试料，培养24小时。此后，添加 MTT溶液50μ1反应4小时。完全去除培养基，添加200μ1的二甲亚砜完全溶解沉淀物，使 用全自动定量绘图酶标仪测定540nm的吸光度。求出各个试料组的平均吸光度值，与对照 组的吸光度值进行比较，从而评价细胞生长率。
[0046]TNF-α表达抑制活性
[0047] 将肥胖细胞RBL-2H3细胞以2. 0*105细胞/ml的密度接种于24孔板中进行18小 时的预培养，加入PMAlyg/ml、A23187ΙμΜ及不同浓度试料溶液后，培养24小时。然 后，将细胞培养基进行离心分离，测定得到的上清液的细胞因子合成量。所有试料直至进 行定量之前冷冻保存。炎症细胞因子使用大鼠酶联免疫吸附分析（rat enzyme-linked immnunosorbent assay，ELISA)试剂盒（R&DSystems)进行定量，对于标准品（standard) 的标准曲线的r2为0. 99以上。
[0048] 实验结果
[0049] 细胞毒性评价
[0050] 利用MTT分析确认细胞存活率，其结果示于表3,参照下表3可以看到在25 μg/ml 的处理浓度下，所有神经酰胺显示出约80%以上的存活率，因此之后的实验均在没有显示 细胞毒性的25μg/ml以下的浓度范围进行。
[0051] 【表3】
[0052]
[0054]TNF-α表达抑制活性
[0055] 为了确认肥胖细胞株RBL-2H3细胞中的炎症及过敏发生因子的活性化抑制，测定 炎症细胞因子TNF-α表达抑制活性，并将其结果示于表4。
[0056] 参照表4,可以看到根据本发明源自谷皮的神经酰胺相比神经酰胺III显示出更 加优异的TNF-α表达抑制效果，其中米糠神经酰胺相比麸子神经酰胺、大豆柏神经酰胺显 示更优异的TNF-α表达抑制效果。
[0057] 特别是，可以确认米糠神经酰胺成分N-2-羟基二十酰基-1-0-β-D-吡喃葡萄糖 基-十八碳鞘氨醇-4-反式-8-顺式 / 反式-二烯（N-2