施氏假单胞菌jsd-008及其对有机磷农药的降解作用的制作方法

专利名称：：施氏假单胞菌jsd-008及其对有机磷农药的降解作用的制作方法
技术领域：
：本发明属于化学农药生物降解
技术领域：
，涉及一株土生施氏假单胞菌/^ew/OTOMSsf"&er/'JSD-008及其对有机磷农药毒死蜱和甲基对硫磷的降解作用，可用于土壤农药污染的原位修复工程。
背景技术：
：化学农药是重要的农业生产资料，对作物的丰产丰收起着重要的作用，其中一些品种结构稳定，不易降解，常造成严重的环境污染。科学研究发现，在自然界中一些特定微生物类群具有分解和转化农药的功能，可将化学农药分解为无毒的化合物，这一过程被称为生物降解。但自然中这类微生物的数呈冇限，为了加速这一过程，可以通过人工添加微生物的办法来实现，通常称为生物修复。二十世纪卯年代，欧洲一些发达国家开始将生物降解技术应用于污染物的处理工程，目前生物降解技术已广泛用于土壤、水体、海滩的化学污染治理。我国有200余种有机磷农药，产量占全国农药总量的一半以上。有机磷农药污染是我国农业生产中最突出的问题，也是影响我国农产品出口贸易的主要障碍之一。有机磷农药——毒死蜱广谱、高效，在蔬菜、水稻等作物上广泛使用。有关毒死蜱降解齒的研究，国内外已有一些报道，分离得到一些菌株，如微球菌M'cracocctwsp.M-36禾口AG-43(GuhaAetal.，1997);不动杆菌爿d"e/otoc/ersp.(肖红利等，2005);产碱菌属sp.,布鲁氏杆菌fin狄〃asp.，叶杆菌/V"^fTO'"ofo3Cto"sp.(张瑞福等，2004);曲霉J^perg/〃wssp.(刘新等，2003);木霉7Wc/2oafe,/Hosp.(刘新等,2002);产碱杆菌属^fcfl/^e""(杨丽等，2005);青霉属Pe"/"'肌"w,粪产碱齒力ca/Zge""/aecato，头状葡萄球菌aap/^/ococcrwcap/泡(刘新等，2002);沼泽红假单胞菌兄；7/aw欣/s(张德咏，，2005);玫瑰色微球菌Mracoccus/"fe"sp.，镰胞霉Furan'MWsp.(王金花等，2004)等，这些齒株对森死蜱具有一定的降解能力。关于施氏假单胞菌(尸sei/必/ro/7as"u^e/7')，前人报道，其具有反硝化作用，可用于降解苯酚、4-氯酚、2，4-二氯苯酚萘、联苯、废水中的硝酸盐，以及降解二苯并噻吩(DBT)用于石油脱硫等(Romansa/.,2001;Hou"aZ.，2005;Erkan"a/.,2006;Agnieszkae^/.，2005;Liue,。/，2006)。专利方面，主要是关于植物病害防治、水产病害防治、卫生除垢、石化脱硫、降解硝基苯等方面的菌株和应W,未见报道施氏假单胞菌对毒死蜱的降解作用和发现相关功能的菌株。本发明的目的在于从土壤中分离得到对毒死蜱具有高效降解能力的施氏假单胞菌菌株，为农田有机磷农药残留的降解，以及降解菌剂的生产及应用提供基础。
发明内容本发明从土壤中分离筛选得到一株对毒死蜱以及甲基对硫磷高效降解的菌株；本发明提供该菌株的鉴定特征和16SrDNA序列；本发明在确定菌株降解作用的基础上，提供了应用该菌株降解十壤有机磷毒死蜱的方法。本发明的技术方案概述如下本发明所提供的土生施氏假单胞菌，其特征在于该菌株为/^ei7flb腳/^sst"teeriJSD-008，2006年6月23日保存于"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)"，其保藏号为CGMCCNo.1738菌株分离与筛选该菌株Pwitowo"MWMteehJSD-008是从被有机磷农药高度污染的农药厂排污口土壤中分离得到的，具体筛选、驯化步骤为在农药厂排污口采样(山东泰安)，取土样5g，在无菌操作条件下，接种到装有50ml以毒死蜱为唯一碳源或唯一氮源选择性培养基的三角瓶中，加入毒死蜱原药，使其终浓度为300mg/L,置于3(TC，180rpm摇床中培养，每隔7天按照10%的接种量转接，每次转接毒死蜱的浓度提高200mg/L，至培养基中毒死蜱的终浓度达到1100mg/L为止。取驯化培养后的培养物，梯度稀释10—6,10—7，10—8涂布于各自驯化使用的选择性培养基(以毒死蜱为唯一碳源无机盐培养基或以毒死蜱为唯一氮源无机盐培养基)平板上，毒死蜱的浓度为500mg/L,置于3crc恒温培养箱中培养7天，挑取菌落形态不同的单菌落划线于选择性培养基上，再挑单菌落划线，反复三次，以纯化菌株，并转入斜面保存。菌株形态鉴定特征菌株为革兰氏阴性，无芽孢，菌体细胞长杆状(图l)，菌体有一根极生鞭毛(图2)。菌落在牛肉蛋白胨固体培养基上，菌落圆形，边缘整齐，表面隆起，乳白色，不透明；生长后期菌落表面出现褶皱，菌落黄色。在以毒死蜱为碳源的无机盐固体培养基上，菌落圆形，边缘整齐，表面隆起，土黄色，不透明，菌落中心凹陷，培养5天菌落周围形成明显的降解圈。菌株生理生化特征碳源利用能利用乙醇和甘油，不能利用甲醇、丙酮、DL乳酸。氧和二氧化碳的需要开管处理，液面处先变混浊，显红色，然后从上至下逐渐显红色，变混浊，说明菌体先在液面生长，随着氧气逐渐向下渗透，菌体逐渐生长；闭管处理，与对照相比，培养基没有显色，菌体完全没有生长；说明此菌株为严格好氧。葡萄糖氧化发酵只有开管处理培养基产酸变黄，说明此菌株为氧化型。乙醇氧化酸变黄为阳性，此菌株能够氧化乙醇。氧化酶阳性。接触酶阳性。DNA酶试管培养基由蓝色变为黄色，说明DNA酶阳性。高温6(TC:不能生长。菌株16SrDNA序列该菌株的16SrDNA基因片段大小约为1.4kb。重组质粒测序后获得核苷酸序列，登陆www.ncbi.nlm.nlh.gov网站，进行BLAST比对，比对结果表明，该菌株与施氏假单胞菌达到99%的同源性，说明该菌株在分子系统发育分类学上属于施氏假单胞杆菌，学名为Pse^o/no"^W"fem'。这--结果与菌株的形态和生理生化特性鉴定结果相符，相互印证。JSD-008菌株16SrDNA核普酸序列比对结果>gi|66775526|gb|DO059546.11户sewcto7w0"asWwtem.isolateSAl16SribosomalRNAgene，partialsequenceLength=1501Score=2924bits(1475)，Expect=0.0Identities=1491/1495(99%)，Gaps=1/1495(0%)Strand=Plus/MinusQuery37AGAGTTTGATCCTGG-TCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGC95Sbjct1498AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGC1439Query96GGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCT155Sbjct1438GGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCT1379Query156GCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGA215Sbjct1378GCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGA1319Query216GAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTT275Sbjct1318GAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATT'AGCTAGTT1259Query276GGCGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA335Sbjct1258GGCGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA1199Query336CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA395Sbjct1198CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA1139Query396ATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG455Sbjct1138ATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG1079Query456CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACA515Sbjct1078CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACA1019Query516GAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTA575Sbjct1018GAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTA959Query576ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCC635Sbjct958ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCC899Query636CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTG695Sbjct898CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTG839Query696GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG755Sbjct838Query756Sbjct778Query816Sbjct718Query876Sbjct658Query936Sbjct598Query996Sbjct538Query1056Sbjct478Query1116Sbjct418Query1176Sbjct358Query1236Sbjct298Query1296Sbjct238Query1356Sbjct178Query1416Sbjct118Query1476Sbjct58GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG779ACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT815ACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT719ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAG875ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAG659TGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCA935TGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCA599AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG995AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG539AAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCTGAGAACCTGCCAGAGATGGCGGGGTGCCTTCGG1055AAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCTGAGAACCTGCCAGAGATGGCGGGGTGCCTTCGG479GAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA1115GAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA419GTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAA1175GTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAA359GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT1235GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT299ACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGT1295ACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGT239GGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA1355GGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA179AGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG1415AGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG119TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTC1475TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTC59GGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA1530GGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA4菌株的降解作用本发明的施氏假单胞菌JSD-008菌株，能高效降解二乙基有机磷农药毒死蜱(降解率在85%以上)和二甲基有机磷农药甲基对硫磷，而且对结构上差异较大的拟除虫菊酯类农药二氟氯氰菊酯、氯氰菊酯也有一定的降解能力。本发明的施氏假单胞菌JSD-008菌株降解毒死蜱产生的主要中间产物为三氯吡啶醇，降解甲基对硫磷的中间产物为硝基苯酚。本发明的施氏假单胞菌JSD-008菌株，在应用前在毒死蜱为唯一碳源的培养基上传2-3代，在3(TC下耗氧培养。本发明的施氏假单胞菌JSD-008菌株，既可以在完全营养培养基上生长，也可以在含有机磷毒死蜱的基本无机盐培养基中生长。本发明的施氏假单胞菌JSD-008菌株的应用方法用一般细菌培养基(如，牛肉膏蛋白胨培养基)培养72小时，可直接将含有菌体的发酵液作为降解剂，直接喷施于湿潤的土壤表面，即可达到高效降解土壤中毒死蜱和甲基对硫磷的效果(降解率为85-100%)。本发明的有益效果本发明的菌株JSD-008，可将有机磷毒死蜱和甲基对硫磷进行快速的降解，适用丁-土壤有机磷农药污染的原位修复。图1.菌株JSD-008菌体扫描电镜照片图2.菌株JSD-008菌体透射电镜照片具体实施方式实施例l:菌株筛选方法菌株的驯化培养取农药污染区的土样5g，在无菌操作条件下，接种到装有50ml以毒死蜱为唯一碳源或唯一氮源选择性培养基的三角瓶中，加入毒死蜱原药，使其终浓度为300mg/L，置于3(TC,180rpm摇床中培养，每隔7天按照10%的接种量转接，每次转接毒死蜱的浓度提高200mg/L，至培养基中毒死蜱的终浓度达到1100mg/L为止。菌株的分离与纯化取驯化培养后的培养物，梯度稀释icr6，icr7，10'8涂布于各自驯化使用的选择性培养基(以毒死蜱为唯一碳源无机盐培养基或以毒死蜱为唯一氮源无机盐培养基)平板上，毒死蜱的浓度为500mg/L，置于3CTC恒温培养箱中培养7天，挑取菌落形态不同的单菌落划线于选择性培养基上，再挑单菌落划线，反复三次，以纯化菌株，并转入斜面保存。实施例2:菌株对毒死蜱的降解效率将分离纯化的菌株接种于分离使用的选择性培养基上，待其生长丰茂后，制成菌悬液，接种于含50mg/L毒死蜱的50ml无机盐培养基中，同时设不接菌的空白对照，摇床培养(30'C，180rpm)5天，用二氯甲烷萃取，利用气相色谱测定培养液中毒死蜱的含量，计算菌株对毒死蜱的降解率。降解率％=(培养后体系中残留的农药量/农药起始加入量)"00%结果显示JSD008菌株对毒死蜱的降解率达到了85.7%,以毒死蜱为唯一碳源的无机盐培养的空白对照降解率为15.6%,以毒死蜱为唯一氮源的无机盐培养的空白对照降解率为13.4%。实施例3:菌株的16SrDNA序列测定总DNA的提取取培养过夜的菌液1.5ml,离心5000rpm,2min，收集沉淀；加入600ul65。C预热的细胞裂解液，充分混匀，加入1/10体积的Tris饱和酚，65'C保温半小时，并不时轻柔振荡；加入等体积酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，离心13000rpm，10min;取上清，加入等体积氯仿/异戊醇再抽提一次，离心，13000rpm，10min;取上清，加入1/10体积3M醋酸钠，加0.6体积预冷异丙醇，-7(TC放置10分钟；离心10000rpm,10分钟，弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥；加200ul去离子水复溶，加入1mg/ulRnase20ul，65'C，保温30min;补水至500ul，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，离心，13000rpm,10min;取上清，加入等体积氯仿/异戊醇再抽提一次，离心，13000rpm，10min;取上清，加入1/10体积3M醋酸钠，加0.6体积预冷异丙醇，-70'。放置10分钟；离心10000rpm，10分钟，上清液弃去，70。/。乙醇洗涤沉淀，真空干燥，复溶于20ul超纯水，取4ul经0.8。/。琼脂糖凝胶电泳，其余-2(TC保存。16srDNA的PCR扩增引物合成，以提取菌株的DNA为模板，PCR体系进行扩增。PCR扩增条件94.5。C预变性4min;94。C变性45sec;52。C退火lmin;72。C延伸1.5min;31cycles;72。C补充延伸7min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检观纟，回收。PCR产物回收、纯化使用纯化试剂盒。引物序列及其在大肠杆菌16srDNA上的相应位点<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>连接产物转化将连接产物10uI全部转化至DH5a感受态细胞lOOul中，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中放置30分钟；将离心管置于42'C水浴中放置60卯秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管；向每个离心管中加入500pl无菌的LB培养基，混匀后置于37。C摇床振荡培养45分钟(150转/分钟)，使菌体复苏；将离心管内容物混匀，吸取10(^1已转化的感受态细胞与IPTG溶液和X-gal溶液混匀，涂在含有Amp的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开；将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37'C培养1216小时；挑取白色菌落。菌体PCR检测阳性克隆根据大肠杆菌16SrDNA的核苷酸序列设计引物，挑取白斑作为模板，按照如下PCR体系进行扩增。PCR扩增条件95'C预变性5min;94'C变性30sec;52'C退火30sec;72'C延伸2min;31cycles;72'C补充延伸10min。PCR产物用1。/。的琼脂糖检测。引物序列及其在大肠杆菌16srDNA上的相应位点<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>PCR扩增体系DNA模板上游引物(pmol/ul)下游引物(pmol/ul)10xTaq缓冲液dNTPMixture(2.5mMeach)Taq聚合酶(2.5u/ul)无菌去离子水半个白斑约lul0.5ul0.5ul2ul1.6ul0.2ul14.2ulTotal20ul重组质粒的鉴定重组质粒的提取:(l)挑取白斑接种于含有Amp(50ug/ml)的液体LB培养基中，37°C,200rpm培养过夜;(2)取1.5ml菌液,8000rpm离心1min，弃上清，除净LB培养基；(3)将沉淀重悬于100ul预冷的solutionI;(4)加入200ulsolutionII，颠倒混匀后冰浴5分钟(5)加入150ul预冷的solutionIII，混匀，冰浴5分钟；(S)离心12000rpm，5分钟；(7)取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇、氯仿很戊醇各抽提一次；(8)取上清,加入1/10体积3M醋酸钠，加0.6体积预冷异丙醇，-70匸放置10分钟；(9)离心10000rpm，10分钟，弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥；鹏加50u卜去离子水复溶，加入1mg/ulRnase4ul，37°C,保温1小时；ai)补水至500ul，加入等体积酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇各抽提一次；似取上清，加入1/10体积3M醋酸钠，加0.6体积预冷异丙醇，-7CTC放置10分钟；似离心13000rpm,10分钟，弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥；(W)加20u卜去离子水复溶；(15)提取的质粒经1%的琼脂糖电泳检测。重组质粒的酶切按照下表的体系进行酶切反应。37'C反应2小时，1%的琼脂糖电泳检测。反应体系重组质粒8ul10xbuffer22ulHindIIIlul__Total20ulDNA序列测定及分析重组质粒的测序由上海生物工程公司完成，应用www.ncbi.nlm.nlh.gov网站中的BLAST进行DNA序列分析。比对结果表明，该菌株与施氏假单胞菌达到99%的同源性。实施例4:菌株降解毒死蜱的主要中间产物含200mg/L毒死蜱的无机盐培养基中接种菌株达7.392xl(/个/ml，200rpm，3(TC摇床培养72小时后，培养基中残留的毒死蜱浓度为65.04mg/L,即毒死蜱的降解率达67.48%,生成三氯吡啶醇浓度为90.14mg/L(即毒死蜱几乎被转化为等摩尔的TCP);而未接菌的对照，培养基中残留毒死蜱的浓度为174.44mg/L，即降解率为12.78%。实施例5:菌株降解甲基对硫磷的中间产物接菌处理的培养基经二氯甲烷萃取后，进行气相色谱-质谱分析，得到质谱图，经NIST标准谱库检索，确定该物质为对硝基苯酚。而在没有接菌的对照中，没有检测到对硝基苯酚，因此，可以确定菌株降解甲基对硫磷产生的中间产物为对硝基苯酚。实例6:菌株降解效率与降解谱制备菌悬液，测量接种液的0D6()。，分别接种于含50mg/L农药的50ml无机盐培养基中，同时设不接菌的空白对照，30°C，180rpm，摇床培养96小时，萃取，利用气相色谱测定培养液中残留农药的含量。降解率(％)=(培养后体系中残留的农药量/农药起始加入量)><100%。当培养基中菌体浓度为9.10><108个/ml时，本菌株对三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率分别为54.64%、52.26%和16.33%，对甲基对硫磷的降解率为100%。权利要求1.施氏假单胞菌JSD-008及其对有机磷农药的降解作用，其特征为施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriJSD-008，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.1738。2.根据权利要求l所述的施氏假单胞菌JSD-008,其特征在于，菌体为革兰氏阴性，无芽孢，菌体细胞长杆状，有一根极生鞭毛；菌落在牛肉蛋白胨固体培养基上，菌落为不规则的斑块状，边缘凹凸不齐，表面隆起，乳白色，不透明，生长后期菌落表面出现褶皱，呈黄色;在以毒死蜱为唯一碳源的无机盐固体培养基上，菌落圆形，边缘整齐，表面隆起，土黄色，不透明，菌落中心凹陷，培养5天菌落周围形成明显的降解圈。3.根据权利要求1所述的施氏假单胞菌JSD-008，其特征在于，该菌株是从被有机磷农药高度污染的农药厂排污口土壤中分离得到的，菌株能利用乙醇和甘油，不能利用甲醇、丙酮、DL乳酸，严格好氧，氧化型，能够氧化乙醇，氧化酶阳性，接触酶阳性，DNA酶阳性，高温6(TC不能生长。4.根据权利1所述的施氏假单胞菌JSD-008，其特征在于，该菌株的16SrDNA序列如下37AGAGTTTGATCCTGG-TCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGC9596GGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCT155156GCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGA215216GAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTT275276GGCGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA335336CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA395396ATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG455456CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACA515516GAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTA575576ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCC635636CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTG695696GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG755756ACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT815816ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAG875876TGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCA935936AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG995996AAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCTGAGAACCTGCCAGAGATGGCGGGGTGCCTTCGG10551056GAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA11151116GTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAA11751176GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT12351236ACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGT12951296GGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA13551356AGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG14151416TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTC14751476GGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA15305.根据权利1所述的施氏假单胞菌对有机磷农药的降解作用，其特征是，JSD008菌株能将有机磷毒死蜱降解为三氯吡啶醇，能将甲基对硫磷降解为硝基苯酚，在含50mg/L毒死蜱的50ml无机盐培养基中，摇床培养5天(3(TC，180rpm)，菌株对毒死蜱的降解率可达到了85%,对甲基对硫磷的降解率达到100%。全文摘要本发明属于化学农药生物降解
技术领域：
，涉及一株土生施氏假单胞菌及其对有机磷农药的降解作用，该菌名称为施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriJSD-008，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)”，保藏号为CGMCCNo.1738。该菌株是从被有机磷农药污染的农药厂排污口土壤中分离得到的，其菌体和含菌体的发酵液可作为有机磷农药的降解剂，可将有机磷农药毒死蜱降解为三氯吡啶醇，将甲基对硫磷降解为硝基苯酚，适用于农田土壤农药污染的快速原位修复。文档编号A62D3/00GK101096644SQ20061009005公开日2008年1月2日申请日期2006年6月26日优先权日2006年6月26日发明者万方浩,周淑云,明谢,邱卫亮申请人:明谢