I-H460、A549、NCI-H1299细胞的增殖抑制作 用，结果表明Sun和Dih单独对NCI-H460细胞具有较好的抑制作用（图Ia和b)，进而考察Sun 和Dih联用对NCI-H460的增殖抑制作用，通过计算获得药物相互作用指数CI。结果发现，其 中Sun(l、2、4ymol/L)与0丨11(6.25，12.5、25以111〇1/1)联合使用时，可以在部分浓度下表现出 对肺癌细胞的协同抑制作用（图lc)。药物组合联合作用指数实验结果见表1。
[0037] 表1药物组合联合作用指数表(Cl)
[0039]备注:叠加作用（0.85<(：1<1.15);协同作用（(：1>1.15);拮抗作用（(：1〈0.85)
[0040]表1中，不同浓度配比的Sun与Dih联合使用，在部分浓度下药物相互作用指数CI值 Q大于1.15,表现出协同作用。如:Sun 2ymol/L+Dih 25ymol/L。其余实验浓度下的组合均表 现为简单的相加作用(〇.85〈Q〈1.15)。
[0041 ]二、本发明的药物组合物的NCI-H460裸鼠移植瘤模型实验 [0042] 1.仪器与材料
[0043] Ti-U型倒置显微镜(Nikon) ;80-2型台式电动离心机(上海市分析器械厂）；移液器 (Eppendorf );UPT-IV-5T超纯水制备机(成都市超纯科技有限公司）；BP211D电子天平(上海 光正医疗仪器有限公司）；细胞计数板(上海求精生化试剂有限公司）；一次性注射器(江西 市金山医疗器械有限公司）；游标卡尺(无锡市锡工量具有限公司）；手术剪（上海市医疗器 械有限公司）；细胞工厂培养系统(NUNC)。
[0044] 4-6周龄BALB/c免疫缺陷小鼠，雄性，购自中科院上海实验动物研究所，饲养于西 安交通大学实验动物中心的洁净级动物房，自由摄取食物和水。
[0045] 2.实验方法
[0046]将人肺癌细胞NCI-H460,用胰酶消化，接种于细胞工厂内，待细胞处于指数级增长 期时，用胰酶消化，收集细胞，用无菌生理盐水制成I X IO7个/mL的细胞悬液，皮下注射于雄 性裸鼠左侧腋下位置处，每只〇.2mL。每日观测小鼠状况，用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短 径(b)，根据公式V(mm 3 ) = (a X b2)/2计算瘤体积。待肿瘤体积达到80~IOOmm3时，将动物随 机分为4组，每组5只。分别为：①对照组：0 · 5 % CMC-Na;②Sun组：20mg/kg;③Dih组：250mg/ kg;④Sun 20mg/kg+Dih 250mg/kg组。采用对照组和Sun组每日一次灌胃给药，Dih组和Sun+ Dih组每隔一天灌胃给药。14d后，颈部脱臼处死小鼠，将肿瘤剥离、称重，计算抑瘤率。
[0047] 实验数据采用平均值土标准误(Mean土SEM)来表示，用SPSS 19.0统计学软件进行 分析，p〈0.05表不具有显著性差异。
[0048] 3.实验结果
[0049] 如图2所示，Sun单独给药浓度为20mg/kg时，移植瘤的抑制率为48.53% ;Dih单独 给药浓度为250mg/kg时，移植瘤的抑制率为28.65%;而将两者联合使用时，抑制率可以达 到72.51 %。同时，在对照组(Control)、Sun组、Dih组和Sun+Dih组中，裸鼠体重分别为23.64 ± 2.59g、25.59 ± 2.41g、23.11 ± 1.67g和23.42 ± 1.56g，结果表明联合给药组显著降低小 鼠肉瘤体积和瘤重的同时，小鼠的体重并未出现明显的降低，说明联合用药对小鼠的生理 状态没有明显的影响，未表现出对实验动物的毒副作用。
[0050]三、本发明的药物组合物对NCI-H460细胞和肿瘤组织信号通路分子和炎症分析的 调控作用
[00511 1.仪器与材料
[0052] Ti-U型倒置显微镜(Nikon) ;80-2型台式电动离心机(上海市分析器械厂）；移液器 (Eppendorf) ;UPT-IV-5T超纯水制备机(成都市超纯科技有限公司）；细胞计数板(上海求精 生化试剂有限公司）；培养板(Costar) ;ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司）；BCA蛋白 定量检测试剂盒（健康元药业集团股份有限公司）；抗体PI3K ρ110α、ΡΙ3Κ ρ110β、ΡΙ3Κ ρ110γ、ΡΙ3Κ classm、p-PI3K p85/p55、PI3K p85、p-AKT、p-mT0R、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p-NF-KB(Cell signaling Technology);mT0R、IKBa、NF-KB、TOX-2、PTGES2、GAPDH (Protein technology Group) ;AKT、p38、JNK、p-JNK(Epitomics);二抗（美国Pierce公司）； ECL发光液(Millipore);电泳仪(北京六一仪器厂）。
[0053] 2.实验方法
[0054] 通过Western Blotting实验和Elisa考察药物组合物对NCI-H460细胞和肿瘤组织 信号通路分子和炎症分析的调控作用。将处于指数级增长期的人肺癌细胞NCI-H460,用胰 酶消化，吹散成单细胞悬液，计数，接种于6孔培养板中，控制细胞密度在I X IO5个/mL，在培 养箱中培养24h，待细胞贴壁后，加入不同浓度的待试药物，作用48h，取上清液，用于Elisa 实验(参照ELISA试剂盒方法进行）。细胞用PBS缓冲液洗涤3次，加入含有蛋白酶抑制剂和磷 酸酶抑制剂的RIPA裂解液150yL，冰上裂解30min，提取蛋白，用BCA蛋白定量检测试剂盒测 定各样本蛋白浓度。按比例与5X蛋白上样缓冲液混合均匀，煮沸5min。制胶，待胶凝结后， 加入电泳缓冲液，行10%丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝条带跑到凝胶底部结束电泳。切取彩 色预染蛋白分子量标准指示的相应蛋白合适范围的凝胶，转膜，5%脱脂奶粉封闭2h以上， 加入适当比例稀释的抗体，4°C孵育过夜，第二天取出复温，回收抗体，TBST震荡洗脱3次，每 次5min。加入适当比例稀释的二抗，37°C孵育2h，TBST震荡洗脱3次，每次5min。于暗室内显 影，以GAPDH为内参，用凝胶成像系统拍照并分析各条带光密度值。
[0055] 3.实验结果
[0056]为了进一步考察本发明的药物组合物抑制肺癌增殖的分子机制，运用过Western Blotting实验和Elisa考察本发明的药物组合物对NCI-H460细胞和肿瘤组织信号通路分子 和炎症分析的调控作用。结果表明本发明的药物组合物可以明显抑制肺癌细胞和组织内 MAPK信号通路中p38和JNK磷酸化的表达，对ERK没有明显的抑制作用（图3 )，而且对信号通 路P13K/AKT/mT0R中P13K亚型、AKT和mTOR分子没有表现出明显的抑制作用（图4)。说明本发 明的药物组合物通过抑制MAPK信号通路抑制肺癌细胞的增殖。同时，本发明的药物组合物 能够下调NCI-H460细胞和肿瘤组织中炎症相关蛋白⑶X-2、IKBa和NF-κΒ的表达，显著降低 了肿瘤组织中炎症因子ILl的含量，但对PTGES2、炎症因子IL6和TNFa没有影响（图5) JAPK 信号通路分子参与生长、发育、分裂、分化及细胞间的功能同步等多种细胞过程，在肿瘤的 发生发展中发挥着重要的作用。其中ERK1/2信号转导通路调控细胞生长和分化，JNK和 P38MAPK信号转导通路调控炎症与细胞凋亡等应激反应。NF-κΒ作为一种转录因子，参与了 炎症与免疫反应。促炎性细胞因子IL-I主要通过刺激炎症基因的表达，诱导C0X-2等效应蛋 白的表达，在炎症进程中扮演着重要的角色。因此上述结果阐明了本发明的药物组合物能 够通过抑制p38MAPK，JNK MPK信号通路和炎症相关蛋白，从而抑制肺癌细胞的增殖。
【主权项】
1. 一种具有协同抗肿瘤功效的药物组合物，其特征在于:按摩尔份数计，该药物组合物 的有效组分由1~3份苏尼替尼和10~20份二氢小檗碱组成。2. 根据权利要求1所述的具有协同抗肿瘤功效的药物组合物，其特征在于:该药物组合 物由有效组分和药用辅料混合而成，其剂型为胶囊或片剂。3. 权利要求1或2所述的具有协同抗肿瘤功效的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应 用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的抗肿瘤药物为治疗肺癌、乳腺癌、肝癌 和/或结肠癌的药物。5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞增殖 和转移的药物。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞^1_ H460、A549、NCI-H1299 增殖的药物。7. 如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够降低肿瘤体积和重 量的药物。8. 如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞血管 生成，抑制肿瘤细胞内信号通路分子表达，并抑制肿瘤细胞中炎症分子表达的药物。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞和肿 瘤组织内MAPK信号通路中p38和JNK磷酸化表达的药物。10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于:所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞和 肿瘤组织中炎症相关蛋白COX-2、IKBa和NF-κΒ的表达并降低肿瘤组织中炎症因子IL1含量 的药物。
【专利摘要】本发明提供了一种具有协同抗肿瘤功效的药物组合物及其应用，按摩尔份数计，该药物组合物由1～3份苏尼替尼和10～20份二氢小檗碱组成，按照比例混合后，添加辅料将其制备成胶囊或片剂进行使用。本发明发现了二氢小檗碱和苏尼替尼联合应用后具有良好的抗肿瘤效果，通过两者的药物协同作用能够使抗肿瘤的疗效得以最大化，可用于肺癌以及肝癌和结肠癌等肿瘤的治疗，具有很高的科研价值和良好的应用前景。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/404, A61K31/4375, A61P35/04
【公开号】CN105434435
【申请号】CN201510889592
【发明人】张彦民, 代秉玲, 王文婕, 马玉娇, 展颖转, 张东东, 刘瑞, 祁军鹏
【申请人】西安交通大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月7日