的溶液或培养液，继而形成含有干细胞的溶液(或称为干细胞溶液)。含有干细胞的溶液因此含有小细胞，例如血小板和小体干细胞，其中小体干细胞包含特定体干细胞(如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)、极小类胚胎干细胞(即CD 133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)、间质干细胞与造血干细胞。无钙离子的溶液或培养液的量(体积)可以是400 _升以上，例如500 _升至900晕升。无I丐尚子的溶液或培养液，例如一盐溶液，还可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg2+)。上述的盐溶液可以是含有氯化钠(NaCl)的溶液，譬如生理盐水(normal saline)。生理盐水通常是指重量/体积百分比为0.9%的氯化钠溶液，约300m0sm/L或每公升9.0克。另外，为了去除含有干细胞的溶液中的杂质，也可以选择将含有干细胞的溶液再通过一过滤器，例如170微米的过滤器。经过过滤的含有干细胞的溶液仍然含有小细胞，例如血小板和小体干细胞，其中小体干细胞包含特定体干细胞(如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)、极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)、间质干细胞与造血干细胞。以下叙述的含有干细胞的溶液也可以是经过过滤的含有干细胞的溶液。
[0095]根据来自图6A至图6C和图7A至图7G的结果，可以估算出、假定出、推测出或得出以下数据。在含有干细胞的溶液中，SB-1细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4%或5% (较佳为介于4.5%至10% )，SB-2细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4%或5% (较佳为介于4.5%至10% )，类卵裂球干细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于6% (较佳为小于5%或4.5% )，极小类胚胎干细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于2% (较佳为小于1%或0.5% )，血小板占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于75%或80% (较佳为介于75%至85% )，白血球占尺寸大于2微米至小于20微米的细胞的百分比可为小于2% (较佳为小于1%、0.5%或0.1% )，红血球占尺寸大于2微米至小于10微米的细胞的百分比可为小于3% (较佳为小于2%、1%或0.5% )。另外，含有干细胞的溶液中少于1%细胞表现或表达CD133。含有干细胞的溶液中每毫升的白血球数可为小于14或10 3，较佳为小于102。含有干细胞的溶液中每毫升的红血球数可为小于15或10 4，较佳为小于103。含有干细胞的溶液可包含二价阳离子螯合剂(如乙二胺四乙酸)、生长因子以及/或是盐类(例如氯化钠)。
[0096]请参阅图1所示，在步骤14中，将一有效量的含有干细胞的溶液以静脉注射方式注入到前述受治疗者(以下称为“第一个体”)体内(即静脉注射自体体干细胞)或注入到另一受治疗者(以下称为“第二个体”)体内(即静脉注射异体体干细胞)，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或短暂性棘皮松解皮肤病(即葛瑞夫兹氏症)。也就是说，将一有效量的含有干细胞的溶液投予第一个体(例如通过静脉注射的方式注射自体体干细胞)或投予第二个体(例如通过静脉注射的方式注射异体体干细胞)，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，譬如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种，并可具有与第一个体相同的血型。“自体体干细胞”是指来自个体本身的体干细胞。“异体体干细胞”是指来自相同物种的另一个体的体干细胞(基因上不同)。“有效量”是指能够在受治疗个体产生像医学上所欲结果的组成物、药剂或物质(例如含有干细胞的溶液)的分量。“治疗”指的是将组成物、药剂或物质(如含有干细胞的溶液)投予一个体，该个体罹患一疾病(如自体免疫疾病)或面临发展该疾病的风险，其目的为治愈、抑制、减轻、缓解、补偿、延缓发作、预防或改善该疾病、该疾病的症状、继发于该疾病的疾病状态或对损伤/疾病的倾向。
[0097]本发明也可以省略步骤10和步骤11。换句话说，本发明可以通过步骤12和步骤13获得或制备出含有干细胞的溶液或经过过滤的含有干细胞的溶液，并按照步骤14的描述将含有干细胞的溶液或经过过滤的含有干细胞的溶液以静脉注射的方式注入到第一个体体内或第二个体体内，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，譬如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。
[0098]在本发明的另一实施例中，第二混合液(没有再与任何东西--例如无钙离子的溶液或培养液--进行混合)可以利用静脉注射方式注入到第一个体体内(即静脉注射自体体干细胞)或注入到第二个体体内(即静脉注射异体体干细胞)，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。也就是说，将一有效量的第二混合液投予第一个体(例如通过静脉注射的方式注射自体体干细胞)或投予第二个体(例如通过静脉注射的方式注射异体体干细胞)，以治疗第一个体或第二个体的自体免疫疾病，譬如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。在本实施例中，第二混合液被视为是含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)。换句话说，该含有干细胞的溶液是经由步骤10至步骤12、步骤21和步骤22所制备或是经由步骤12、步骤21和步骤22所制备。
[0099]僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)是一种发炎的、自体免疫的疾病。这种疾病主要侵袭或影响中轴骨(axial skeleton)、骨盆的荐髂关节(sacroiliac joint)与胸廓(thoracic cage)。随着疾病进展，僵直性脊椎炎患者将经历疼痛和关节僵硬，最后丧失脊椎的活动能力。数以百万计的人患有僵直性脊椎炎，因此需要一个安全有效的方法来治疗僵直性脊椎炎。
[0100]在本发明中，含有干细胞的溶液、经过过滤的含有干细胞的溶液或第二混合液可以作为供静脉注射或输液用的注射液(或称针剂)。该注射液可以用来治疗一个体(如人类)的自体免疫疾病，例如关节炎或短暂性棘皮松解皮肤病(即葛瑞夫兹氏症)。该关节炎可以是:类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、干癣性关节炎(psoriatic arthritis)或僵直性脊椎炎。
[0101]实验研究:
[0102]在第一个实验研究中，一位患有僵直性脊椎炎疼痛的病患接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，该名病患已经超过4个月没有感到因僵直性脊椎炎造成的肋骨疼痛。因此，图1描述的治疗方法可以有效地缓解、抑制、治疗或治愈因僵直性脊椎炎造成的肋骨疼痛。
[0103]在第二个实验研究中，一位患有短暂性棘皮松解皮肤病的病患(其身体有红斑性丘疹)接受了图1描述的治疗方法。结果发现红斑性丘疹从病人的身体消失。因此，图1描述的治疗方法可以有效地缓解、抑制、治疗或治愈因短暂性棘皮松解皮肤病造成的症状。
[0104]在第三个实验研究中，一位患有僵直性脊椎炎和干癣性关节炎的病患(女性，26岁)接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，该名女性觉得她的健康状况已经改善及好转。她能够轻易地做更多日常活动。她身体受到干癣(psoriasis)困扰的几个地方已经改善了很多。她声称自己有更多的精力，而且跟治疗前睡眠时间平均为3小时相比，治疗后睡眠时间平均为6小时。另外，在接受治疗之后，复发至康复的时间(复发时会造成关节活动困难)从4?5天减少到24小时。
[0105]在第四个实验研究中，一位患有纤维肌痛(fibromyalgia)、关节炎和间质性肺疾病(interstitial lung disease)的病患(女性，70岁)接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，该名女性的膝盖有更多的活动度(跟治疗之前相比)。自从2012年被诊断为罹患间质性肺疾病，她最近一次就诊时显示肺部的混池(cloudiness)已经减少了 10%。她的呼吸分析测试(breathalyzer test)得到了自2012年诊断以来最好的结果。
[0106]在第五个实验研究中，一位患有葛瑞夫兹氏症及关节炎的病患(男性，69岁)接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，因葛瑞夫兹氏症出现的皮肤病变开始消失(医生原本告知该皮肤病变是无法治愈的)。另外，他的视力已经改善到不需要使用阅读眼镜(如老花眼镜)的程度。治疗前，他的双腿只要走楼梯就会产生疼痛。治疗后，膝盖和左脚的疼痛已经消失一个星期。他的第一次治疗有非常好的效果，他和他太太可以在治疗后连续45天进行滑雪活动，他只有因为滑雪导致腿部受伤而回来接受第二次的治疗。
[0107]在第六个实验研究中，一位患有僵直性脊椎炎和高血压的病患(男性，33岁)接受了图1描述的治疗方法。在接受治疗之后，该名男性的睡眠时间比治疗前更长，走路距离也比治疗前更远。他的手不再周期性地抽筋，发炎情况也已经明显下降。配合服用高血压药，他的血压稳定。治疗前，他会服用抗焦虑止痛药来处理疼痛问题，但自从治疗后，他已停止服用该药物。
[0108]因此，图1描述的治疗方法可以用于治疗一个体(如人类)的自体免疫疾病，例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎、干癣性关节炎或葛瑞夫兹氏症。
[0109]以上所述是通过实施例说明本发明的特点，其目的在使熟本领域技术人员能了解本发明的内容并据以实施，而非限定本发明的专利范围，故，凡其他未脱离本发明所揭示的精神所完成的等效修饰或修改，仍应包含在以下所述的申请专利范围中。
【主权项】
1.一种制备一注射液的方法，其包括下列步骤: 将一血液样本和一二价阳离子螯合剂的混合液放在温度为2至12摄氏度的环境中静置3至72小时，使该混合液形成复数个分离层，其中位于该些分离层其中之一的一液体含有复数个体干细胞，该些体干细胞的尺寸介于I微米至6微米之间； 取得该液体；以及 在取得该液体之后，将该液体和一无钙离子的溶液进行混合。2.如权利要求1所述的方法，其中该二价阳离子螯合剂为乙二胺四乙酸(H)TA)。3.如权利要求1所述的方法，其中该注射液用于治疗僵直性脊椎炎。4.如权利要求1所述的方法，其中该些体干细胞包含CD349(+)干细胞和Lgr5 (+)干细胞。5.如权利要求1所述的方法，其中该血液样本来自于服用褐藻糖胶后经过30分钟至4小时的一个体的周边血液。6.一种制备一干细胞溶液的方法，其包括下列步骤: 将一血液样本和一二价阳离子螯合剂的混合液放在温度为2至12摄氏度的环境中静置3至72小时，使该混合液形成复数个分离层，其中位于该些分离层其中之一的一液体含有复数个体干细胞，该些体干细胞的尺寸介于I微米至6微米之间；以及取得该液体，其中该干细胞溶液用于治疗僵直性脊椎炎。7.如权利要求6所述的方法，其中该些体干细胞包含CD349(+)干细胞和Lgr5 (+)干细胞。8.如权利要求6所述的方法，其中该二价阳离子螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。9.如权利要求6所述的方法，其中该液体包含该二价阳离子螯合剂。10.一种注射液，其包括尺寸大于2微米至小于6微米的Lgr5 (+)体干细胞与尺寸大于2微米至小于6微米的CD349 (+)体干细胞，其中该注射液用于治疗僵直性脊椎炎。
【专利摘要】本发明公开了一种制备注射液的方法，其包括：(1)将血液样本和二价阳离子螯合剂的混合液放在温度为2至12摄氏度的环境中静置3至72小时，使混合液分成两层或两层以上(即混合液形成两个或两个以上的分离层)，其中一个分离层内的液体含有小体干细胞，例如SB细胞；(2)从混合液收集或取得该液体；以及(3)在收集或取得该液体之后，将该液体和无钙离子(Ca2+)的溶液进行混合，继而形成所述的注射液。此注射液可以用于治疗自体免疫疾病，例如僵直性脊椎炎、类风湿性关节炎或葛瑞夫兹氏症。
【IPC分类】A61K9/08, A61P29/00, A61P37/02, A61K35/545, A61K9/10, A61P19/08, C12N5/0789
【公开号】CN105687245
【申请号】CN201510830889
【发明人】王俊麟
【申请人】干细胞生物科技公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2015年11月25日
【公告号】EP3031463A1, US20160166611