一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学工程中的组织工程学领域，尤其涉及一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法。
【背景技术】
[0002]下咽癌是上消化道和上呼吸道最致命的肿瘤之一，临床统计5年生存率在25%?40%，目前临床上采用以手术为主结合放、化疗的综合治疗方法。对于早期患者切除病灶后可以直接关闭咽腔，而对于中晚期患者因切除面积大，常需要依靠组织移植重建来改善咽喉部功能。传统的可移植组织为来自患者自体的游离空肠、结肠、胸大肌皮瓣、前臂皮瓣等，此类移植不仅来源有限、对血管吻合要求高，而且造成了医源性损伤，容易引起术后并发咽漏、感染等问题。
[0003]随着组织工程学的兴起，使用人工下咽瓣膜应用于咽喉部功能重建成为可能。人工下咽瓣膜由于可经体外培养、瓣膜大小不受限制等优点，可用于弥补传统修补手术的不足。医用聚氨酯因其良好的力学强度和弹性，以及良好的生物相容性，被认为是一种较好的生物材料，曾被研究用于体内软组织瓣膜的替代物。但是这类人工瓣膜在使用后发现其降解速度太慢，或者几乎不降解，移植到患者的咽喉部后，随着新生组织的再生此人工瓣膜不能同步降解，反而成为异物存在于下咽部，阻碍新生瓣膜生长的同时，还会产生免疫排斥、炎症等不良反应。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种力学性能好、降解速度适中、符合人体机能需求的组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法，包括以下具体步骤:
(1)、将己二胺溶于正丙醇中得到浓度为0.01?0.10g/ml的己二胺/正丙醇溶液，将丝素蛋白溶于水中得到浓度为I?I Og/L的丝素蛋白水溶液，备用；
(2)、取5?1g聚乙二醇、4.5?1gε-己内酯，以及占两者总质量0.1?1.0%的乙酰丙酮铁，置于干燥的三口烧瓶中，在干燥的氮气保护下，在120?140°C的温度下反应18?40h，得到聚己内酯一聚乙二醇一聚己内酯三嵌段共聚物，即预聚物；
(3 )、在反应瓶中将4?1g上述预聚物溶于43?105g的I，4-二氧六环中，在干燥氮气的保护下，在上述反应瓶中加入0.9?2.Sg的六亚甲基二异氰酸酯形成溶液体系，向此溶液体系中加入占预聚物质量0.1?1.0%的乙酰丙酮铁，升温至70°C，反应I?3h后停止加热，待体系的温度降至室温，再往此体系中加入含0.13?0.34g三羟甲基丙烷的5毫升I，4_二氧六环溶液，反应5?10h，移出反应瓶，在室温下成膜，得到可生物降解的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；
(4)、取上述平面膜，用体积分数为75%的医用酒精浸洗15?30min，室温晾干，然后将此平面膜浸入步骤(I)准备好的己二胺/正丙醇溶液中，在35°C的温度下浸泡I?2min，取出后用去离子水浸洗3次，每次5?lOmin，再将平面膜在质量浓度为0.5?2%的戊二醛水溶液中浸泡3?6h，取出后用去离子水浸洗3次，每次5?lOmin，最后将平面膜浸入步骤(I)准备好的丝素蛋白水溶液中，在4°C的温度下反应12?24h，取出后用去离子水浸洗3次，每次5?10min，37°C下真空烘干，得到表面接枝丝素蛋白的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；
(5)、取离体的下咽组织，用含有青霉素和链霉素的无菌PBS混合液冲洗，其中青霉素在PBS混合液中的浓度为1000U/mL，链霉素在PBS混合液中的浓度为lmg/mL，然后将下咽组织在体积分数为75%的医用酒精中浸洗5?10s，取出后用上述PBS混合液冲洗，再将下咽组织浸在100ppm的次氯酸钠中I?2min，取出后用上述PBS混合液冲洗，然后将下咽组织切成I?3mm3的组织小块贴附于培养皿中，放置30min后，往培养皿中加入含有胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基并淹没下咽组织小块，其中:胎牛血清在DMEM培养基中的体积分数为10%、青霉素的浓度为100U/mL、链霉素的浓度为100mg/L，l天后更换上述DMEM培养基，之后每隔2天更换DMEM培养基，约一周后在下咽组织小块的周围长出下咽成纤维细胞，待下咽成纤维细胞长至40?60%时弃去下咽组织块，继续培养下咽成纤维细胞至80%，传代，取传至3?5代的原代下咽成纤维细胞种植于步骤(4)所制得的丝素蛋白接枝的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜上，悬液浓度为5 X 14/毫升，得到组织工程化的人工下咽瓣膜。
[0006]所述的步骤(5)中，离体的下咽组织为人的下咽组织或动物下咽组织。
[0007]所述的动物下咽组织取自猪、狗、羊、兔等哺乳动物。
[0008]与现有技术相比，本发明的优点是本方法所制得的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜其力学强度好、弹性好，适合作为软组织的人工下咽瓣膜的基材，在移植到患者的咽喉部后，由于在平面膜的组成成份中含有亲水的聚乙二醇和易发生降解的己内酯而使其降解性能优于医用聚氨酯，随着新生瓣膜组织的再生，交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜逐渐降解；另一方面，在此平面膜表面上接枝丝素蛋白后，此人工下咽瓣膜生物相容性更优，与周围组织相亲性更好，更易融合于体内环境，符合人体的下咽组织机能的需求。
【具体实施方式】
[0009]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0010]实施例一:一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法，包括以下具体步骤:
(1)、将己二胺溶于正丙醇中得到浓度为0.03g/ml的己二胺/正丙醇溶液，将丝素蛋白溶于水中得到浓度为2g/L的丝素蛋白水溶液，备用；
(2)、取1g聚乙二醇、5g己内酯，以及占两者总质量1.0%的乙酰丙酮铁，置于干燥的三口烧瓶中，在干燥的氮气保护下，在120°C的温度下反应20h，得到聚己内酯一聚乙二醇一聚己内酯三嵌段共聚物，即预聚物；
(3)、在反应瓶中将4g上述预聚物溶于45g的I，4_二氧六环中，在干燥氮气的保护下，在上述反应瓶中加入1.0g的六亚甲基二异氰酸酯形成溶液体系，向此溶液体系中加入占预聚物质量0.2%的乙酰丙酮铁，升温至70°C，反应Ih后停止加热，待体系的温度降至室温，再往此体系中加入含0.15g三羟甲基丙烷的5毫升I，4_二氧六环溶液，反应5h，移出反应瓶，在室温下成膜，得到可生物降解的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；
(4)、取上述平面膜，用体积分数为75%的医用酒精浸洗30min，室温晾干，然后将此平面膜浸入步骤(I)准备好的己二胺/正丙醇溶液中，在35°C的温度下浸泡2min，取出后用去离子水浸洗3次，每次5min，再将平面膜在质量浓度为0.8%的戊二醛水溶液中浸泡6h，取出后用去离子水浸洗3次，每次5min，最后将平面膜浸入步骤(I)准备好的丝素蛋白水溶液中，在4°C的温度下反应15h，取出后用去离子水浸洗3次，每次5min，37°C下真空烘干，得到表面接枝丝素蛋白的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；
(5)、取离体的人的下咽组织，用含有青霉素和链霉素的无菌PBS混合液冲洗，其中青霉素在PBS混合液中的浓度为1000U/mL，链霉素在I3BS混合液中的浓度为lmg/mL，然后将下咽组织在体积分数为75%的医用酒精中浸洗10s，取出后用上述PBS混合液冲洗，再将下咽组织浸在100ppm的次氯酸钠中2min，取出后用上述PBS混合液冲洗，然后将下咽组织切成Imm3的组织小块贴附于培养皿中，放置30min后，往培养皿中加入含有胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基并淹没下咽组织小块，其中:胎牛血清在DMEM培养基中的体积分数为10%、青霉素的浓度为100U/mL、链霉素的浓度为100mg/L，l天后更换上述DMEM培养基，之后每隔2天更换DMEM培养基，约一周后在下咽组织小块的周围长出下咽成纤维细胞，待下咽成纤维细胞长至60%时弃去下咽组织块，继续培养下咽成纤维细胞至80%，传代，取传至3代的原代下咽成纤维细胞种植于步骤(4)所制得的丝素蛋白接枝的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜上，悬液浓度为5 X 14/毫升，得到组织工程化的人工下咽瓣膜。
[0011]实施例二: 一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法，包括以下具体步骤:
(1)、将己二胺溶于正丙醇中得到浓度为0.1g/ml的己二胺/正丙醇溶液，将丝素蛋白溶于水中得到浓度为8g/L的丝素蛋白水溶液，备用；
(2)、取5g聚乙二醇、9g己内酯，以及占两者总质量0.5%的乙酰丙酮铁，置于干燥的三口烧瓶中，在干燥的氮气保护下，在130°C的温度下反应24h，得到聚己内酯一聚乙二醇一聚己内酯三嵌段共聚物，即预聚物；
(3)、在反应瓶中将6g上述预聚物溶于70g的I，4_二氧六环中，在干燥氮气的保护下，在上述反应瓶中加入2g的六亚甲基二异氰酸酯形成溶液体系，向此溶液体系中加入占预聚物质量0.6%的乙酰丙酮铁，升温至70°C，反应2h后停止加热，待体系的温度降至室温，再往此体系中加入含0.22g三羟甲基丙烷的5毫升I，4_二氧六环溶液，反应8h，移出反应瓶，在室温下成膜，得到可生物降解的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；
(4)、取上述平面膜，用体积分数为75%的医用酒精浸洗15min，室温晾干，然后将此平面膜浸入步骤(I)准备好的己二胺/正丙醇溶液中，在35°C的温度下浸泡lmin，取出后用去离子水浸洗3次，每次7min，再将平面膜在质量浓度为2%的戊二醛水溶液中浸泡4h，取出后用去离子水浸洗3次，每次8min，最后将平面膜浸入步骤(I)准备好的丝素蛋白水溶液中，在4°C的温度下反应24h，取出后用去离子水浸洗3次，每次10min，37°C下真空烘干，得到表面接枝丝素蛋白的交联型聚己内酯一聚乙二醇一聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；
(5)、取离体的人的下咽组织，用含有青霉素和链霉素的无菌PBS混合液冲洗，其中青霉素在PBS混合液中的浓度为1000U/mL，链霉素在I3BS混合液中的浓度为lmg/mL，然后将下咽组织在体积分数为75%的医用酒精中浸洗7s，取出后用上述PBS混合液冲洗，再将下咽组织浸在100ppm的次氯酸钠中Imin，取出后用上述I3BS混合液冲洗，然后将下咽组织切成3mm3的组织小块贴附于培养皿中，放置30min后，往培养皿中加入含有胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基并淹没下咽组织小块，其中:胎牛血清在DMEM培养基中的体积分数为10%、青霉