一种高浓度硒麦饭石浓缩液的提取方法及其抗氧化作用
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学、免疫学、细胞生物学和药理学领域，具体涉及到一种从麦饭石中 提取高浓度硒的方法，并研究了此高浓度硒的麦饭石浓缩液对H2O2损伤的PC12细胞的保护 作用研究。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD)最显著的神经病理学特征是：在大脑 皮层和海马区域出现细胞外老年斑（SP)、细胞内神经原纤维缠结（NFThAP是老年斑的主 要组成成分，在AD患者脑中广泛沉积，在AD的发生发展过程中起关键性作用。氧化应激损 伤是Αβ神经毒性的重要机制之一，研究发现微摩尔质量浓度的Αβ可引起体外培养的神 经元过氧化氢（H 2O2)生成增多，进而导致神经元损伤和凋亡。H2O2介导了 Αβ的神经毒性。 在研究防治AD的药物过程中，H2O2诱导PC12细胞氧化损伤模型是常用的细胞模型之一。
[0003] AD的具体病因及发病机制至今仍不清楚，但其发病率，除了表现出家族性特征，即 与遗传因素有关外，越来越多的研究表明，还与体内微量元素的代谢异常以及一些神经毒 性金属元素在人体中的累积有着密切关系。研究表明，补充Se对AD是有益的，如：Se可以 有效的阻止AD大鼠的认知能力下降以及氧化损伤；Se可特异性激活使AD大鼠的PP2A磷 酸酶，使磷酸化Tau蛋白含量降低，改善大鼠的空间学习记忆能力；Se还可以减缓AD大鼠 Tau蛋白的病理学特征、神经变性以及功能缺陷。根据法国科学家Bertrand的"最适营养 浓度定律":微量元素同其他元素一样，受体内平衡机制的调节和控制，摄入过量和不足均 会所引起不良后果；而且某种元素在体内的失衡必将影响到其他元素的生理功能，因此，调 节体内某种已失衡的元素时，也要尽可能使其他元素处于最适营养浓度范围。
[0004] 麦饭石在我国多个地区存在，因产地不同，其成分略有差异。不同产地麦饭石的溶 出微量元素及含量在相同条件下不尽相同，即使同一产地的麦饭石在不同条件下溶出的元 素含量也不相同。我们研究发现，当100目的IOg桂平麦饭石浸入常温下的100mL去离子 水中30分钟后，再在80°C条件下回流浓缩60分钟，所得的各元素浓度（ppm)经ICP-AES测 定为 Fe 0· 068, Cu0.0 22, Mn 0· 049, Zn 0· 037, Se 0· 015,以及 Al 0· 001。我们研究发现， 此麦饭石浓缩液具有防治AD的潜在可能，原因是其能调节AD大鼠海马区内已异常变化的 Al、Fe、Cu、Mn、Zn和Se含量，使其尽可能的达到正常对照组水平。
[0005] 为提高麦饭石浓缩液中硒的浓度，采用正交设计实验法得到了最佳实验条件；并 研究此浓缩液对PC12细胞是否具有抗氧化作用。
【发明内容】
[0006] (I) ICP-AES测定麦饭石水浸液中Se含量结果如下表：
[0007]
[0008] 结果分析表明，Se的最佳溶出条件为：麦饭石粒度10目，浓度15(以麦饭石质量 除以水的质量表示），常温浸泡时间60min，加热温度70°C，加热时间20min，pH值6. 00。此 条件下各元素的浓度（ppm)为：Fe 0.099, Cu 0.035, Mn 0.051，Zn 0.019, Se 0.028, Al 0. 000〇
[0009] (2)当H2O2浓度超过50 μ M，或作用时间延长，PC12细胞存活率逐渐降低（如图 1，2)，而LDH释放量逐渐增加（如图4,5)。100μΜ H2O2处理PC12细胞24h，细胞存活率 明显下降，而LDH释放量增加。不同浓度的麦饭石浓缩液预孵育PC12细胞12h后，再加入 100 μ MH2O2共同作用24h，可明显减轻细胞损伤，提高细胞存活率（如图3)，并降低LDH释放 量（如图6)。100μΜ H2O2作用于PC12细胞4h，可明显降低SOD和GSH-Px活力，增加 MDA 含量（如图7,8,9)，不同浓度的麦饭石浓缩液预孵育PC12细胞12h后，再加入100 μ M H2O2 共同作用24h，可显著提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量（如图7,8,9)。因此，高浓度 硒的麦饭石浓缩液可以有效的拮抗H 2O2对PC12细胞的氧化损伤。
【附图说明】
[0010] 图1不同浓度H2O2作用PC12细胞24h量效图，n = 5,与ΟμΜ H2O2比较， *Ρ < 0. 05)
[0011] 图210(^]?!1202处理？(：12细胞存活率时效图（1±^，11 = 5，与011比较，朴<0.05)
[0012] 图3麦饭石对H2O2 (100 μ M，24h)损伤PC12细胞存活率的影响（[±5, η = 5,与对 照组比较*Ρ < 0· 01，与H2O2组比较#P < 0· 05)
[0013] 图4不同浓度H2O2作用PC12细胞24h量效图G±s，n = 5,与OyM H2O2比较， *Ρ < 0. 05
[0014] 图5100μΜ H2O2对PC12细胞LDH释放量时效图（?±_?，η = 5,与Oh比较，*Ρ < 0. 05)
[0015] 图6麦饭石对H202100 yM，24h损伤PC12细胞LDH释放量的影响G±_y，n = 5,与 对照组比较*P < 〇· 01，与H2O2组比较#P < 0· 05)
[0016] 图7麦饭石对!1202 (10(^厘，411)损伤的？(：12细胞300的影响（[±:?，11 = 5，与对 照组比较*P < 0· 01，与H2O2组比较#P < 0· 05)
[0017] 图8麦饭石对H202(100 yM，4h)损伤的PC12细胞GSH-Px的影响（[±_?，η = 5,与 对照组比较*Ρ < 0· 01，与H2O2组比较#P < 0· 05)
[0018] 图9麦饭石对!1202 (10(^厘，411)损伤的？(：12细胞1^的影响（[±1?,11 = 5，与对 照组比较*Ρ < 0· 01，与H2O2组比较#P < 0· 05)
【具体实施方式】
[0019] 为从细胞水平进一步研究麦饭石防治AD的物质基础，我们借助正交设计助手II V3. 1软件设计实验，以Se含量为麦饭石溶出性能指标，以粒度、浓度、常温浸泡时间、加热 温度、加热时间及PH值等六个因素进行正交设计，研究了麦饭石最佳溶出条件。并以过氧 化氢（H 2O2)为工具药，建立AD的氧化应激模型。观察高硒麦饭石浓缩液的保护作用。具体 实施方式如下：
[0020] (1)以Se含量为麦饭石溶出性能指标，研究麦饭石最佳溶出条件：
[0021] 用电感耦合等离子发射光谱（ICP-AES)法测定麦饭石水浸液中Se含量。以Se含 量为麦饭石溶出性能指标，以粒度、浓度、常温浸泡时间、加热温度、加热时间及PH值等六 个因素进行正交设计。溶出介质为由三重蒸馏水所制备的二次去离子水。借助正交设计助 手IIV3. 1软件设计实验，正交表选用L25-5-6,即5水平6因素，需做25个实验。输入每个 实验的Se含量后，便可得到最佳实验条件。测定此条件下麦饭石水浸液中Fe、Cu、Ζη、Μη、 Se和Al含量。本实验的因素水平表如下：
[0022]
[0023] (2)用不同浓度（25、50、100、200、400μΜ)的 H2O2 处理 PC12 细胞 24h，100ymol/L H2O2处理PC12细胞不同时间（3、6、12、24及48h)，建立细胞损伤模型。用低浓度（原高硒 麦饭石浓缩液稀释100倍）、中浓度（原高硒麦饭石浓缩液稀释10倍）、高浓度（原高硒麦 饭石浓缩液）的麦饭石浓缩液预孵育PC12细胞12h后，再加入100 μ mol/L H2O2共同作用 24h以探讨麦饭石的保护作用。用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞存活率，用 乳酸脱氢酶（LDH)测试盒检测乳酸脱氢酶（LDH)漏出率；用超氧化物歧化酶（SOD)测试盒 测定SOD活力，用谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX)测试盒测定GSH-PX活力，用丙二醛（MDA) 测试盒测定MDA含量。
【主权项】
1. 一种高浓度硒麦饭石浓缩液的提取方法及其抗氧化作用，其特征在于：以Se含量为 麦饭石溶出性能指标，以粒度、浓度、常温浸泡时间、加热温度、加热时间及PH值等六个因 素进行正交设计；得到最佳实验条件为：麦饭石粒度10目，浓度15 (以麦饭石质量除以水 的质量表示），常温浸泡时间60min，加热温度70°C，加热时间20min，pH值6. 00 ;此条件下 各元素的浓度（ppm)为：Fe0? 099,Cu0.035，Mn0.051，Zn0.019,Se0.028,Al0?000;并 研究了此麦饭石浓缩液对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用，结果显示不同浓度的麦饭石浓 缩液可明显提高细胞存活率，并降低LDH释放量；可显著提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA 含量。2. 根据权利要求1所述的高浓度硒麦饭石浓缩液的提取方法，其特征在于所用的麦饭 石采自广西桂平市西山镇。3. 根据权利要求1所述的高浓度硒麦饭石浓缩液的提取方法，其特征在于充分考虑多 因素对麦饭石微量元素溶出的影响，包括麦饭石粒度、浓度、常温浸泡时间、加热温度、加热 时间及PH值等六个因素。4. 根据权利要求1所述的高浓度硒麦饭石浓缩液的提取方法，其特征在于采用正交设 计法设计实验，正交表选用L25-5-6,即5水平6因素，需做25个实验。5. 根据权利要求1所述的高浓度硒麦饭石浓缩液的提取方法，其特征在于Se的最佳 溶出条件为：麦饭石粒度10目，浓度15 (以麦饭石质量除以水的质量表示），常温浸泡时间 60min，加热温度70°C，加热时间20min，pH值6. 00 ;此条件下各元素的浓度（ppm)如下：Fe 0. 099,Cu0. 035,Mn0. 051,Zn0. 019,Se0. 028,Al0.000。6. 根据权利要求1所述的高浓度硒麦饭石浓缩液的提取方法，其特征在于各元素的浓 度利用ICP-AES分析仪进行测定。7. 根据权利要求1所述的高浓度硒麦饭石浓缩液对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用， 其特征在于用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞存活率，用乳酸脱氢酶（LDH) 测试盒检测乳酸脱氢酶（LDH)漏出率；用超氧化物歧化酶（SOD)测试盒测定SOD活力，用谷 胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX)测试盒测定GSH-PX活力，用丙二醛（MDA)测试盒测定MDA含 量。8. 根据权利要求1所述的高浓度硒麦饭石浓缩液对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用， 其特征在于不同浓度的麦饭石浓缩液可明显提高细胞存活率，并降低LDH释放量；可显著 提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量。9. 根据权利要求1所述的高浓度硒麦饭石浓缩液对H2O2损伤的PC12细胞的保护作用， 其特征在于高浓度硒的麦饭石浓缩液可有效地拮抗H2O2对PC12细胞的氧化损伤。
【专利摘要】本发明涉及一种高浓度硒麦饭石浓缩液的提取方法及其抗氧化作用，属于化学、免疫学、细胞生物学和药理学领域。为提高麦饭石浓缩液中硒的浓度，采用正交实验得到了最佳实验条件：粒度10目，浓度15(以麦饭石质量除以水的质量表示)，常温浸泡时间60min，加热温度70℃，加热时间20min，pH值6。此条件下浓缩液各元素浓度(ppm)为：Fe 0.099，Cu0.035，Mn 0.051，Zn 0.019，Se 0.028，Al 0.000。此浓缩液可明显提高PC12细胞存活率，降低LDH释放量；并可显著提高SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量。此浓缩液对PC12细胞具有抗氧化作用。
【IPC分类】A61K33/04, A61K33/34, A61P39/06, C12Q1/02, A61P25/28
【公开号】CN104922150
【申请号】CN201410106738
【发明人】蒋凌风, 廖海琳
【申请人】广西中医药大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2014年3月21日