治疗指数SI5。评价，SI5。= CC5Q/IC5。，独立实验重复两次，结 果取两次平均值。
[0044] 实验结果如下：
[0045] 表1华蟾酥毒基对RDS细胞的细胞毒性及对EV71的抑制率
[0046]
[0049] 表3酯蟾毒配基对RDS细胞的细胞毒性及对EV71的抑制率
[0050]
[0051] 表4酯蟾毒配基对RD细胞的细胞毒性及对EV71的抑制率
[0052]
[0053] 表5华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对RDS细胞的治疗效果
[0056] 表6华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对RD细胞的治疗效果
[0058] 这些结果结果表明：华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对RDS细胞株的细胞毒性很低（CC5。 分别为1277. 24nM和1385. 41nM)，而且对EV71造成的细胞病变效应有一定的抑制作用； 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在RDS细胞中对EV71的半数抑制浓度IC5。分别为10. 94nM和 218. 31nM(表5);可用治疗指数SI5。综合评价华蟾酥毒基和酯蟾毒配基药物抗EV71病毒的 效果，当SI M>2时为有效，SI5。= 1时既有效又有毒，SIM〈1时为毒性作用较强，华蟾酥毒基 和酯蟾毒配基在RDS细胞中对EV71的SI 5。分别为116. 73和6. 35,表明华蟾酥毒基和酯蟾 毒配基是低毒性且具有抗EV71作用的药物。
[0059] 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对RD细胞株也具有较低的细胞毒性（CC5。分别为 58. 05nM和1291. 66nM)，它们对EV71造成的细胞病变效应也有一定的抑制作用（但效果不 明显；华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在RD细胞中对EV71的半数抑制浓度IC 5。分别为31. 05nM 和433. 84nM (表6));根据华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的治疗指数SI5。进行综合评价，发现华 蟾酥毒基和酯蟾毒配基在RD细胞中对EV71的SI 5。分别为1. 87和0. 34, SI5。酯蟾毒配基 在RD细胞中对EV71的SIM〈1，华蟾酥毒基和酯蟾毒配基有较强的毒性作用。
[0060] 实施例3 :华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对EV71造成的空斑形成的抑制作用
[0061] 取对数生长期的RDS细胞，以6X IO5个/孔的浓度接入12孔培养板，培养24小 时。
[0062] 各孔吸去培养基，加入300 μ L含不同浓度华蟾酥毒基的DMEM细胞培养液使其终 浓度为62. 50ηΜ, 31. 25ηΜ, 15. 63ηΜ, 7. 81ηΜ, 3. 90ηΜ或加入300 μ L含不同浓度酯蟾毒配基 的DMEM细胞培养液，使其终浓度为1563ηΜ, 781ηΜ, 391ηΜ, 195ηΜ, 98ηΜ，每个浓度设3个复 孔；加药的同时各孔加入300 μ L EV71 (100 PFU/孔）病毒感染；并设置仅加入DMEM细胞培 养液的细胞对照及仅加入加 EV71感染的病毒对照；继续培养细胞1小时后，吸去培养液上 清并用无菌PBS漂洗细胞两遍，向加药组加入含相应浓度华蟾酥毒基或酯蟾毒配基的1 % 琼脂2 % FBS-DMEM培养基，向细胞对照和病毒对照组加入1 %琼脂2 % FBS-DMEM培养基，来 覆盖细胞；待培养基凝固后，倒置培养72小时，观察空斑；观察后用结晶紫（购自北京鼎国 公司）染色，计数空斑。
[0063] EV71空斑形成抑制率=[(感染EV71对照组空斑数-感染EV71并给药组空斑 数）/感染EV71对照组空斑数]X 100% ;根据不同浓度的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对每孔 空斑形成的抑制率分别算出抑制率为50%时的药物浓度，用EC5。表示。
[0064] 实验结果如下：
[0065] 表7华蟾酥毒基对EV71空斑形成的抑制率
[0066]
[0070] 结果表明：华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对EV71的空斑形成均有明显的抑制作用，且 呈浓度依赖性；经计算，华蟾酥毒基在RDS细胞中对EV71的半数空斑抑制浓度EC 5。分别为 24. 99nM ;酯蟾毒配基在RDS细胞中对EV71的半数空斑抑制浓度EC5。分别为330nM，与实施 例2中计算出的半数抑制浓度IC 5。很接近。该实验再次证明华蟾酥毒基和酯蟾毒配基是具 有抗EV71作用的药物。
[0071] 实施例4 :华蟾酥毒基/酯蟾毒配基对RDS细胞中EV71病毒衣壳蛋白合成的抑制 作用
[0072] 取对数生长期的RDS细胞，以2. 5 X IO6个/瓶的浓度接入小培养瓶中，培养24小 时。
[0073] 各瓶加入2. 5mL含不同浓度华蟾酥毒基的10% FBS-DMEM细胞培养液，使其终浓度 为 125nM, 62. 50nM, 31. 25nM, 15. 63nM, 7. 81nM, 3. 90nM或加入 2. 5mL 含不同浓度酯蟾毒配基 的10% FBS-DMEM细胞培养液，使其终浓度为1563nM, 781nM, 391nM, 195nM, 98nM，每个浓度 设3个复瓶；加药的同时各孔加入2. 5mL EV71 (感染复数（MOI) = I)病毒感染；并设置仅 加入10% FBS-DMEM细胞培养液的细胞对照及仅加入加 EV71感染的病毒对照；继续培养细 胞12小时后，吸去培养液上清并用无菌PBS漂洗细胞两遍，用200 μ L无菌PBS重悬并在液 氮中反复冻融3次，1000 Orpm离心lmin，取上清用EV71抗原ELISA检测试剂盒（购自北京 天成新脉生物技术有限公司）检测病毒衣壳蛋白浓度变化情况。药物对EV71病毒衣壳蛋 白抑制率=[(感染EV71组衣壳蛋白水平-感染EV71并给药组衣壳蛋白水平）/感染EV71 组衣壳蛋白水平]X 100%
[0074] 实验结果如下：
[0075] 表9华蟾酥毒基对EV71病毒衣壳蛋白合成的抑制率
[0080] 结果表明：华蟾酥毒基和酯蟾毒配基均对EV71病毒衣壳蛋白的合成有抑制作用， 且呈浓度依赖性；从分子水平上进一步证明华蟾酥毒基和酯蟾毒配基具有抗EV71作用，可 以用作预防和治疗抗EV71的药物。
[0081] 参考文献：
[0082] I. Zhu，Q. C.，Wang，Υ·，Liu，Υ· Ρ·，Zhang，R. Q.，Li, Χ·，Su，W. Η·，Long，F.，Luo, Χ· D.,Peng,T.,2011. Inhibition of enterovirus 71 replication by chrysosplenetin and penduletin. European journal of pharmaceutical sciences: official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences 44, 392-398.
[0083] 2. Cui X，Inagaki Y，Xu H，Wang D，Qi F，Kokudo N，Fang D，Tang W.，2010. Anti-hepatitis B virus activities of cinobufacini and its active components bufalin and cinobufagin in HepG2. 2. 15 cells.Biol Pharm Bull33, 1728-1732
[0084] 3. Li X，Fan P，Jin J，Su W，An D，Xu L，Sun S，Zhang Y，Meng X，Gao F，Kong Wj Jiang C. ,2013. Establishment of cell lines with increased susceptibility to EV71/CA16 by stable overexpression of SCARB2. Virol JlO (250)
[0085] 所有的参考文献以引用的方式全文纳入本文。
【主权项】
1. 华蟾酥毒基在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中的用途。2. 酯蟾毒配基在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中的用途。3. 权利要求1或2的用途，其中所述受试者是人，优选地，所述受试者为16岁以下的儿 童，更优选地，所述受试者为5岁以下的儿童。4. 权利要求1或2的用途，其中所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒71型的 药物，优选地，所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。5. 用华蟾酥毒基抑制由肠道病毒71型引起的细胞病变效应的方法，所述方法包括使 浓度为5-3000nM的华蟾酥毒基与细胞接触，优选地，华蟾酥毒基的浓度为10-250nM，更优 选地，华蟾酥毒基的浓度为15-70nM。6. 用华蟾酥毒基抑制由肠道病毒71型引起的空斑形成的方法，所述方法包括使浓度 为5-3000nM的华蟾酥毒基与细胞接触，优选地，华蟾酥毒基的浓度为10-500nM，更优选地， 华蟾酥毒基的浓度为15_125nM。7. 用酯蟾毒配基抑制由肠道病毒71型引起的细胞病变效应的方法，所述方法包括使 浓度为50-60000nM的酯蟾毒配基与细胞接触，优选地，酯蟾毒配基的浓度为98-12500nM， 更优选地，酯蟾毒配基的浓度为195-3000nM，最优选地，酯蟾毒配基的浓度为250-1500nM。8. 用酯蟾毒配基抑制由肠道病毒71型引起的空斑形成的方法，所述方法包括使浓度 为50-3000nM的酯蟾毒配基与细胞接触，优选地，酯蟾毒配基的浓度为100-1500nM。9. 权利要求5-8任一项的方法，其中所述细胞是人细胞。10. 权利要求9的方法，其中所述细胞是是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒71 型受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。
【专利摘要】本申请涉及华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的新用途，具体地，涉及华蟾酥毒基和酯蟾毒配基用于制备用于预防和治疗手足口病的药物的用途，尤其是用于制备抗肠道病毒71型药物的用途。
【IPC分类】A61P31/14, A61K31/585
【公开号】CN105560254
【申请号】CN201410531039
【发明人】苏维恒, 姜春来, 孔维, 陈嘉雯
【申请人】吉林大学, 长春百克生物科技股份公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月9日