天后（即术后43d)行剩余瘢痕 取材。
[0029] 取材方式:按1.2.1麻醉方式及消毒，切口沿瘢痕边缘位于兔耳正常皮肤与瘢痕交 界处，垂直于皮肤表面，深达软骨表面，整个瘢痕组织完整切取。将每个瘢痕平均分成2份， 一份用作HE及TGF-β 1免疫组织化学染色，另一份用作TGF-β I mRNA检测(每次等分切取1/ 2份用来检测）。
[0030] 1.2.3瘢痕厚度测定 术后32d、43d用彩色超声诊断仪(探头超声频率为13MHz)，于同一测定人在相同条件下 测定各组创面形成瘢痕的厚度。
[0031] 1.2.4瘢痕硬度测定 术后32d、43d用瘢痕硬度精密测定仪测定瘢痕硬度:将硬度计垂直放置于待测的瘢痕 和皮肤上，靠硬度计本身重量作用于测定部位，根据测定不同瘢痕和皮肤的硬度不同，仪表 上即显示不同的数据。每个瘢痕、皮肤分别测定3次，计算平均值，将读数换算成硬度值，单 位为N/mm 2。
[0032] 1.2.5瘢痕组织HE染色 瘢痕组织标本用4%多聚甲醛固定，石腊包埋，连续5μπι厚度切片，常规爬片。做HE染色， 观察增生性瘢痕的病理表现。
[0033] 1.2.6 TGF-β 1 免疫组化 切片二甲苯脱腊和梯度酒精脱水，3 %过氧化氢阻断过氧化物酶。然后与TGF-β 1-抗 (1:100 )4 °C冰箱孵育过夜，滴加适量生物素标记山羊抗鼠 IgG，37 °C孵育20min，磷酸盐缓冲 液(PBS)冲洗3 X 5min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37°C孵育20min JBS冲洗3 X 5min，DAB 显色，自来水充分冲洗，如需要，苏木素复染，脱水，透明，封片。于光镜下观察阳性信号，阳 性信号为黄色。在400倍光镜下观察结果，在每张切片的上、中、下、左、右找5个视野进行计 数，阳性细胞反应率(R)=阳性细胞数/细胞总数，结果取均数。
[0034] 1.2.7 TGF-β I mRNA的水平的分析 Trizol提取兔耳瘢痕组织总RNA，方法按照试剂说明书操作，用紫外分光光度计测定 RNA纯度和浓度，RT-PCR分析TGF-βΙ，看家基因 β肌动蛋白（β-actin)作为内参照，TGF-βΙ上 游引物序列：5'-CGG CAG CTG TAC ATT GAC TT-3'，下游引物序列：5'-AGCGCA CGA TCA TGT TGG AC-3'，扩增片断长度271bpJ-actin上游引物序列：5'-CTA CAA TGA GCT GCG TGTGG-3'，下游引物序列：5'-TAG CTC TTC TCC AGG GAG GA-3'，扩增片断长度ASObpc3RT-PCR反应按照该反应试剂盒说明操作，PCR条件为95°C 5min，95°C 30s，55°C lmin，72°C lmin，30循环，72°C 5min;取IOylPCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察拍照，用凝 胶图像分析系统检测灰度值(IVD)，对条带量化处理。
[0035] 1.3统计学处理 兔耳瘢痕组织学检测数据分析采用SPSS13.0统计分析软件完成，数据采用均数±标准 差表达，采用配对设计的t检验、单因素方差分析，以P〈0.05确定差异有显著意义。
[0036] 2 结果 2.1瘢痕组织学观察结果 在术后32d、43d兔耳瘢痕组织本发明药物治疗组瘢痕面积变小，高度变低，质地变软， 与对比药物A组、对比药物B组、以及对照组比较，相差十分显著。在HE染色法切片上，对比药 物A组、对比药物B组、以及对照组的瘢痕组织内大量成纤维细胞、细胞外基质和毛细血管， 浅部可见环形或螺旋样分布，组织内少量炎性细胞，本发明药物治疗组瘢痕组织内成纤维 细胞明显少于对比药物A组、对比药物B组、以及对照组，表皮层增厚，成纤维细胞排列较规 贝1J，细胞外基质多，可见少量毛细血管，在术后43d兔耳瘢痕组织治疗组较术后32d真皮层更 薄，成纤维细胞排列较整齐。实验结果见图1、图2、图3、图4。
[0037] 2.2瘢痕厚度测定 在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组愈合创面厚度接近，明显高于本 发明药物组、对比药物A组、对比药物B组，而对比药物A组、对比药物B组又高于本发明药物 组。且本发明药物组术后43d的愈合创面厚度与术后32d相比有明显的降低，而对比药物A组 与对比药物B组术后43d的愈合创面厚度与术后32d相比没有明显的降低。实验结果见表1-1 表1-1各组瘢痕厚度(mm)
注：与空白对照组比较，*P〈〇. 01，#P〈〇. 05;术后32d与43d配对t检验，#P〈0.01 2.3瘢痕硬度测定 在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组愈合创面硬度接近，明显高于本 发明药物组、对比药物A组、对比药物B组，而对比药物A组、对比药物B组又高于本发明药物 组。且本发明药物组术后43d的愈合创面硬度与术后32d相比有明显的降低，而对比药物A组 与对比药物B组术后43d的愈合创面硬度与术后32d相比没有明显的降低。
[0038] 表1-2各组瘢痕硬度(N/mm2 )
注:与对照组比较，*P〈〇. 05，#P〈0.01;术后32d与43d配对t检验，#P〈0.01 2.4 TGF-βΙ免疫组织化学 在术后32d、43d兔耳瘢痕组织空白对照组、生理盐水组TGF-βΙ表达明显，黄色为阳性表 达，在本发明药物组TGF-βΙ表达明显下降，对比药物A组与对比药物B组TGF-βΙ表达有所下 降，但不明显。且本发明药物组术后43d的TGF-β 1表达比术后32d有明显下降，而对比药物A 组与对比药物B组术后43d的TGF-β 1表达比术后32d没有明显下降。实验结果见表1-3、图5、 图6〇
[0039] 表1-3各组TGF-β 1表达分析(％)
注:与对照组比较及各实验组间比较，*P〈〇. 05;术后32d与43d配对t检验，#P〈0.05 2.5 TGF-β I mRNA的表达 在术后32d的瘢痕组织中，RT-PCR结果表明，各实验组泳道中内参β-actin条带亮度强 弱相似，说明RT-PCR中加入的模板的量一致，而扩增的TGF-β 1电泳带亮度强弱存在差异。
[0040] 应用Image Master VDS图像系统分析结果，以生理盐水对照组的RT- PCR为标 准(亮度定为100)，其中本发明药物组的TGF-β I mRNA的扩增带亮度有明显减弱，为生理 盐水对照组的73.9%;对比药物A组、对比药物B组的扩增带亮度有一定减弱，但不明显，分别 为生理盐水对照组的92.5%、94.3%。但本发明药物组未抑制0- &(^1111111?祖的表达，提示本 发明药物治疗组成功抑制TGF-β 1基因的表达;而空白对照组及生理盐水对照组的TGF-β I mRNA的表达无明显差异。
[0041 ]术后43d的瘢痕组织中，本发明药物组的TGF-β I mRNA的扩增带亮度为生理盐水 对照组的42.9%，较术后32 d的GF-mmRNA的扩增带亮度呈明显减弱；对比药物A组、对比 药物辟且的了6?-|3 11111?祖的扩增带亮度分别为生理盐水对照组的84.7%、85.1%，较术后32(1 的GF-WmRNA的扩增带亮度没有明显减弱。实验结果见表1-4。
[0042]表 1-4 各组TGF-β I mRNA 表达分析(％)
注:与对照组比较及各实验组间比较，*P〈〇. 05;术后32d与43d配对t检验，#P〈0.05 3讨论与结论 增生性瘢痕是整形外科基础研究的重要课题之一，严重创伤、烧伤及外科手术后常常 遗留增生性瘢痕，影响外观和功能，但一直都缺乏理想的治疗方法。近年来大量的研究热衷 于从祖国中医中药中筛选出疗效确切、副作用小的有效药物来抗疤痕纤维化。但对于药物 防治瘢痕增生的研究手段，主要有3种途径:一是细胞培养，尤其是成纤维细胞培养，通过药 物对成纤维细胞的作用来进行筛选;二是将人的病理性瘢痕组织移植到裸鼠的皮下，研究 药