一种利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂及其制备工艺的制作方法

本发明涉及一种利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂及其的制备工艺，属于抗菌剂技术领域。

背景技术：

人们使用银类杀菌剂进行杀菌消毒有着悠久的历史，银元素或银离子能够结合在微生物细胞膜的表面，改变其通透性，进而与菌体内的蛋白和核酸结合，影响细菌分裂增殖，最终导致其死亡。近年来, 随着纳米技术的迅猛发展, 纳米材料因其独特的量子效应、小尺寸效应以及大的比表面积而显现异于常规材料的优异特性，引起人们广泛的研究兴趣。纳米银 (Silver nanoparticles, AgNPs) 是采用纳米技术制备的纳米状态下的单质银，其杀菌作用比普通无机银杀菌剂进一步提升，其抗菌谱广、抗菌活性强，并且不易产生耐药性，为新一代抗菌剂的研发开辟了新的方向，具有广阔的开发前景。

传统制备纳米银主要通过物理、化学等方法，但物理方法对设备要求高，而化学方法采用的化学试剂又对环境和人体健康造成危害。另外，上述方法制备的银纳米粒子极易氧化、团聚，限制其在实际应用中的推广。近年来，人们开始尝试利用植物、微生物等生物体内蕴含的活性物质作为还原剂和稳定剂制备纳米银，与传统的纳米银制备方法相比，纳米银生物合成法不需添加任何还原剂、价格低廉，反应条件温和、绿色环保，合成效率高、利于工业化放大。另外，生物提取物中富含蛋白质、脂类、多糖等生物大分子，能够与纳米材料结合而赋予其独特的理化性状和生物学特性，使产物更加稳定、抑菌效果更显著。因此，纳米生物合成法成为纳米合成领域的新热点，具有广阔的研究和发展前景。

蓝莓 (Vaccinium Spp.), 为多年生小浆果灌木，属杜鹃花科，越橘属。起源于北美，现已在世界范围内广泛种植，目前有450多个品种。蓝莓的果实中含有丰富的营养成分，主要有花青素、儿茶酸、黄酮醇、黄烷醇、绿原酸、丹宁酸、超氧化物歧化酶、抗坏血酸、氨基酸以及微量元素等成分。蓝莓具有抗氧化、防止脑神经老化、保护视力、预防心血管疾病、抗衰老、增强机体免疫力、抗癌等功效。因此，蓝莓被联合国粮农组织列为人类五大健康食品之一。蓝莓叶是蓝莓种植的副产品，在果实采摘后被大量遗弃在枝头上。然而，近年来不少研究表明蓝莓叶中的绿原酸、多酚类物质等抗氧化成分与果实中的含量持平、甚至更高。因此，蓝莓叶可以作为蓝莓果实中成分的替代品加以利用。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决上述现有技术存在的不足之处，提供一种采用蓝莓采摘废弃物为原料，利用蓝莓叶中的丰富抗氧化物质为还原剂，生产成本低廉，反应温和环保，能够避免传统化学合成法危害环境的弊端，而且合成时间短，生产效率的利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂及其制备工艺。

本发明的一种利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂的制备工艺，其特殊之处在于包括以下步骤：

1、备料

采集蓝莓叶片，洗净后烘干至恒重，得到干燥的蓝莓叶片；

所述蓝莓叶片先用水冲洗干净，再用双蒸水洗涤2-5次；

所述蓝莓叶片置于烘箱中烘干，烘箱内的温度控制在50-70℃；

2、制备蓝莓提取物

将干燥的蓝莓叶片剪碎，连同提取剂一起置于回流装置内进行加热回流，干燥的蓝莓叶片与提取剂按照质量比1:（2-100）的比例混合，将加热回流后的产物自然冷却、过滤， 然后进行离心处理，取上清液即得到蓝莓叶片提取液，保存备用；

所述提取剂为双蒸水、乙醇、乙醚中的任意一种；

所述加热回流的温度控制在40-100℃，加热回流0.5-12小时；

所述离心处理在离心机内进行，离心机的转速控制在 5000-10000转/分，离心10-15分钟；

所述保存备用是在0-10℃的环境下进行避光保存；

3、以蓝莓叶片提取物为还原剂一步法生物合成纳米银

将AgNO₃溶液与双蒸水按照体积比为1﹕（1-1000）的比例混合制得混合液，再加入蓝莓叶片提取液搅拌均匀后进行加热回流处理，其中，蓝莓叶片提取液与混合液的体积比为1﹕（1-100），待溶液变为金黄色后停止加热回流，即得到生物合成的纳米银抑菌剂，避光保存；

所述AgNO₃溶液的浓度为0.01-1mol/L；

所述加热回流的温度控制在40-100℃，加热回流0.5-12小时；

所述避光保存的温度控制在0-10℃。

本发明利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂，采用的原料蓝莓叶为蓝莓果实采摘后废弃物，通过本发明可以将其充分利用，本发明涉及的合成方法生产成本低廉，反应温和环保，能够避免传统化学合成法危害环境的弊端，合成时间短，生产效率高，抑菌实验表明，蓝莓叶生物合成纳米银抑菌剂对鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、点状气单胞等4种水产病原菌的抑菌圈大小分别为12.7、14.4、13.9和11.9mm，其中以20 μg/mL的本品处理鳗弧菌4 小时后抑菌率可达99.2 %。说明该抑菌剂对水产病原菌抑菌谱广，抑菌效果显著，在水产养殖领域中有着广阔的应用前景。

图1：利用蓝莓叶片提取液生物合成的纳米银抑菌剂的紫外可见吸收图谱；

图2：利用蓝莓叶片提取液生物合成的纳米银抑菌剂的透射电镜照片；

图3：利用蓝莓叶片提取液生物合成的纳米银抑菌剂对鳗弧菌的抑菌圈实验；

图4：利用蓝莓叶片提取液生物合成的纳米银抑菌剂对溶藻弧菌的抑菌圈实验；

图5：利用蓝莓叶片提取液生物合成的纳米银抑菌剂对副溶血性弧菌的抑菌圈实验；

图6：利用蓝莓叶片提取液生物合成的纳米银抑菌剂对点状气单胞菌的抑菌圈实验；

图7：不同浓度的蓝莓叶片提取液生物合成的纳米银抑菌剂对鳗弧菌的抑菌动力学曲线。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的一种利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂的制备工艺，包括以下制备工艺：

（1）材料准备：

采集北高丛蓝莓 (Vaccinium corymbosum L.) 叶片，先用自来水冲洗干净，再用双蒸水洗涤3次，置于烘箱中， 60℃烘干，得到干燥的蓝莓叶片。

（2）蓝莓提取物的制备：

用分析天平称取5.0g蓝莓叶片，将叶片剪碎，加入10 mL提取剂，在40℃下在索氏提取器中加热回流12小时，将制得的溶液自然冷却，用滤纸过滤， 然后 5000 rpm 离心15分钟，取上清即得到蓝莓叶片提取液，4℃保存备用。

（3）以蓝莓叶片提取物为还原剂一步法生物合成纳米银：

取10 mL双蒸水于100 mL圆底烧瓶中，加入10 mL 0.01 mol/L的AgNO₃溶液，再加入20 mL上述蓝莓叶片提取液，搅拌均匀，20℃加热回流约12小时，待溶液逐渐变为金黄色时停止加热，即得到生物合成的纳米银抑菌剂，4℃避光保存。

实施例2

本实施例的一种利用蓝莓叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂的制备工艺，包括以下制备工艺：

（1）材料准备：

采集矮丛蓝莓 (Vaccinium angustifolium L.) 叶片，先用自来水冲洗干净，再用双蒸水洗涤5次，置于烘箱中，70℃烘干，得到干燥的蓝莓叶片；

（2）蓝莓提取物的制备：

用分析天平称取5.0g蓝莓叶片，将叶片剪碎，加入500 mL提取剂，在100℃下在索氏提取器中加热回流0.5小时，将制得的溶液自然冷却， 10000 rpm 离心10分钟，取上清即得到蓝莓叶片提取液，10℃保存备用；

（3）以蓝莓叶片提取物为还原剂一步法生物合成纳米银：

取60 mL双蒸水于100 mL圆底烧瓶中，加入60μL 1 mol/L的AgNO₃溶液，再加入0.5 mL上述蓝莓叶片提取液，搅拌均匀，80℃加热回流约10小时，待溶液逐渐变为金黄色时停止加热，即得到生物合成的纳米银材料，4℃避光保存。

实施例3

（1）材料准备：

采集北高丛蓝莓 (Vaccinium corymbosum L.) 叶片，先用自来水冲洗干净，再用双蒸水洗涤3次，置于烘箱中，60℃烘干，得到干燥的蓝莓叶片。

（2）蓝莓提取物的制备：

用分析天平称取5.0g蓝莓叶片，将叶片剪碎，加入100 mL提取剂，在90℃下在索氏提取器中加热回流1小时，将制得的溶液自然冷却，用Whatman No.1定性滤纸过滤， 然后 5000 rpm 离心10分钟，取上清即得到蓝莓叶片提取液，4℃保存备用。

（3）以蓝莓叶片提取物为还原剂一步法生物合成纳米银：

取20 mL双蒸水于100 mL圆底烧瓶中，加入200μL 0.1 mol/L的AgNO₃溶液，再加入2 mL上述蓝莓叶片提取液，搅拌均匀，90℃加热回流约1小时，待溶液逐渐变为金黄色时停止加热，即得到生物合成的纳米银抑菌剂，4℃避光保存。

实施例4

在实施例的步骤（3）之后再进行下述步骤

（4）紫外-可见分光光度计检测：

采用紫外-可见分光光度计检测步骤3得到的生物合成的纳米银溶液的最大吸收波长，扫描波长范围为200-800 nm。从附图1可以看出纳米银溶液在425 nm 附近出现了一个明显的吸收峰，而典型的银纳米粒子在400-500 nm范围内由于特征性的表面等离子体共振而产生特征吸收峰，由此可以说明蓝莓叶片提取物成功将AgNO₃还原成纳米银颗粒。

（5）透射电镜检测：

取5-10 μL步骤3得到的生物合成的纳米银滴加在铜网上，室温干燥，用透射电子显微镜在80-300 kV电压下观察纳米银颗粒的形态及粒径，从附图2可以看出生物合成的纳米银颗粒为球形，纳米颗粒粒径大小为 10-30 nm，粒径相对均匀。

将制备的纳米银抑菌剂用如下两种抑菌实验检测其抑菌活性：

（6）抑菌圈实验：

分别选用4种水产病原菌（鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、点状气单胞）作为指示菌，采用常规杯碟法检测生物合成纳米银抑菌剂的抑菌活性。

供试海洋水产病原菌采用2216E培养基 (蛋白胨5g，酵母膏1 g，磷酸高铁0.01g，陈海水定容至1000 mL)，28℃培养。取供试菌50 μL加到5 mL液体培养基中，150 rpm震荡8-10 h，至对数增长期，细菌培养液用生理盐水稀释菌液浓度至10⁶ CFU/mL，取100μL均匀涂布于2216E固体培养基上，然后在培养基上放置牛津杯（杯外径8mm），加入生物合成纳米银抑菌剂20 μL，另以生理盐水和蓝莓叶片提取液各20 μL做为对照，将培养平皿置于28℃恒温培养箱中培养过夜，观察牛津杯周围抑菌圈的产生。实验结果表明蓝莓叶片提取液本身具有一定的抑菌活性，仅对牛津杯内的水产病原菌有部分的抑菌效果（附图3-6中的c）；以蓝莓叶片提取液合成的纳米银则对所有供试水产病原菌均产生显著的抑菌圈，对鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌和点状气单胞等4种水产病原菌的抑菌圈大小分别为12.7、14.4、13.9和11.9 mm（附图3-6中的a）；而生理盐水则对供试水产病原菌完全没有抑制作用（附图3-6中的b）。上述结果表明蓝莓叶片中的活性物质能有效合成的纳米银，并对生成的纳米银具有协同抑菌效应，赋予其较高的抑菌活性。

（7）抑菌动力学实验：

以鳗弧菌为指示菌，将鳗弧菌在2216E液体培养基中28℃，150 r/min培养至对数增长期，将培养好的菌液稀释到1×10⁶ CFU/mL。将稀释菌液分装到三支试管中，其中两支试管分别加入不同量的生物合成纳米银抑菌剂（终浓度分别为10、20 μg/mL），另一支试管加入生理盐水做为对照，置于28℃恒温摇床中150 r/min培养，每隔0、10、30、60、120、180、240 min取样，用分光光度计测细菌培养液在600 nm下的吸光度值（OD₆₀₀），绘制细菌生长动力学曲线，检测我们的产品对鳗弧菌生长的影响。由附图7可以看出10 μg/mL的纳米银处理组能够延迟鳗弧菌到达对数增长期的时间；20 μg/mL的纳米银对鳗弧菌都能产生强烈的抑制作用，随着培养时间的延长，该组菌液的OD值几乎没有发生变化，说明其中的细菌几乎没有任何增殖现象；而生理盐水对照组中的细菌能够迅速到达对数增长期，菌体数目得到快速增长。经计算可知10 μg/mL和20 μg/mL的本产品4 小时后对鳗弧菌的抑菌率分别为55.6%和99.2%。上述实验表明蓝莓叶提取物生物合成的纳米银在水环境中能够显著抑制水产病原菌的生长，对新型纳米银抑菌材料在水产养殖中的应用奠定了基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。