专利名称：一种乙羧氟草醚降解菌及其生产的菌剂的制作方法
技术领域：
本发明一种乙羧氟草醚残留降解菌及其生产的菌剂，属于生物高技术领域，是利 用微生物的方法降解化学农药，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
背景技术：
含氟农药是近几十年来使用的新兴农药。氟原子具有半径小、电负性大的特点，将 氟原子和含氟基团(如_CF3)引入到具有生物活性的有机化合物中，能大大提高有机氟化 物的稳定性和生理活性，从而成为当今研究和开发的热点。但含氟农药大量使用导致此类 农药在土壤和水体环境中的残留，可能会对生态环境和人体健康构成潜在威胁，因此含氟 农药在环境中的迁移、转化和分解等环境行为正受到日益关注。随着人们生活水平的提高和环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的直接 危害和潜在影响亦愈来愈关注，人们迫切需要无农药残留污染的清洁的绿色农产品。但从 目前我国的农业生产形式和人口状况来看，以停止农药使用降低农业产量为代价的无公害 生产模式是行不通的，农药作为控制病虫害的有效手段还将继续在农业生产中发挥巨大的 作用。如何能解决农业生产中的这个两难问题就成为各个学科的研究热点。实验室和实际 应用研究都表明利用微生物来降解消除土壤中的农药残留“库”容量，从而降低粮食、蔬菜、 茶叶等农产品中的农药残留，提高农产品的品质和经济价值是可行的。乙羧氟草醚(Fluoroglycofen-ethyl)，是由美国罗姆-哈斯公司开发的一种除草 剂，该除草剂为触杀型，主要用于禾谷类作物防除阔叶杂草，具有活性高、杀草谱广、毒性低 的特点，是一种很有市场前景的三氟甲基二苯醚类除草剂。它通过杂草茎叶吸收后进入细 胞内部，破坏细胞膜，使细胞内容物溢出，对植物组织产生物理性伤害，最终导致死亡，可用 于防除小麦、大麦、花生、大豆和稻田的苗后阔叶杂草等。
发明内容
技术问题本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一 种新型的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、三氟羧草醚等二 苯醚类含氟除草剂的残留量降低90%以上。具有较广的降解谱，生产和使用成本较低。使 用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证 农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。技术方案下面为本发明的主要内容本发明提供一种消除乙羧氟草醚残留的降解菌，其菌株MBLHY-I是一株革兰氏染 色反应阴性菌，于2010年5月18日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中 心，保藏编号CGMCC NO. 3853，经鉴定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)(图2)。主要 生物学特性为G-，杆状，无芽孢，极生鞭毛，大小0. 8 1. 3 X 0. 5 0. 6 μ m ；接触酶阳性；氧 化酶阴性；不能水解淀粉，不能液化明胶，伏-普反应阳性，甲基红反应阴性，不产生吲哚， 水解吐温-80。
该菌还能以乙羧氟草醚为唯一碳源进行生长。在实验室摇瓶培养条件下乙羧氟草 醚的降解率达90%以上(图1)。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。使用上述乙羧氟草醚残留降解菌生产菌剂的工艺为斜面种一摇瓶种一种子罐一 生产罐一产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。本发明的详细实施步骤为1)将乙羧氟草醚残留的降解菌MBLHY-I的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至 对数期；2)将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长 期。种子罐所用的培养基配方为葡萄糖0. 8%, (NH4)2S041%, K2HPO4O. 2%, MgSO4O. 05%, NaCl 0. 01%, CaCO3O. 3%，酵母膏 0. 02%，pH 值 7. 2-7. 5。3)将种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养 基相同。在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 0.6-1.2，搅拌速度为 180-240转/分，培养温度为30-35°C，整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵完成后 培养液即为菌剂。有益效果使用该发明生产的农药残留降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果 好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使 用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意 义。降解菌MBLHY-I具有较广的降解谱，能使土壤中乙羧氟草醚的残留量降低90%以上，大 大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。使用该降解菌剂可以在农 作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量 符合绿色食品要求。田间试验表明，用本发明生产的降解菌剂直接施用于土壤，可使土壤中农药残留 量降低90%以上(图2)。本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问 题，既充分发挥了化学农药在植物病虫草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒 无公害的绿色农产品。
四
图1降解菌MBLHY-I菌体结晶紫染色照片图2 土壤降解实验结果
五具体实施例方式1、摇瓶降解实验在含100mg/L乙羧氟草醚的无机盐培养基(无机盐培养基配方为每升含 1. 5gK2HP04、0. 5g ΚΗ2Ρ04、0· 2g MgSO4 ·7Η20、1. Og NaClU. Og(NH4)2SO4,pH 7.0)中，按 5%的 接种量接种MBLHY-1，于30°C振荡培养，72小时取样测定。与空白相比，处理样品的吸收峰 明显下降，乙羧氟草醚被降解90%以上。2、土壤降解实验
4
第一组取过筛(2mm)后的自然风干菜地土壤60g，加入乙羧氟草醚至100mg/kg， 搅拌均勻，喷施水使其含水量达到饱和含水量的40%。然后平均分装入6个塑料杯中，每杯 IOgo向其中三个塑料杯中分别加入离心后无菌水重悬菌液(OD6tltlnm ^ 2. 0) 1ml，搅拌均勻； 另外三个塑料杯中分别加入Iml无菌水作为不加菌液对照。共两种处理，每个处理均是三
个重复。第二组将过筛(2mm)后的自然风干菜地土壤60g湿热灭菌两次，加入乙羧氟 草醚至100mg/kg，搅拌均勻，喷施水使其含水量达到饱和含水量的40%。。然后平均分 装入6个塑料杯中，每杯10g。向其中三个塑料杯中分别加入离心后无菌水重悬菌液 (OD600nm ^ 2. 0) 1ml，搅拌均勻；另外三个塑料杯中分别加入Iml无菌水作为不加菌液对照。 共两种处理，每个处理均是三个重复。将两组实验中的四种处理样品置于30°C培养箱中黑暗条件下恒温培养，适当补 充无菌水，分别于一周、两周、三周后取样测定乙羧氟草醚在土壤中的降解率。由图2可 知，加入菌体后，在灭菌和不灭菌条件下的土壤中，乙羧氟草醚的降解率分别提高了 80%和 50 %，可见投菌后大大提高了土壤中乙羧氟草醚的降解效率。以下叙述本发明的实施例。将本发明的微生物乙羧氟草醚残留的降解菌MBLHY-I的原种在培养皿上活化， 并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基(LB培养基 配方g/L 酵母膏5. 00，蛋白胨10. 00，NaCl 10. 00，pH 7. 0) 1000ml摇瓶中，恒温振荡培养 至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为葡萄糖0. 8%， (NH4)2S041%, K2HPO4O. 2%, MgSO4O. 05%, NaCl 0. 01%, CaCO3O. 3%，酵母膏 0. 02%，pH 值 7.2-7.5。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，将上述培养好的摇瓶菌种按 10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气 通入量为1 0.8。将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所 用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4. 5吨。投料后的生产罐 1. lkg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状 态备用。接种后的生产罐温度控制在30-35°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为 1 0.8-1.0，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵结束后 菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭 吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
权利要求
一种农药残留降解菌，其特征在于，该微生物是革兰氏染色阴性的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)的菌株MBLHY 1，于2010年5月18日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.3853，主要生物学特性为G ，杆状，无芽孢，极生鞭毛，大小0.8～1.3×0.5～0.6μm；接触酶阳性；氧化酶阴性；不能水解淀粉，不能液化明胶，伏 普反应阳性，甲基红反应阴性，不产生吲哚，水解吐温 80。
2.一种用权利要求1所述的农药残留降解菌生产的农药残留降解菌剂，是通过以下方 法生产而成1)试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长 期，种子罐所用的培养基配方质量体积比为葡萄糖0.8%，(MM)2SO4I %，K2HPO4O. 2%, MgSO4O. 05%, NaCl 0. 01%, CaCO3O. 3%，酵母膏 0. 02%，ρΗ 值 7. 2-7. 5 ；3)种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 0.6-1.2，搅拌速度为 180-240转/分，培养温度为30-35°C，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量 达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型 或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
全文摘要
本发明提供一种消除乙羧氟草醚残留的降解菌剂，属于生物高技术领域。所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌MBLHY-1，经鉴定为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)。主要生物学特性为G-，杆状，无芽孢，极生鞭毛，大小0.8～1.3×0.5～0.6μm；接触酶阳性；氧化酶阴性；不能水解淀粉，不能液化明胶，伏-普反应阳性，甲基红反应阴性，不产生吲哚，水解吐温-80。降解菌产品直接施用可使土壤中农药残留量降低90％上，解决了农业生产中农药残留超标问题，可生产出无毒无公害的绿色农产品。
文档编号C12N1/20GK101928687SQ20101019925
公开日2010年12月29日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者蔡天明, 钱丽花, 陈立伟, 顾海莎 申请人:南京农业大学