专利名称：一株乙羧氟草醚降解假单胞菌ys-03及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解化学农药，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工，具体涉及一株乙羧氟草醚降解假单胞菌YS-03及其应用。
背景技术：
含氟农药是近几十年来使用的新兴农药。氟原子具有半径小、电负性大的特点，将氟原子和含氟基团(如:_CF3)引入到具有生物活性的有机化合物中，能大大提高有机氟化物的稳定性和生理活性，从而成为当今研究和开发的热点。但含氟农药大量使用导致此类农药在土壤和水体环境中的残留，可能会对生态环境和人体健康构成潜在威胁，因此含氟农药在环境中的迁移、转化和分解等环境行为正受到日益关注。随着人们生活水平的提高和环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的直接危害和潜在影响亦愈来愈关注，人们迫切需要无农药残留污染的清洁的绿色农产品。但从目前我国的农业生产形式和人口状况来看，以停止农药使用降低农业产量为代价的无公害生产模式是行不通的，农药作为控制病虫害的有效手段还将继续在农业生产中发挥巨大的作用。如何能解决农业生产中的这个两难问题就成为各个学科的研究热点。实验室和实际应用研究都表明利用微 生物来降解消除土壤中的农药残留“库”容量，从而降低粮食、蔬菜、茶叶等农广品中的农药残留，提闻农广品的品质和经济价值是可行的。乙羧氟草醚(Fluoroglycofen-ethyl),是由美国罗姆-哈斯公司开发的一种二苯醚类除草剂，具有较高脂溶性和疏水性。该除草剂为触杀型，主要用于禾谷类作物防除阔叶杂草，具有活性高、杀草谱广、毒性低的特点，是一种很有市场前景的三氟甲基二苯醚类除草剂。它通过杂草茎叶吸收后进入细胞内部，破坏细胞膜，使细胞内容物溢出，对植物组织产生物理性伤害，最终导致死亡，可用于防除小麦、大麦、花生、大豆和稻田的苗后阔叶杂草等。目前，国内外有关乙羧氟草醚在环境中降解动态方面的研究不多，而生物修复技术因微生物本身能对各类不同的有机污染物进行降解和转化而具有巨大的潜力。因此，从自然环境中筛选得到能够去除乙羧氟草醚的有效菌种具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、三氟羧草醚等二苯醚类含氟除草剂的残留量降低90%以上。具有较广的降解谱，生产和使用成本较低。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。本发明提供一种消除乙羧氟草醚残留的降解菌，其菌株YS-03是一株革兰氏染色反应阴性菌，于2013年I月15日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC N0.7144，经鉴定是假单胞菌属iPseudomorms sp.)。主要生物学特性为G_，在LB固体培养基上菌落呈浅绿色，经结晶紫染色后在显微镜下菌为杆状，无芽孢，极生鞭毛，大小0.8^1.3X0.5^0.6 μ m ;接触酶阳性；氧化酶阴性；不能水解淀粉，不能液化明胶，伏-普反应阳性，甲基红反应阴性，不产生吲哚，水解吐温-80。该菌还能以乙羧氟草醚为唯一碳源进行生长。本发明提供了假单胞菌YS-03在乙羧氟草醚讲解中的应用。在实验室摇瓶培养条件下乙羧氟草醚的降解率达90%以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。本发明还提供了含有所述假单胞菌YS-03的菌剂。本发明还提供了所述假单胞菌YS-03生产菌剂的方法。所述假单胞菌YS-03生产菌剂的方法，包括:斜面种一摇瓶种一种子罐一生产罐一产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。所述生产菌剂的方法，具体为:
1)将乙羧氟草醚残留的假单胞菌YS-03的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；
2)将步骤I)培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液。3)将步骤2)所述种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。步骤I)中所述的LB培养基配方为=NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L, pH7.0。
步骤2)所述的种子罐所用的培养基配方为:葡萄糖0.8%，(NH4) 2S04 1%，K2HPO4
0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。步骤2)所述种子罐和步骤3)所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为
1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30_35°C，步骤2和3的整个工艺流程培养时间为48-60小时。所述菌剂在乙羧氟草醚降解中的应用。本发明所述的假单胞菌YS-03具有较广的降解谱，能使土壤中乙羧氟草醚的残留量降低90%以上，大大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。所制备的菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。田间试验表明，用本发明生产的降解菌剂直接施用于土壤，可使土壤中农药残留量降低90%以上。本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。
图1本发明所述的假单胞菌YS-03的菌落照片；图2本发明所述的假单胞菌YS-03的结晶紫染色照片；
图3含有假单胞菌YS-03菌剂的土壤降解实验结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1乙羧氟草醚降解假单胞菌YS-03的筛选和分离
取从生产乙羧氟草醚的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥5.0ml加入乙羧氟草醚浓度为100mg/L的IOOml无机盐液体培养中，其配方为:每升含1.50 gK2HPO4^0.50 g KH2PO4^0.20 g MgSO4X 7H20、1.00 g NaClU.00 g (NH4)2SO4, pH 7.0，于160r/min, 30°C条件下振荡培养，每隔5天按5%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次。取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，配成KT1的富集液，再吸取
1.0ml配好的KT1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10_2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含乙羧氟草醚的浓度为100mg/L无机盐固体培养基(配方为:每升含1.50g K2HPO4,
0.50g KH2P04、0.20g MgSO4X 7H20、1.0Og NaCl,1.0Og (NH4)2SO4,20.0Og 琼脂，pH 7.0)上，30°C培养7天。7天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于5.0ml的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为=NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉
5.00g/L, pH7.0于8000r/min的条件下离心2min,倒去上清液,加入5.0ml的无菌水摇勻，仍于8000r/min的条件下离心2min,按此方法用无菌水洗两遍后,加入5.0ml无菌水重悬该菌。吸取1.0ml该菌液加入IOOml乙羧氟草醚浓度为100mg/l的无机盐液体培养基中，于160r/min, 30°C条件下振荡培养4天后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株囷株保存，进彳丁后续实验。将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为=NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.0Og/L,酵母粉5.00g/L,琼脂20.00g/L, pH7.0, 30°C恒温培养48h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态(1000X)。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。其菌落图片见图1，鉴定为假单胞菌属sp.);命名为:YS-03。其结晶紫染色照片见图2所示，主要生物学特性为G_，杆状，无芽孢，极生鞭毛，大小0.8^1.3X0.5 0.6μ m ；在LB固体培养基上30°C恒温培养48h后，其菌落呈接触酶阳性；氧化酶阴性；不能水解淀粉，不能液化明胶，伏-普反应阳性，甲基红反应阴性，不产生吲哚，水解吐温-80。实施例2假单胞菌YS-03的摇瓶降解实验
在含100mg/L乙羧氟草醚的无机盐培养基中，其配方为:每升含1.50 g K2HP04、0.50gKH2P04、0.20g MgS04X7H20、l.00g NaCl ,1.0Og (NH4)2SO4, pH 7.0，按 5% 的接种量接种YS-03，于30°C振荡培养，72小时取样测定。与空白相比，处理样品的吸收峰明显下降，乙羧氟草醚被降解90%以上。实施例3含有假单胞菌YS-03菌剂的制备 将实施例1筛选和分离的乙羧氟草醚降解假单胞菌YS-03的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的1000ml摇瓶中，LB培养基配方为:酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L, NaCl 10.00g/L, pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%，酵母膏 0.02%, pH值7.2-7.5。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，将上述培养好的摇瓶菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.8。将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1: 1.2，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。实施例4含有假单胞菌YS-03菌剂的制备
将实施例1筛选和分离的乙羧氟草醚降解假单胞菌YS-03的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的1000ml摇瓶中，LB培养基配方为:酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L, NaCl 10.00g/L, pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%，酵母膏 0.02%, pH值7.2-7.5。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至30°C后，将上述培养好的摇瓶菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为200转/分，无菌空气通入量为1:1。将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30° C ，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180转/分，整个工艺流程培养时间为48小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。实施例5含有假单胞菌YS-03菌剂的土壤降解实验
第一组:取20目过筛后的自然风干菜地土壤420g，加入乙羧氟草醚至20mg/kg，搅拌均匀，喷施水使其含水量达到饱和含水量的60%。然后平均分装入6个塑料杯中，每杯70g。向其中三个塑料杯中分别加入权利要求3或4制备的菌剂，接种量为0.lml/g，搅拌均匀；另外三个塑料杯中分别加入同体积的无菌水作为不加菌液对照。共两种处理，每个处理均是三个重复。第二组:将20目过筛后的自然风干菜地土壤420g湿热灭菌两次，加入乙羧氟草醚至20 mg/kg,搅拌均匀，喷施水使其含水量达到饱和含水量的60%。然后平均分装入6个塑料杯中，每杯70g。向其中三个塑料杯中分别加入权利要求3或4制备的菌剂，接种量为
0.lml/g，搅拌均匀；另外三个塑料杯中分别加入同体积的无菌水作为不加菌液对照。共两种处理，每个处理均是三个重复。
将两组实验中的四种处理样品置于30±1°C培养箱中用黑纸片包住于黑暗条件下恒温培养，适当补充无菌水，分别于一周、两周、三周后取样测定乙羧氟草醚在土壤中的降解率。由图3可知，加入菌体后，在灭菌和不灭菌条件下的土壤中，乙羧氟草醚的降解率分别提高了 80%和50%，可见投菌后大 大提高了土壤中乙羧氟草醚的降解效率。
权利要求
1.一株乙羧氟草醚降解假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株YS-03,其保藏编号为CGMCC N0.7144。
2.权利要求1所述的假单胞菌YS-03在乙羧氟草醚讲解中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的假单胞菌YS-03的菌剂。
4.一种权利要求3所述的菌剂的生产方法:包括:斜面种一摇瓶种一种子罐一生产罐一产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。
5.根据权利要求4所述的菌剂的生产方法，具体为: 1)将乙羧氟草醚残留的假单胞菌YS-03的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期； 2)将步骤I)培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，即种子液； 3)将步骤2)所述种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。
6.根据权利要求5所述的菌剂的生产方法，其特征在于:步骤I)中所述的LB培养基配方为=NaCl 10.00g/L,蛋白胨 10.00g/L，酵母粉 5.00g/L，ρΗ7.0。
7.根据权利要求5所述的菌剂的生产方法，其特征在于:步骤2)所述的种子罐所用的培养基配方为:葡萄糖 0.8%, (NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO30.3%，酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。
8.根据权利要求5所述的菌剂的生产方法，其特征在于:步骤2)所述种子罐和步骤3)所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35°C，步骤2与步骤3的整个工艺流程培养时间为48-60小时。
9.权利要求5-8任一项所述的生产方法所制备的菌剂在乙羧氟草醚降解中的应用。
全文摘要
本发明提供一种消除废水中乙羧氟草醚残留的降解菌剂，属于生物高技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌YS3，经鉴定为假单胞菌属(Pseudomonassp.)。主要生物学特性为G-，杆状，无芽孢，极生鞭毛，大小0.8~1.3×0.5~0.6μm；接触酶阳性；氧化酶阴性；不能水解淀粉，不能液化明胶，伏-普反应阳性，甲基红反应阴性，不产生吲哚，水解吐温-80。降解菌产品直接施用可使水中农药残留量降低90％上。
文档编号A62D101/28GK103114067SQ20131008321
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者张永乐, 陈建中, 张金 申请人:江苏南资环保科技有限公司