50kD。
[0070] 优选的，为了提高生物活性因子的产率，切向流超滤浓缩组件6由一块超滤膜包 组成，采用一块超滤膜包，分子量较大的生物活性因子（与超滤膜包规格接近的生物活性 因子）通过该超滤膜包后即可进入中间液体，避免在去除大分子杂质的过程中被截留，造 成生物活性因子的损失，从而提高生物活性因子的产率。
[0071] 需要说明的是，组成切向流超滤浓缩组件6的进口端2和透过端8压力差的大小 对于提纯浓缩的效率和复合生物活性因子的活性都具有较大影响，例如，压力差越大，组织 工程皮肤条件培养液透过切向流超滤浓缩组件6的速率也越大，从而提高滤液通量，进而 提高提纯浓缩的效率，但是，这也同时增加了切向流超滤浓缩组件6被堵塞的风险，以及， 会使得透过切向流超滤浓缩组件6时产生的剪切应力增加，较高的剪切应力可能会使部分 生物活性因子的活性降低，所以，为了保证较高的提纯浓缩的效率以及较高的生物活性，将 进口端2和透过端8压力差设为0· 9-1. 8bar。
[0072] 进一步优选的，为了提高中间液体包含的复合生物活性因子的产率，滞留液可以 任选地返回至原液桶1，例如，如图1所示，滞留液经过回流端10回流到原液桶1，并可以通 过稀释装置（图1中未示出）向原液桶1注入洗滤液，对原液桶1中的液体进行洗滤，其 中，洗滤液可以按照实际需要，分批的注入原液桶1，本发明实施例对此不进行具体限定。通 过洗滤液的洗滤，可以稀释原液桶1中滞留的大分子杂质的浓度，并对粘附在切向流超滤 组件6上的大分子杂质起到清洗作用，避免滞留的大分子杂质粘附在切向流超滤浓缩组件 6上，进一步的，可以清洗粘附在大分子杂质上的生物活性因子，提高生物活性因子的透过 率。其中，洗滤液可以为纯水或者PBS缓冲液。
[0073] 进一步优选的，在通过第一切向流超滤浓缩组件对组织工程皮肤条件培养液超滤 浓缩之前，还可以包括：将该组织工程皮肤条件培养液在4000-800()rpm转速下离心。优选 的，离心时间为5-7分钟。
[0074] 经过离心，可以去除较大颗粒的杂质（基本为肉眼可见的杂质）。因为较大颗粒的 杂质更容易粘附于切向流超滤组件6,而造成堵塞，并且使得切向流超滤组件6清洗困难。 所以，经过离心可减小在后续超滤浓缩除杂的阶段，切向流超滤组件6堵塞的风险，从而提 高生物活性因子的产率以及超滤的效率，并且，可以提高切向流超滤组件6的使用寿命，降 低生产成本。
[0075] 对于步骤3 : -种优选的实现方式为：将所述中间液体在0· 9-1. 8bar的压力下， 通过第二切向流超滤浓缩组件进行浓缩，收集滞留液，在滞留液的体积为所述中间液体的 1/10-1/20时，停止操作；
[0076] 将所述收集的滞留液在0. 9-1. 8bar的压力下，再次通过所述第二切向流超滤浓 缩组件，在滞留液的体积为所述中间液体的1/50-1/100时，停止操作，收集滞留液，得到包 含所述复合生物活性因子的浓缩液。
[0077] 组织工程皮肤条件培养液除了包含一些大分子蛋白杂质和细胞碎片外，还包含一 些化妆品或药品等的禁限用物质，例如氯化胆碱、氢化可的松、七水硫酸锌等，这些禁限用 物质一般属于小分子杂质。所以，还需要除去这些小分子杂质。
[0078] 优选的，可以选用超滤浓缩的方式去除这些小分子杂质，在对中间液体进行浓缩 的同时去除小分子杂质，提高效率，简化工艺。例如，同样可以利用图1所示的超滤浓缩的 装置，只是不同的是，该超滤浓缩装置的切向流超滤浓缩组件6的规格为3kD。
[0079] 优选的，切向流超滤浓缩组件6由3-5块串联的超滤膜包组成。将中间液体置于 原液桶1，组织工程皮肤条件培养液在蠕动泵3的作用下，从原液桶1经过进口端2进入切 向流超滤浓缩组件6。优选的，可以通过调压阀4将进口端压力表5(用于指示切向流超滤 浓缩组件6的进口端2与透过端8之间的压力差）调为0. 9-1. 8bar，使切向流超滤浓缩组 件6的进口端2和透过端8的压力差为0. 9-1. 8bar，组织工程皮肤条件培养液在该压力差 的作用下，流过切向流超滤浓缩组件6,这样，分子量大于超滤膜包规格的生物活性因子不 能透过切向流超滤浓缩组件6,形成滞留液；分子量小于切向流超滤浓缩组件6的小分子杂 质透过切向流超滤浓缩组件6,经透过端8进入滤液桶9,收集滞留液，得到包含所述复合生 物活性因子的浓缩液。为了提高滞留液包含的复合生物活性因子的产率，可以将中间液体 多次通过切向流超滤浓缩组件6,滞留液可以任选地返回至原液桶1，例如，如图1所示，滞 留液经过回流端10回流到原液桶1。
[0080] 一种优选的实现方式为，本实施例中选择中间液体两次通过切向流超滤浓缩组 件6,第一次滞留液的体积为中间液体的1/20-1/10,第二次滞留液的体积为中间液体的 1/50-1/100。
[0081] 另一种可能的实现方式为：本实施例中选择中间液体一次通过切向流超滤浓缩组 件6,在滞留液的体积为中间液体的1/50-1/100时，收集滞留液，得到包含所述复合生物活 性因子的浓缩液。
[0082] 需要说明的是，由于小分子杂质主要为氯化胆碱、氢化可的松、七水硫酸锌等，分 子量一般小于〇. 5kD，所以，本发明实施例组成切向流超滤浓缩组件6的超滤膜包的规格为 3kD〇
[0083] 优选的，为了使得防止生物活性因子在去除小分子杂质的过程中流失，切向流超 滤浓缩组件6由3-5块串联的超滤膜包组成，采用3-5块超滤膜包，分子量较大的生物活性 因子（与超滤膜包规格接近的生物活性因子）需要依次通过所有超滤膜包才能到达透过 端，所以，采用3-5块超滤膜包的方法，可以防止生物活性因子在去除小分子杂质的过程中 流失，提高生物活性因子的产量。
[0084] 实施例
[0085] 下面的实施例用来说明本发明，并不是想限制本发明的范围。
[0086] 实施例1
[0087] 收集30L的组织工程皮肤条件培养液，经灭菌后分装在6个容器中，每个容器的容 积为5L，将封装后的培养液于-20°C冻存。
[0088] 取1个容器的组织工程皮肤条件培养液，置于25°C水浴中化冻。
[0089] 将化冻后的组织工程皮肤条件培养液在0· 9bar压力下，使其流过30kD的超滤膜 包，并用1:1体积的洗滤液清洗未透过超滤膜包的组织工程皮肤条件培养液，收集透过液 (中间液体）l〇L。
[0090] 将上述步骤中所得中间液体在〇· 9bar压力下，流过3块串联的规格为3kD的超滤 膜包，收集滞留液。当滞留液的体积达到500mL时，即停止操作，得到复合生物活性因子的 初步浓缩液。
[0091] 利用上述步骤所得复合生物活性因子的初步浓缩液进行二次浓缩，当滞留液的体 积达到50mL时，即停止操作，得到复合生物活性因子的浓缩液。
[0092] 结论，所得浓缩液包含组织工程皮肤条件培养液83%以上种类的生物活性因子， 主要为hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF，并且浓缩液中的大 分子杂质和小分子杂质基本去除完全，复合生物活性因子的浓度较高，从而提高了对种类 繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率和产率。并且，获得的浓缩液的体积可以达到原 液体积的1/100。
[0093] 实施例2
[0094] 收集30L的组织工程皮肤条件培养液，经灭菌后分装在6个容器中，每个容器的容 积为5L，将封装后的培养液于-20°C冻存。
[0095] 取1个容器的组织工程皮肤条件培养液，置于25°C水浴中化冻。
[0096] 在4000rpm的转速下离心7分钟，收集上清液。
[0097] 将该上清液在0. 9bar压力下，流过30kD的超滤膜包，并用1:1体积的洗滤液清洗 未透过超滤膜包的组织工程皮肤条件培养液，收集透过液（中间液体）l〇L。
[0098] 将上述步骤中所得中间液体在1. 2bar压力下，流过3kD的中空纤维柱，收集滞留 液。滞留液的体积为l〇〇mL时，停止操作，得到复合生物活性因子的浓缩液。
[0099] 结论，所得浓缩液包含组织工程皮肤条件培养液86%以上种类的生物活性因子， 主要为hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF，并且浓缩液中的大 分子杂质和小分子杂质基本去除完全，复合生物活性因子的浓度较高，从而提高了对种类 繁多的复合生物活性因子提纯浓缩的效率和产率。并且，获得的浓缩液的体积可以达到原 液体积的1/50。
[0100] 实施例3
[0101] 收集5L组织工程皮肤条件培养液。<