松脂素-4_〇-β-〇-葡萄吡喃糖苷[( + )pinoresinol-4-0-3_D-gluc0-pyranoside]〇
[0072] 化合物6为（+ )8,9'_二羟基-松脂素-4'-0-e_D-葡萄吡喃糖苷[(+ )8,9'_ Dihydroxypino-resinoH'-O-P-D-glucopyranoside] 〇
[0073] 化合物7为（ + )8-羟基-松脂素_4,4 '-Ο-β-D-双葡萄吡喃糖苷[(+ )8_ HydroxypinoresinolK-di-O-P-D-glucopyranoside] 〇
[0074] 化合物 8 为(-)-丁 香脂素-4_〇-β-〇-吡喃葡萄糖苷[(-)-syringaresinol-4-0-3_ D-glucopyranoside]，白色粉末。1H-NMR(DMS0-d6,400MHz)S :6.66(2H，s，H-2,6)，6.60(2H， s?H-27?67 )?4.89(lH?d?J = 5.2Hz?H-7)?4.66(lH?d?J = 4.0Hz?H-7/ ) ?3. ll(2H?m?H-8? 8'），4.28(2H，m，H-9a，9/a)，3.78(2H，m，H-9b，9/b)，3.76(6H，s，2X0CH 3)，3.75(6H，s，2X OCH3)，4·95(1H，glC-H-1〃），3·06~3.58(4H，m，H-2〃，3〃，4〃，5〃）。
[0075] 化合物 9 为（ + )_ 中脂素-4-〇-f3_D-吡喃葡糖糖苷[( + )-medioresinol-4-(H3-D-glucopyranoside]，白色粉末。1Η-匪R(DMS〇-d 6，400MHz)δ: 6 · 95(1H，d，J= 1 · 6Hz，H-2')， 7.04(lH,dJ = 8.4Hz,H-5/ ),6.84(lH,ddJ=1.6,8.4Hz,H-6/ ),6.60(2H,s,H-2,6),4.67 (lH,d,J = 3.6Hz,H-7),4.60(lH,dJ = 4.0Hz,H-7/ ) ,3.04(2H,m,H-8,8/ ),4.14(2H,m,H-9a，9/a)，3.93(2H，m，H-9b，9/b)，3.77(3H，s，0CH3)，3.75(6H，s，2X0CH 3)，4.87(lH，d，J = 7·2Hz，glc-H-l〃），3·04~3·51(4H，m，H-2〃，3〃，4〃，5")。
[0076] 化合物l〇为橄榄树脂素-4 '-Ο-β-D-葡萄糖苷[0114 1-4'-0-0-0-glucopyranoside]。化合物11为橄榄树脂素-4-〇-β-?-葡萄吡喃糖苷[olivil-4-0-0-D-glucopyranoside]〇
[0077] 化合物12为落叶松脂醇-4,4'-(H3-D-双葡萄吡喃糖苷[lariciresinol-4,4'_di-Ο-β-D-glucopy-ranoside]〇
[0078] 化合物1 3为8 -羟基-落叶松脂醇-4 ' - 0 - β - D -葡萄吡喃糖苷[8_ Hydroxylariciresinol^'-O-P-D-glucopyranoside] 〇
[0079] 化合物14为落叶松脂醇-4-〇-0-〇-葡萄吡喃糖苷[1&4(^^811101-4-0-0-0-glucopyranoside]〇
[0080] 实施例7
[0081] 发明人从老年性痴呆以及阿尔茨海默病(AD)发病的异质性及多因性出发，将脑衰 老及血管危险因子(高血压、动脉粥样硬化和短暂性脑缺血发作等)导致的脑低灌注和Αβ蛋 白脑病理病变相结合，利用腹腔注射半乳糖促老化与反复结扎双侧颈总动脉致脑低灌注及 鼠脑室一次性注射β淀粉样蛋白制作异质性及多因性老年性痴呆以及阿尔茨海默病 (Heterogeneitys/Multi-factors 'Alzheimer' s Disease，H/MAD)模型，来探讨杜仲提取物 对H/MAD模型大鼠空间学习记忆能力的影响，同时测定H/MAD模型大鼠血清中总抗氧化能力 (T-A0C)和乙酰胆碱酯酶(TChE)含量，实现了 "病症一模型一药物"的有机结合，为进一步研 究药效物质与作用机制提供理论依据。
[0082] 1.药材提取将干燥的杜仲皮40kg，粉碎成粗粉，以60 %乙醇回流提取3次，每次2.0 小时，滤过，合并提取液，减压回收，得干膏。将杜仲皮60%乙醇提取物（lg相当于生药 11.76g )，用2 %吐温-80的水溶液制备供试液。
[0083] 2.实验动物的分组将72只健康SD雄性大鼠随机分为空白组、假损伤组、H/MAD模型 组、杜仲60%乙醇提取物高剂量组、杜仲60%乙醇提取物中剂量组、安理申组。实验各组每 组12只大鼠。
[0084] 3.复制异质性及多因性老年性痴呆以及阿尔茨海默病动物模型:各组实验大鼠腹 腔注射D-半乳糖(50mg/kg · d)，造成亚急性衰老，4W后先进行双侧颈总动脉反复结扎间段 性的阻断血流，造成脑缺血性病灶(大鼠水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉，颈正中部常规消 毒后切口，分离双侧颈总动脉，套"4"号丝线扣。拉紧丝扣，阻断血流10min，松开丝扣使血液 灌注10min后，再次阻断血流10min，第2次再灌注后观察5min，缝合皮肤，切口局部注射庆大 霉素。）手术完成后，将大鼠喂养3天，取未死亡的状态良好的大鼠再脑内注射凝聚态Αβ^ο (Αβ^ο:用无菌生理盐水稀释成5ygAU，37°C孵育1W)，参照《大鼠脑立体定位图谱》，确定视 交叉后3mm为海马区。操作方法如下：大鼠水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉，固定在脑立体 定位仪上，头部备皮，常规消毒手术区皮肤，无菌下操作，沿颅中线做长2~3cm的切口，分离 骨膜，暴露出"人"字缝和"十"字缝。在前0后3 · Omm，中线右侧旁开2 · Omm，用7号针头钻开颅 骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂直进针4.0mm，然后向脑组织内缓慢注射δμΙΑβ^ο， 垂直进针，注射5min，留针5min，注射后用牙科泥封堵颅骨。消炎粉消毒，缝合皮肤。
[0085] 空白组不予处理;模型组与给药组分别按上述造模方法予以处理。模型组于脑内 注射手术后第3天开始灌胃2 %吐温-80水溶液6天，每天1次;各给药组手术后第3天开始连 续灌胃给药6天，每天1次。
[0086] 4.Morris水迷宫实验预先在水池里注入清水使水面高出平台1~2cm，水温控制在 24 士 2°C左右。水池内壁涂有黑漆，每次测试前须向水池内加入适量黑色墨水，水池共分为4 个象限。将平台放在第一象限中间，在其他三个象限任选一点面向水池池壁将大鼠放入水 中，试验历时5天，每天上午每个象限各测试一次，每次测试lmin。若大鼠在lmin之内尚未找 到平台，则将大鼠拿到平台上并使它在上面站15s，若大鼠在lmin之内找到平台，也让其在 平台上站15s，方结束一次训练，如此训练4天。在第5天，将平台移走，每只大鼠游lmin，记录 每只大鼠第一次经过原平台的时间（潜伏期），每只大鼠在lmin内经过平台的次数、游过的 总距离以及在原平台所在象限及其它三个象限内逗留的时间，计算出在第一象限游泳的时 间（)占整个游泳时间（t总)的百分比。
[0087] 5.分光光度法测定T-A0C和TChE的含量在2.3大鼠行为学检测后，每组大鼠用水合 氯醛(300mg/kg)麻醉后，快速开胸，行心脏采血，3500r/min离心1 Omin取血清，置于-70 °C低 温保存。按试剂盒说明书，紫外分光光度法检测T-A0C和TChE的含量。
[0088] 6.统计方法以SAS软件单因素方差分析进行处理，计量资料数据以均数±标准差 C X 土s)表不。
[0089] 7.结果
[0090] 7.1 Morris水迷宫实验与模型组比较，空白组大鼠潜伏期短、过台次数多，在第一 象限逗留时间长，差异显著(P<〇.01);给药组能缩短潜伏期、增加过台次数，在第一象限逗 留时间延长，与模型组相比具有显著差异(P<〇.05或P<0.01)，说明给药组治疗有效，提示 杜仲60%乙醇提取物组(尤其是中剂量组)效果明显。结果见表3和图4。杜仲皮提取物治疗 老年性痴呆实验A-F为各组大鼠空间搜索轨迹如图4所示。
[0091 ] 表3H/MAD模型大鼠空间探索试验结果(元±s)
[0092]
[0093] 与模型组比较，*p<0 · 05;与模型组比较广p<0 · 01 ;n = 10
[0094] 7.2杜仲提取物对H/MAD模型大鼠血清中T-A0C和TChE含量的影响
[0095] 与模型组比较，空白组和假损伤组大鼠血清中T-A0C含量升高，TChE活力降低，差 异显著(P<0.01);给药组能提高T-A0C含量，降低TChE活力，与模型组相比具有显著差异(P <0.05或P<0.01)，说明杜仲60%乙醇提取物(尤其是中剂量组）治疗效果明显，能使异质 性及多因性老年痴呆以及阿尔茨海默病模型大鼠脑中T-A0C的活力恢复，降低TChE含量，增 强清除自由基的能力，拮抗氧化反应，同时防止神经递质的减少，从而起到防治AD的作用。 结果见表4。
[0096] 表4 H/MAD模型大鼠血清中T-A0C和TChE的含量(J±s)
[0097]
[0098] 与模型组比较，*p<0.05;与模型组比较广p<0.01 ;n = 10
[0099] 实施例8
[0100] 发明人从老年性痴呆以及阿尔茨海默病(AD)发病的异质性及多因性出发，将脑衰 老及血管危险因子导致的脑低灌注和Αβ蛋白脑病理病变相结合，利用腹腔注射D-半乳糖促 老化与反复结扎双侧颈总动脉致脑低灌注及鼠脑室一次性注射β淀粉样蛋白制作异质性及 多因性老年性痴呆以及阿尔茨海默病（Heterogeneitys/Multi-factors 'Alzheimer ' s Di sease，H/MAD)模型，探讨杜仲叶提取物对H/MAD模型大鼠学习记忆和抗氧化能力(T-AOC、 TChE、CAT、SOD、MDA、GSH-Px)的影响，初步探讨杜仲叶抗氧化、抗衰老作用机理，为杜仲叶的 综合开发利用提供理论依据。
[0101] 1.药材提取将干燥的杜仲叶20kg，粉碎成粗粉，以60 %乙醇回流提取3次，每次2.0 小时，滤过，合并提取液，减压回收，得干膏。将杜仲叶60%乙醇提取物（lg相当于生药 8.0g )，用2 %聚山梨酯水溶液制备供试液。
[0102] 2 .动物的分组和将72只健康SD雄性大鼠随机分为空白组、假损伤组、H/MAD模型 组、杜仲叶提取物高剂量组、杜仲叶提取物中剂量组、盐酸多奈哌齐组，每组12只大鼠。
[0103] 3.复制异质性及多因性老年性痴呆以及阿尔茨海默病模型:各组实验大鼠每天腹 腔注射D-半乳糖(50mg · kg^1)，造成亚急性衰老，4W后先进行双侧颈总动脉反复结扎间段性 的阻断血流，造成脑缺血性病灶(水合氯醛腹腔注射麻醉，颈正中部切口，分离双侧颈总动 脉，套"4"号丝线扣。拉紧丝扣，阻断血流10min，松开丝扣使血液灌注10min后，再次阻断血 流10min，第2次再灌注后观察5min，缝合皮肤。）手术完成后，将大鼠喂养3天，取未死亡的状 态良好的大鼠再脑内注射凝聚态ΑβΗΜ水合氯醛麻醉，固定在脑立体定位仪上，头部备皮， 在无菌下操作，沿颅中线做长2~3cm的切口，分离骨膜，暴露出"人"字缝和"十"字缝。在前 囟后3. Omm，中线右侧旁开2. Omm，用7号针头钻开颜骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂 直进针4.〇臟，然后向脑组织内缓慢注射5以^01-4()，注射51^11，留针5 1^11，注射后用牙科泥封 堵颅骨。消炎后缝合皮肤。
[0104] 空白组不予处理;模型组与给药组分别按上述造模方法予以处理;假损伤组腹腔 注射生理盐水4W，4W后先进行分离颈总动脉，只穿线但不结扎，再脑内注射等量的生理盐 水。假损伤组与模型组于脑内注射手术后第3天开始灌胃2%聚山梨酯水溶液6天，每天1次。 各给药组手术后第3天开始连续灌胃给药6天，每天1次。
[0105] 4.Morris水迷宫实验预先在水池里注入清水使水面高出平台1~2cm，水温控制在 24 士 2°C左右。水池内壁涂有黑漆，每次测试前须向水池内加入适量黑色墨水，水池共分为4 个象限。将平台放在第四象限中间，在其他三个象限任选一点面向水池池壁将大鼠放入水 中，试验历时5天，每天上午每个象限各测试一次，每次测试lmin。若大鼠在lmin之内尚未找 到平台，则将大鼠拿到平台上并使它在上面站15s，若大鼠在lmin之内找到平台，也让其在 平台上站15s，方结束一次训练，如此训练4天。在第5天，将平台移走，每只大鼠游lmin，记录 每只大鼠第一次经过原平台的时间（潜伏期），每只大鼠在1 min内经过平台的次数、游过的 总距离以及在原平台所在象限及其它三个象限内逗留的时间，计算出在第四象限游泳的时 间（t 4)占整个游泳时间（t总)的百分比。
[0106] 5.分光光度法测定1^0(：、1'0^工41'、300、1?^、63!?^的含量在大鼠行为学检测 后，每组大鼠用水合氯醛（300mg · kg^1)麻醉后，快速开胸，行心脏采血，3500r/min离心 lOmin取血清，置于-70°C低温保存。按试剂盒说明书，紫外分光光度法检测T-A0C、TChE、 CAT、SOD、MDA、GSH-Px 的含量。
[0107] 6.统计方法采用SAS软件分析，实验数据用表示，单因素方差分析实验的数 据。P<0.05为有统计学意义。
[0108] 7.结果
[0109] 7. IMorris水迷宫实验与空白组和假损伤组比较，模型组大鼠潜伏期延长、过台次 减少，在第四象限逗留时间短，差异显著(P<〇.01);与模型组比较，给药盐酸多奈哌齐组、 杜仲叶提取物高、中剂量组能缩短潜伏期、增加过台次数，在第四象限逗留时间延长(P< 0.05或P<0.01)，说明各给药组治疗有效，提示杜仲叶提取物(尤其是中剂量组)效果明显。 见表5。
[0110] 表5杜仲叶提取物对H/MAD模型大鼠空间探索试验结果( J±s，n = 8)
[0111]
[0112] 注:与空白组和假损伤组比较，#p<0.01，与模型组比较，*p<0.05广ρ<〇.〇1
[0113] 7.2杜仲叶提取物对H/MAD模型大鼠血清中T-A0C和TChE含量的影响与空白组和假 损伤组比较，模型组大鼠血清中T-A0C含量降低，TChE活力增强，差异显著(P<0.01);给药 各组能提高T-A0C含量，降低TChE活力，与模型组相比具有显著差异(P<0.05或P<0.01)， 说明杜仲叶提取物(尤其是中剂量组)治疗效果明显，能使H/MAD模型大鼠脑内T-A0C的活力 恢复，降低TChE含量，增强清除自由基的能力，拮抗氧化反应，同时防止神经递质的减少，起 到防治AD的作用。见表6。
[0114] 表6杜仲叶提取物对H/MAD模型大鼠血清中T-A0C和TChE含量的影响（f ±s ,n = 8) [01151
[0116] 注:与空白组和假损伤组比较，#p<0.01，与模型组比较，*ρ<0.05，**ρ<〇.〇1
[0117] 7.3杜仲叶提取物对H/MAD模型大鼠血清中CAT、S0D、MDA和GSH-PX含量的影响
[0118] 与空白组和假损伤组比较，模型组大鼠 CAT、SOD、GSH-Px明显降低（P< 0.01 )，而 MDA水平显著升高(P<0.01);与模型组比较，盐酸多奈哌齐组使MDA水平下降的不明显，差 异不显著，但可以提高抗氧化酶CAT、S0D、GSH-P X的活力(P<0.05);与模型组比较，杜仲提 取物各给药组MDA水平明显下降（P < 0.05或P < 0.01)，而CAT、SOD、GSH-Px明显上升（P < 0.05或P<0.01 )，说明给药组治疗有效，且优于盐酸多奈哌齐组。结果见表7。
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