制备注射液的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备含有细胞的溶液的方法，特别涉及一种制备含有(体)干细胞的注射液的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞具有自我更新(self-renewal)的能力，因此可以产生更多的干细胞并变成几乎任何一种的特化细胞(specialized cell)。干细胞研究被视为是生物医学未来最重要的领域之一，再加上近年来相关产业也加速成长，突显人们对于干细胞在医疗应用上的需求。
【发明内容】
[0003]本发明的主要目的在于提供一种制备或制作干细胞溶液(或称为含有干细胞的溶液)的方法，其中该溶液可以做为用于治疗自体免疫疾病的注射液。
[0004]本发明的另一目的在于提供一种治疗自体免疫疾病的方法。
[0005]为达到上述的目的，本发明提供一种制备或制作含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)的方法，该溶液可作为一种治疗自体免疫疾病(例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的注射液。所述方法包括以下步骤:(I)将血液样本与二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸)均匀混合后所形成的第一混合液放在温度为2至12摄氏度(较佳为2至7摄氏度)的环境中静置3至72小时、3至6小时、6至72小时、6至48小时、16至72小时、16至48小时、36至60小时或48至72小时，使第一混合液分成两层或两层以上，即第一混合液形成两个或两个以上的分离层(例如包含一上分离层和一下分离层)，其中一个分离层(例如上分离层或最上层的分离层)内的液体(例如上清液)含有血小板(尺寸可为小于6微米[ym])、一种或多种的体干细胞(例如是CD349(+)体干细胞和Lgr5(+)体干细胞)、二价阳离子螯合剂与生长因子；(2)从第一混合液取得该液体；以及(3)在取得该液体之后，将该液体和无钙离子(Ca2+)的溶液或培养液进行混合，继而形成第二混合液。无钙离子的溶液或培养液也可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg2+) ο无I丐离子的溶液或培养液可以是一盐溶液，例如生理盐水(normal saline)。第二混合液可以是前述的含有干细胞的溶液。或者，上述方法可以进一步包括:过滤第二混合液，继而制备出或制作出含有干细胞的溶液。
[0006]为达到上述的目的，本发明提供一种制备或制作含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)的方法，该溶液可作为一种治疗自体免疫疾病(例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的注射液。所述方法包括以下步骤:(I)将血液样本与二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸)在温度为2至12摄氏度(最佳为2至7摄氏度)的环境中培养或培育一段时间(例如3至72小时、3至6小时、6至72小时、6至48小时、16至72小时、16至48小时、36至60小时或48至72小时)，使血液样本分成两层或两层以上，即血液样本形成两个或两个以上的分离层(例如包含一上分离层和一下分离层)；以及(2)取得该些分离层其中之一，成为含有干细胞的溶液。取得的分离层含有血小板(尺寸可为小于6 μ m)、体干细胞(包括CD349 (+)体干细胞和Lgr5 (+)体干细胞)、二价阳离子螯合剂以及生长因子。或者，上述方法可以进一步包括:将取得的分离层和一种无钙离子(Ca2+)的溶液或培养液进行混合，继而形成含有干细胞的溶液。无钙离子的溶液或培养液也可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg2+)。无钙离子的溶液或培养液可以是一盐溶液，例如生理盐水。
[0007]在上述两种方法中，体干细胞的尺寸(如大小)可为I ym至6 μ m，较佳为大于I或2μηι至小于6μηι。体干细胞可以包含尺寸大于2 μm至小于6 μm的⑶66e (+)体干细胞(也就是类卵裂球干细胞)。⑶349 (+)体干细胞也为⑶9 (+)，而且尺寸可为大于2 μ m至小于 6μηι。Lgr5 (+)体干细胞也为 0ct4(+)与 Nanog(+)、以及⑶ 133 (-)、Q)66e (-)、Sox2 (-)、CD4 (-)、CD8 (-)、CD9 (-)、CD10(_)、CDl 1(-)、CD16 (-)、CD17 (-)、CD18(_)、CD19 (-)、CD20 (-)、CD21 (-)、CD31 (-)、CD42 (-)、CD63 (-)、CD34 (-)、Lin (-)、CD38 (-)、CD90 (-)、CD45 (-)与⑶349(_)。Lgr5(+)体干细胞的尺寸可为大于2 μπι至小于6 μπι。在含有干细胞的溶液中，Lgr5 (+)体干细胞占尺寸大于2 μπι至小于6 μπι的细胞的百分比为大于4%或5% (较佳为介于4.5%至10% )，⑶349(+)体干细胞占尺寸大于2 μπι至小于6 μπι的细胞的百分比为大于4%或5% (较佳为介于4.5%至10% )，白血球占尺寸大于2 μπι至小于20 μπι的细胞的百分比为小于2% (较佳为小于1%、0.5%或0.1% )，红血球占尺寸大于2 μπι至小于10 μπι的细胞的百分比为小于3% (较佳为小于2%、1%或0.5% )。另外，含有干细胞的溶液中少于1%细胞表现或表达CD133。含有干细胞的溶液可以含有一盐类，例如氯化钠(NaCl) ο当干细胞驱动剂(例如含有褐藻糖胶的化合物)施用在一个体(如人或动物)一段时间(如1-6小时)时，血液样本可取自于该个体的周边血液。
[0008]为达到上述的目的，本发明提供一种用于治疗自体免疫疾病(如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的注射液。该注射液(即上述的含有干细胞的溶液)含有尺寸大于2 μ m至小于6 μ m的⑶349 (+)体干细胞(即SB-1细胞)、尺寸大于2 μ m至小于6 μ m的Lgr5 (+)体干细胞(即SB-2细胞)以及尺寸大于2 μ m至小于6 μ m的⑶66e (+)体干细胞(即类卵裂球干细胞)。注射液也还可以含有二价阳离子螯合剂(如乙二胺四乙酸)、生长因子以及/或是盐类(如氯化钠)。在注射液中，Lgr5(+)体干细胞占尺寸大于2 μ m至小于6 μ m的细胞的百分比为大于4%或5% (较佳为介于4.5%至10% )，⑶349 (+)体干细胞占尺寸大于2 μπι至小于6 μπι的细胞的百分比为大于4%或5% (较佳为介于
4.5%至10% )，⑶66e(+)体干细胞占尺寸大于2 μπι至小于6 μπι的细胞的百分比为小于6% (较佳为小于5%或4.5% )，白血球占尺寸大于2 μπι至小于20 μπι的细胞的百分比为小于2% (较佳为小于1%、0.5%或0.1% )，红血球占尺寸大于2μπι至小于10 μm的细胞的百分比为小于3% (较佳为小于2%、1%或0.5%)。另外，注射液中少于1%细胞表现或表达CD133。
[0009]为达到上述的目的，本发明提供一种治疗人类个体自体免疫疾病(例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症)的方法。这个方法包括将一有效量的上述注射液投予对其有需求的一人类个体，以治疗该人类个体的自体免疫疾病。注射液中的Lgr5(+)体干细胞、CD349 (+)体干细胞与CD66e(+)体干细胞是该人类个体自体的。上述对人类个体投予注射液的步骤可包括:将与无钙离子(Ca2+)的溶液或培养液混合的注射液通过静脉注射到该人类个体。无钙离子的溶液或培养液可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg2+)。无钙离子的溶液或培养液可以是一盐溶液，例如生理盐水。
[0010]下面将结合具体实施例以及附图对本发明进行详细的描述，使本发明的此等以及其他组件、步骤、特征、效益及优势变得明朗。
【附图说明】
[0011]图1为本发明一实施例的治疗自体免疫疾病的流程图；
[0012]图2为褐藻补充品的内容/成分信息；
[0013]图3为制作或制备含有干细胞的溶液的流程图；
[0014]图4为六位人类受试者在口服褐藻补充品前后的干细胞数据；
[0015]图5A和图5B为一人类受试者在接受颗粒性白血球聚落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，简称GCSF)注射疗程前后的流式细胞仪数据(flow cytometry data)；
[0016]图6A为前向散射系数(forward scattering coefficient，简称FSC)对侧向散射系数(side scattering coefficient，简称 SSC)的流式细胞仪点状图(flow cytometrydot plot)；
[0017]图6B为使用流式细胞分析(flow cytometry analysis)获得的焚光直方图；
[0018]图6C为前向散射系数对侧向散射系数的流式细胞仪点状图；
[0019]图7A为前向散射系数对侧向散射系数的流式细胞仪点状图；
[0020]图7B至图7G为使用流式细胞分析获得的荧光直方图。
[0021]本代表图的符号简单说明:
[0022]2a 垂直线
[0023]10-14 步骤
[0024]21-23 步骤
[0025]虽然在附图中已描绘某些实施例，但本领域技术人员应了解，所描绘的实施例为说明性的，且可在本发明的范畴内构想并实施彼等所示实施例的变化以及本文所述的其他实施例。
【具体实施方式】
[0026]附图揭示本发明的说明性实施例，但其并未阐述所有实施例。可另外或替代使用其它实施例。为节省空间或更有效地说明，可省略显而易见或不必要的细节。相反，可实施一些实施例而不揭示所有细节。当相同数字或标号出现在不同附图中时，其是指相同或类似组件或步骤。当以下描述连同随附附图一起阅读时，可更充分地理解本发明，随附附图的性质应视为说明性而非限制性的。
[0027]以下先介绍本发明的各种定义与描述，然后再详细说明本发明的实施例。
[0028]细胞尺寸(Z)的定义:
[0029]在本发明中，后续段落提及的尺寸(Z)可用于描述细胞(例如干细胞或生物细胞)的大小。尺寸(Z)可以(但不限定)被描述或定义为:(I)细胞生物学领域或干细胞领域对于细胞的大小或代表长度的传统定义、(2)细胞的直径(特别是当细胞的形状实质上为球体时)、(3)细胞的长轴长度(特别是当细胞的形状实质上为橢圆体时)、(4)细胞的宽度(当细胞的形状近似于正方体时)、(5)细胞的长度(当细胞的形状近似于长方体时)或是
(6)细胞的最大横断面或横向尺寸。通过光学显微镜或电子显微镜(例如扫描式电子显微镜)获得的细胞影像或是通过流式细胞仪(flow cytometer)获得的数据(例如二维点、轮廓或密度图)可以用来判定或测量尺寸(Z)—不论是直径、长度、宽度或是最大横断面或横向尺寸。通过光学显微镜或电子显微镜获得的细胞影像可以是细胞的二维剖面图或立体结构。举例来说，经由光学显微镜或电子显微镜(例如扫描式电子显微镜)可获得一个二维剖面影像，然后通过测量二维剖面影像中细胞的最大横断面或横向尺寸就可以获得细胞的尺寸⑵O
[0030]干细胞定义:
[0031]体干细胞(somatic stem cell)，也称为成体干细胞(adult stem cell)，可以在骨髓、脂肪或周边血液等器官或组织中发现，并且具有与所有干细胞相同的基本特征。体干细胞是未特化的细胞(unspecialized cell)或未分化的细胞(undifferentiated cell)，而且能够分化成特定的细胞种类。“体干细胞”术语在本发明中不属于或不包含胚胎干细(embryonic stem cell);换句话说，本发明中的体干细胞不是取自于或来自于胚胎或胚胎组织。
[0032]体干细胞有许多不同的种类，包括全能干细胞(totipotent stem cell)、多功能干细胞(pluripotent stem cell)、多潜能干细胞(multipotent stem cell)以及先驱干细胞(progenitor stem cell) ο先驱干细胞也可以称为专一性干细胞或单能干细胞(unipotent stem cell) 0 类卵裂球干细胞(blastomere-like stem cell，简称 BLSC)属于全能干细胞或多功能干细胞极小类胚胎干细胞(very sma