百分比为0. 25% 胰酶溶液，用Hanks液配制。
[0049] 细胞培养方法：将H印G 2. 2. 15细胞解冻后，接种入25cm2培养瓶，浓度为I X 10 5 个/ml，待细胞长满后，加0. 25 %胰酶37 °C消化3-5分钟。加培养液吹打，1:3传代，每天收 集上清，连续2周，冷藏待检。
[0050] 2、连翘苷元对H印G2. 2. 15细胞增殖的抑制作用
[0051] 用MTT法测定药物的细胞毒性，将连翘苷元用DMEM培养液稀释成浓度分别 为100 μ g/ml，50 μ g/ml，25 μ g/ml，12. 5 μ g/ml的含药培养液；在96孔板每孔加入 !fepG2. 2. 15细胞100 μ 1 (细胞浓度为3X IO5个细胞/ml)，37°C 5% CO2培养箱中培养。培 养24小时后换用含药培养液，每个浓度4孔，每3天换同浓度含药培养液，37°C 5 % 0)2培 养箱中继续培养8天。培养结束后，向每孔细胞中加入5 μ g/ml MTT 10 μ 1，每孔中存留有 上清100 μ 1，37°C 5% CO2培养箱中培养4h后，酶标仪570/630nm波长测定OD值。空白对 照及细胞对照各4孔。按照下述公式计算细胞抑制百分率。
[0052] 细胞抑制百分率=[(细胞对照OD值一药物作用组OD值）八细胞对照00值一空 白对照OD值）]X 100%。
[0053] 表1连翘苷元对H印G2. 2. 15细胞增殖的抑制作用
[0055] 初步的细胞学实验显示，连翘苷元对于IfepG2. 2. 15细胞具有明显的细胞抑制作 用，因此其具有潜在的抑制乙型肝炎病毒的作用。
[0056] 3、连翘苷元对H印G2. 2. 15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响
[0057] 96孔板每孔3X IO5个细胞/ml2. 2. 15细胞100 μ 1，37°C 5% CO2培养箱中培养。一 天后，换用含药培养液，每个浓度4孔，将连翘苷元用DMEM培养液稀释成（50 μ g/ml，25 μ g/ ml，12. 5 μ g/ml，6. 25 μ g/ml)，每3天换同浓度含药培养液，第9天收集培养上清，-20°C冰 冻保存。ELISA检测试剂盒测定HBsAg和HBeAg，酶标仪540/630nm波长测定OD值。空白 对照及细胞对照各4孔。
[0058] 抑制百分率=[(细胞对照OD值一药物作用组OD值）八细胞对照00值一空白对 照OD值）]X 100%。结果见表2。
[0059] 表2连翘苷元对H印G2. 2. 15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响
[0060]
[0061] HBsAg和HBeAg是乙型病毒性肝炎病人血清中主要的标记，本实验结果显示连翘 苷元对IfepG2. 2. 15细胞分泌HBsAg和HBeAg有显著的抑制作用，连翘苷元浓度在50 μ g/ml 时对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70. 9%和38. 5%，有显著性抑制作用。提示连翘苷元 在体外有抗HBV细胞分泌HBsAg和HBeAg作用。
[0062] 实施例10连翘苷元对鸭体内乙型病毒性肝炎病毒感染的治疗效果
[0063] 本发明采用国内外公认的实验模型，在乙型病毒性肝炎病毒感染的鸭体内进行实 验。
[0064] I. DHBV感染：50只雏鸭经胫静脉注射DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0. 2ml。在感染 后7天取血，分离血清。70°C保存待检。
[0065] 2.药物治疗试验：DHBV感染1日龄北京鸭随机分组，给药组分3个剂量腹腔注射 给以实施例1制备的连翘苷元注射剂，分别为连翘苷元低剂量组（〇.5mg/kg)、连翘苷元中 剂量组（2. 5mg/kg)、连翘苷元高剂量组（5mg/kg)，每天2次，连续给药10d，空白对照组，以 生理盐水代替药物；阳性药物阿昔洛韦组（50mg/kg)，每天2次，连续10d。给药前，给药第 5d、IOd和停药后3d，分别自鸭腿胫静脉取血，分离血清，于-70°C保存待检。
[0066] 3.检测方法：取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA的动态 水平。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32p标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射 自显影膜片斑点，测定OD值（490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本 DHBV-DNA水平值。
[0067] 4.药效计算：计算每组不同时间点血清DHBV-DNA水平，各组用药前后比较采用 配对t检验，计算DHBV-DNA抑制率，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态变化。给药组 与病毒对照组比较，采用成组t检验。DHBV-DNA抑制率=(给药前OD值一给药后OD值）/ 给前OD值X 100%。结果见表3。
[0068] 表3连翘苷元注射剂对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平的影晌
[0069]
[0070] 与空白对照组相比，*ρ〈0· 05广ρ〈0· 01 ;与阿昔洛韦组相比，#ρ〈0· 05, ##ρ〈0· 01
[0071] 本实验通过鸭乙型病毒性肝炎模型证明了连翘苷元具有更好的抗鸭乙型病毒性 肝炎病毒活性，乙型病毒性肝炎病毒感染鸭腹腔注射给以连翘苷元治疗，一天给药两次，连 翘苷元各治疗组对感染鸭血清DHBV-DNA水平均有显著抑制作用，其中连翘苷元高剂量组 (5mg/kg)对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果尤为显著，并有抑制停药反跳的特点，停 止给药后对乙型病毒性肝炎病毒仍有抑制作用。
[0072] 实施例11连翘苷元对刀豆蛋白A (ConA)致小鼠肝损伤作用的实验研究
[0073] 刀豆蛋白（ConA)是一种被广泛应用可活化T细胞的有丝分裂原，ConA静脉注射小 鼠体内后，大部分在肝脏内聚集，通过活化T淋巴细胞而致免疫性肝损伤，表明肝脏是ConA 体内诱导毒性的靶器官。这一实验模型很好地模拟了人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等 疾病，是筛选急性肝炎和暴发性肝衰竭治疗药物较理想的动物模型。
[0074] L动物分组及给药
[0075] 健康BALB/C小鼠，清洁级，60只，雌雄各半，体重（20±2)g，将小鼠按体重随机 分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、连翘提取物组（按照专利申请 CN101085043B实施例2制备工艺制备得到连翘提取物）、连翘苷组（按照《中药化学》第 188页，上海科学技术出版社，1987年出版，自制连翘苷，纯度大于97% )、连翘苷元低剂量 组、连翘苷元高剂量组。各组分别给予下述药物：
[0076] 正常对照组：等体积的生理盐水，灌胃给药
[0077] 模型对照组：等体积的生理盐水，灌胃给药
[0078] 连翘提取物组：50mg/kg连翘提取物，灌胃给药
[0079] 连翘苷组：50mg/kg连翘苷，灌胃给药
[0080] 连翘苷元低剂量组：5mg/kg连翘苷元，灌胃给药
[0081] 连翘苷元高剂量组：10mg/kg连翘苷元，灌胃给药
[0082] 按剂量每日给药一次，连续10d，末次给药后lh，除正常对照组外，其余每个组均 给与ConA诱导肝损伤，具体方法为：小鼠尾静脉注射15mg/kg ConA。造模后，禁食，8h后小 鼠摘眼球采血，分离血清，用于测定血清生化指标；取出肝脏以制备肝组织匀浆和肝组织病 理学检查。其中，血清ALT和AST的测定方法为：小鼠造模后禁食不禁水8h，麻醉后取血， 静置lh，3000r/min，离心15min取血清，冷藏4°C待用自动生化分析仪测ALT、AST。
[0083] 2.数据处理
[0084] 数据以? ±s表示，采用SPSS15. 0软件进行方差分析。
[0085] 3.结果与讨论
[0086] 由表4结果可知：（1)与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清ALT、AST均显著升 高。各给药组处理小鼠后，均能降低小鼠血清ALT、AST，与对照组相比具有统计学差异。连翘 苷元各剂量组能够显著降低小鼠血清ALT、AST，与连翘提取物组相比，极显著性（P〈0. 01) 差异，表明连翘苷元治疗肝损伤的效果优于连翘提取物。连翘苷元各剂量组能够显著降低 小鼠血清ALT、AST，与连翘苷组相比，具有显著性（P〈0. 05)或极显著性（P〈0. 01)差异，表 明连翘苷元治疗肝损伤的效果优于连翘苷。
[0087] 表4连翘苷元对ConA致小鼠肝损伤的的影响
[0088] 与正常对照组相比，ΥΡ〈0· 05，YYP〈0. 01 ;
[0089] 与模型对照组相比，#Ρ〈0· 05, ##Ρ〈0· 01 ;
[0090] 与连翘提取物组相比，Ω〈0· 05, ΩΩΡ〈0· 01 ;
[0091] 与连翘苷组相比，&Ρ〈0· 05, ΜΡ〈0· 01。
[0092] (2)病理检测结果显示，正常对照组小鼠肝脏内可见多个肝小叶，肝索排列规整， 肝小叶的结构清晰，门管区结构清楚，无明显炎细胞浸润和肝细胞坏死。模型对照组小鼠肝 索排列紊乱，肝小叶结构破坏，有较多淋巴细胞和单核细胞浸润，可见小灶状肝细胞坏死。 连翘苷元各组小鼠肝小叶结构基本保留，肝索排列基本规整，门管区有少量淋巴细胞、单核 细胞浸润，未见明显肝细胞坏死，病变较模型对照组明显减轻。
[0093] 以上通过【具体实施方式】进一步描述了本发明，任何等同替换对于本领域的技术人 员来说都是显而易见的且包含在本发明之中。
【主权项】
1. 下述化合物在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途，所述化合物为连翅巧元，其 化学结构式为：2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述包含连翅巧元的药物制剂为其口服制 剂或注射制剂。3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述包含连翅巧元的口服制剂为其片剂、胶 囊剂、或微乳制剂。4. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述包含连翅巧元的的注射制剂为其注射 液，其由连翅巧元和药用辅料组成。5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药用辅料可W为乙醇、丙二醇、 阳G400、PEG600、吐溫80中的一种或多种。6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，连翅巧元能够抑制乙型肝炎病毒的增殖。7. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，连翅巧元能够抑制乙型肝炎病毒分泌皿sAg 和 HbeAg。8. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，连翅巧元能够修复乙型肝炎病毒感染所导 致的肝损伤。
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及连翘苷元在制备治疗乙型肝炎病毒药物中的用途。为了克服现有乙型病毒性肝炎治疗药物毒副作用大，治疗过程中易出现耐受性等不足，本发明提供一种治疗乙型病毒性肝炎的有效治疗药物。该治疗药物以连翘苷元为活性成分，其用于乙型病毒性肝炎患者治疗时，不仅具有直接抗乙型肝炎病毒的作用，而且能够抑制乙型肝炎病毒分泌HBsAg和HbeAg，更能修复病毒感染所导致的肝损伤，其疗效确切，毒副作用小，安全性和耐受性均较好，具有十分广泛的医疗应用前景。
【IPC分类】A61P31/20, A61P1/16, A61K31/34
【公开号】CN105687181
【申请号】CN201510897477
【发明人】张贵民, 冯芹, 姜明敏, 商庆节, 吕金钢, 刘艳松
【申请人】山东新时代药业有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2015年12月7日