;添加剂;杀生物剂;变性剂;增稠剂;维生素;成膜材料;聚合物;遮光剂;pH调节剂； 减肥成分;调节剂(conditioning agents)，例如保湿剂;和它们的衍生物或类似物。
[0091] 优选本发明的组合物含有不超过两种选自下列的化合物：环糊精、喷替酸五钠 (pentasodium pentetate)、植酸、梓檬酸钾、梓檬酸钠、葡糖酸钾和葡糖酸钠;有利的是，它 们不含选自下列的化合物:环糊精、喷替酸五钠、植酸、梓檬酸钾、梓檬酸钠、葡糖酸钾和葡 糖酸钠。
[0092] 本发明的主旨也是化妆护理和/或治疗方法，其特征在于其包括将北美金缕梅的 提取物局部应用于皮肤和/或粘膜和/或头皮的至少一个区域以便于增加皮肤和/或粘膜 和/或头皮的细胞外基质纤维的形成，优选弹性纤维和/或胶原纤维的形成。
[0093]本发明的化妆护理和/或治疗方法使其能够增加 LOXL表达、胶原蛋白表达和/或活 性和腓骨蛋白5表达和/或活性，和/或抑制弹力素表达和/或活性，因此特别用于减少弹性 蛋白聚合物的形成，更通常用于增加皮肤和/或粘膜和/或头皮的坚固性和/或弹性。
[0094] 根据一个特别有益的方案，所述化妆护理和/或治疗方法应用于选自下列的皮肤 和/或粘膜的至少一个区域:头皮、颈部、颈线、腹部、手臂、大腿、髋部、臀部、腰部和/或脸 部，优选脸部，特别是眼睛、唇的周围区域。
[0095] 本发明主旨还是本发明的北美金缕梅提取物，局部用于与皮肤和/或粘膜和/或头 皮的坚固性和/或弹性损失有关的病理状态的护理和/或皮肤病治疗，例如酒糟鼻、毛细血 管扩张、日光性弹力组织变性、病态皮肤松弛症和/或妊娠纹。
[0096] 有利的是，本发明的北美金缕梅提取物存在于含有局部应用可接受的皮肤病学赋 形剂的皮肤病学组合物中。
[0097] 优选含有的本发明的提取物的浓度为相对于皮肤病学组合物总重量的I X HT4至 10% (重量比），最好为I X HT4至5 %，更特别为I X KT3至3 % (重量比）。
[0098]通过阅读解释性说明书，参考附图和为了说明给出的实例，本发明的其它目的、特 征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的，它们不应当以任何方式限定本发明的范 围。
[0099]图1代表通过免疫标记人类成纤维细胞培养物上的腓骨蛋白5(有或无本发明的提 取物）的可视化(A:未经处理的对照;B:在本发明的北美金缕梅的提取物存在下处理的细 胞，提取物相对于培养基的浓度为〇. 1 % (v/v))。
[0100]图2代表通过免疫标记人类成纤维细胞培养物上的弹性蛋白（有或无本发明的提 取物）的可视化(A:未经处理的对照;B:在本发明的北美金缕梅的提取物存在下处理的细 胞，提取物相对于培养基的浓度为〇. 05% (v/v))。
[0101] 图3代表通过免疫标记人类成纤维细胞培养物上的胶原蛋白I型(有或无本发明的 提取物)的可视化(A:未经处理的对照;B:在本发明的北美金缕梅的提取物存在下处理的细 胞，提取物相对于培养基的浓度为〇. 1 % (v/v))。
[0102] 图4代表通过免疫标记重建皮肤模型上的弹力素的可视化(4a:阴性对照;4b:被辐 射的对照;4c:在本发明的北美金缕梅的提取物存在下处理的皮肤，提取物相对于培养基的 浓度为 0.1%(v/v))。
[0103] 实施例构成了本发明的不可分割的部分，根据作为一个整体纳入的说明书，相对 于任何现有技术而言为新的任何特征(包括示例）以其功能及其通用性质构成本发明的不 可分割的部分。
[0104] 因此，每个实施例具有一般性范围。
[0105] 此外，在实施例中，除非另有说明，温度以摄氏度表示，压力为大气压。
[0106] 实施例1:通过水提法制备本发明的北美金缕梅的提取物
[0107] a)将地上部分(此处为叶子)磨碎，然后在水中于室温下（即18 - 25°C，此处为约20 °C)浸渍2小时，磨碎的北美金缕梅叶的量为相对于植物/水总重量的5%(重量比）。
[0108] 通过以每分钟8000转(rpm)离心分离不溶物，以0.45μπι过滤，回收含有本发明水性 提取物的液体。测定pH，将其调节至5 - 7.5的范围。
[0109 ]该提取物根据后面的实施例以各种剂量在最终培养基中测试。
[0110]该提取物也可以如实施例5中所示以化妆品成分配制。
[0111] b)将北美金缕梅叶磨碎，然后以5 % (w/w)的量在水中浸渍，浸渍温度优选0 - 20 °C，优选于4°C浸渍。
[0112] 浸渍时间优选在30分钟至24小时，此处为16小时，浸渍在搅拌下进行。
[0113] 将溶液离心，优选以每分钟8000转(rpm)离心10分钟，回收上清液。将上清液在具 有各种截滤阈值的滤器上超声过滤，特别是〇. 45μπι的滤器。
[0114] 如此获得的提取物可以直接以液体形式使用。
[0115] c)将北美金缕梅叶磨碎，然后以5%(w/w)的量在75%/25%(v/v)的水/ 丁二醇混 合物中、于优选温度0 - 20°C(此处为4°C)浸渍。浸渍时间优选为30分钟至24小时，此处为16 小时，浸渍在搅拌下进行。
[0116] 将溶液离心，优选以每分钟8000转(rpm)离心10分钟，回收上清液。将上清液在各 种截滤阈值的滤器上超声过滤，特别是〇. 45μπι的滤器。
[0117] 随后将如此获得的提取物干燥，特别是在麦芽糊精类型的载体上干燥，然后以1% (w/w)的量再溶于水。
[0118] 实施例2:本发明的北美金缕梅提取物增加 LOXL基因表达的性能的证明
[0119] 原理：
[0120]采用定量RT-PCR方法在标准培养条件下测定LOXL基因的表达。其表达水平通过 ACTIN管家基因与细胞数相关。
[0121] 实验方案：
[0122] 1)培养方案
[0123] 将源自62岁供体腹部活检的正常人成纤维细胞(NHFs)于37°C、5%C02中在成纤维 细胞-特异性-培养基中单层培养。
[0124] 将在P8中的细胞以25000个细胞/cm2的密度接种于24孔板中，每个条件的N = 4,在 对成纤维细胞生长特异性的FGM培养基(成纤维细胞生长培养基，Promocell)中培养。
[0125] 2)试验用活性成分的应用
[0126] 将实施例la)中获得的北美金缕梅提取物在试验用培养基中以终浓度(0.01 % (v/ V))应用于在完全FGM培养基中融合的细胞24小时。通过在PBS中冲洗终止细胞处理过程，将 板于-80°C冷冻干燥，同时随后进行总RNA的提取。
[0127] 未经处理的对照仅单独采用FGM培养基进行试验。
[0128] 3)总RNA 提取
[0129] 提取以单层培养的成纤维细胞的总RNA(SV96总RNA分离系统试剂盒(Promega))， 通过分光光度法于260/280nm定量，于-80°C冻结用于随后的Q-RT-PCR。
[0130] 4)定量逆转录聚合酶链反应(Q-RT-PCR)
[0131] 扩增链反应采用Quantitect SYBR GreenKit愈（Qiagen,USA)进行。采用的引物 详细描述于表1。在PCR板中制备50μ1的PCR混合物(待其解冻后），该混合物含有10μ1的5ng/ ml的RNAs、25μ1的SybrGreen混合物、0.5μ1的酶混合物和0.625μ1的400μΜ的各种引物以及 适量的水。然后将PCR板以1500rpm离心Imin。
[0132] 然后，在对各种基因具有特异性的引物(表1)存在下，将对相关基因和肌动蛋白基 因具有特异性的信使RMs通过定量RT-PCR扩增并定量测定。
[0133] 表1:用于RT-PCR的引物序列
性纤维形成和坚固性的能力。
[0144] 实施例3:弹性纤维和胶原纤维形成增加的可视化：
[0145] 方案：
[0146] 将源自62岁供体腹部活检的成纤维细胞在FGM已知成分培养基(Promocell)中以 第8次传代在载玻片（Iabtek)上培养直到融合。在融合的当天，将细胞采用活性成分仅在 FGM培养基中处理，或者在补充有维生素C(5μg/ml)的培养基中处理。将培养基每2天更新一 次，培养3天用于胶原蛋白分析，培养6天用于弹性纤维(弹性蛋白和腓骨蛋白5)分析。测试 根据实施例la)获得并在培养基中稀释至0.1% (相对于培养基）（v/v)的北美金缕梅提取 物，每次变更培养基重新测试。未处理的对照相当于单独使用培养基，在分析胶原蛋白的情 况下补充5μg/ml的维生素C，或者在分析弹性蛋白和腓骨蛋白5时补充0.1ng/ml的TGF0-1。
[0147] 在培养结束时，撤除培养基，将细胞在磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)中洗涤，然后 于-20°C在甲醇中固化以便于进行免疫标记。
[0148] 在此情况下，采用免疫荧光技术进行标记。采用PBS冲洗除去甲醇后，将非特异性 抗原部位采用PBS-I % BSA (牛血清白蛋白）溶液阻断1小时。
[0149] 将在roS/l%BSA中稀释的一级抗体置于载玻片上，温育1小时。将IgG对照同种型 置于阴性对照上(代替一级抗体）。通过采用PBS冲洗二次除去过量的未结合抗体。
[0150] 将细胞在黑暗中与能够识别一级抗体的二级抗体溶液一起培养。因为该二级抗体 能够与荧光色素 (Alexa Fluor 488)偶合，因此其能够在荧光显微镜下显现相关蛋白。然后 将载玻片采用PBS冲洗三次，采用含有核标记物DAPI (4'，6'_二脒基-2-苯基吲哚） (Invitrogen)的封固剂封固。最后，可以采用共焦显微镜观察载玻片。
[0151] 表3:用于免疫标记的抗体
[0153] 结果：
[0154] 结果如图1、2和3所示。
[0155] 3a)定量测定趋向（positive)腓骨蛋白5的纤维长度(μπι): LUIb/」 开焦M儆镜观祭铦呆如图1所不。
[0158] 结论：
[0159] 当在本发明的北美金缕梅提取物存在下进行培养时，腓骨蛋白5位于弹性纤维上 (图1B)，而当没有提取物存在(未处理的对照)下进行培养时，它是弥散的（图1A)。这说明本 发明的提取物能够增加弹性纤维的形成，特别是通过将它们组织到成熟的弹性纤维中而使 得所述纤维质量更好。
[0160] 3b)定量测定趋向弹性蛋白的纤维长度(μπι):
[0162] 共焦显微镜观察结果如图2所示。
[0163] 结论：
[0164] 当在本发明的北美金缕梅提取物存在下进行培养时，弹性蛋白以纤维状呈现（图 2Β)，而当没有提取物存在(未处理的对照）时，它呈现为球状、无序形式（图2Α)。这说明本发 明的提取物能够增加弹性纤维的形成，特别是通过将它们组织到成熟的弹性纤维中而使得 所述纤维质量更好。
[0165] 3c)定量测定胶原蛋白I型形成的增加(作为未处理对照的百分值）