养，将培养物置于30°C烘箱内烘干后即得黑曲霉菌粉； (3)接种微生物发酵:按每平方米混合肥料中接入10kg的比例向混合肥料中加入黑曲 霉菌粉，拌匀后堆置发酵，当温度低于50°C时翻堆后继续发酵，发酵时间为45天;发酵完成 后，按每平方混合肥料中接入10L的比例分别加入解淀粉芽孢杆菌菌液和沼泽红假单胞菌 菌液，调整pH值为7，水分含量为65%，搅拌均匀后，摊成25cm的薄层进行第二次发酵，控制温 度为30°C，发酵10天后，将其搅拌均匀风干至含水率<15%，即得到草莓专用抗重茬生物有 机肥。
[0021 ]其他方法同实施例1所述方法。
[0022] 实验例1:解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN2的分离鉴定： 1.JN2的初筛:采集已经腐熟的牛粪样品10g，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，震荡lOmin，充分混匀，即为10-1稀释液;取10-1稀释液lml放入装有9ml无菌水的灭菌试管中，震 荡，充分混匀，即为10-2稀释液;如此重复，将土壤稀释到10- 8浓度。取10-6、10-7、10-8浓度的 稀释液0.2ml涂布在羧甲基纤维素钠固体平板上，37°C，黑暗条件倒置培养。羧甲基纤维素 钠培养基配方为:羧甲基纤维素钠15g/L，酵母粉lg/L，磷酸二氢钾lg/L，硝酸铵lg/L， 硫酸镁〇.5g/L。
[0023]2.复筛：待单菌落长出后，挑取单菌落接种于新的羧甲基纤维素钠固体平板，37 °C，恒温培养72h，刚果红染色复筛，筛选出透明圈较大的菌落，编号，转移到新的平板上，多 次划线培养纯化后接于羧甲基纤维素钠固体斜面上，4°C保存用于后续实验。
[0024]复筛获得多株透明圈较大的菌株，挑选其中一株培养2天，如图1所示，菌落直径 (d)为2mm，水解圈直径(D)为14mm，D/d值达7，编号为JN2。经人工富集培养，分离纯化得到的 JN2在羧甲基纤维素钠固体平板上的培养特征如图2所示，为:菌落边缘不整齐，呈放射状， 直径2~3cm，浅黄色，不透明，表面湿润。采用简单染色和革兰氏染色观察JN2细胞形态，见图 3,发现该菌呈杆状。
[0025]其形态学特征为:在羧甲基纤维素钠固体平板上菌落边缘不整齐，呈放射状，直径 2~3cm，浅黄色，不透明，表面湿润。革兰氏染色呈阳性，杆状，单个、成对或成串出现，有芽 孢，芽孢囊不膨大，芽孢椭圆形，中生。生理生化结果见表1。
[0026] 表1菌株JN2的生理生化指标
3.JN2菌株的分子鉴定:对筛选得到的JN2按如下步骤进行分子鉴定:挑取JN2单菌落接 于LB液体培养基中，37°C摇床培养过夜。取200μ1菌液，12000rpm离心5min，弃上清，于沉淀 中加入40μ1灭菌超纯水，充分混匀后，置于100°C水浴5min裂解，裂解液作为模板进行PCR反 应。PCR引物为通用引物27F和1492R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列 为：27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和 1492R:TACGGCTACCTTGTTACGACTTJCR体 系为：10XPCRBuffer5yL，dNTPs1.5yL，上下游引物各0.5yL，模板2yL，rTaq酶lyL，加 水补齐至SOyUPCR程序为94°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30个循环；72°C SmiruPCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送往北京华大生物工程技术有限公司测序。序 列经blast比对。经测序鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。16SrDNA 如SEQIDNo.l所示。
[0027] 根据对菌株的形态学、培养特征、生理生化和分子鉴定的研究结果，菌株JN2鉴定 为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽孢杆菌JN2在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生 物研究所)保藏登记号为CGMCCNo:10677。
[0028] 实验例2:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus&11171〇1丨9116€3(^6118)见2对草莓主要土传病 害的防治作用测定： 1. 解淀粉芽孢杆菌JN2对草莓灰霉病的防治:灰霉病在草莓生长期、花期、果期均有可 能发生，病原菌为灰葡萄孢霉(BotrytiscinereaPers.)，其菌丝、菌核及分生孢子可以在 土壤或病残体上越冬或越夏，是草莓最严重的土传病害之一。采用叶片法测定JN2发酵原液 对草莓灰霉病的防效。将生长健康、大小一致的草莓叶片从叶柄处剪断，用自来水将叶片表 面冲洗干净，再用70%乙醇进行表面消毒，用灭菌水冲洗干净后，在JN2发酵液中浸渍3min， 晾干，叶面朝上放置于铺有无菌滤纸保湿的培养皿内，叶柄用浸湿的灭菌棉球包裹。灰霉菌 菌丝采取牙签划伤接种方式接种到叶片上。以无菌水代替发酵液作为对照。每组各30片叶 片。实验15天以后进行病害调查。根据每片叶子的变褐情况以目测法对病情进行记载。
[0029]草莓叶部病害按5级划分:0级:无病；1级:发病面积占叶表面积1/4以下;2级:发病 面积占叶表面积1/4-1/2; 3级:发病面积占叶表面积1/2-1/3; 4级:发病面积占叶表面积3/4 以上。
[0030]
[0031]实验结果见表2、图4,结果显示:对照组只接种灰霉菌，几乎全部染病，叶片出现茶 褐色病斑，病斑逐渐扩大，15天后，有的整片叶子均变为茶褐色，且表面覆盖一层灰褐色菌 丝，病情指数达87.5%。实验组叶片先经JN2处理后再接种HM，15天后，仅有少量叶片出现茶 褐色病斑，病情指数仅为2.5%。说明JN2对草莓灰霉病具有较高的防效。
[0032] 表2JN2处理对灰霉病的防效
2. 解淀粉芽孢杆菌JN2对镰刀菌属和拟盘多毛孢属病原菌的拮抗作用： 镰刀菌属真菌(Fusariumspp.)在世界范围内分布广泛，它可危害多种植物，破坏植物 的维管束系统，引起植物萎蔫死亡和器官腐烂，是生产上防治最艰难的土传病害之一。在草 莓上可引起枯萎病，使草莓根部维管束变褐，叶片卷缩、萎蔫直至全株死亡。拟盘多毛孢属 (Pestalotiopsis)是著名的植物病原体品种，在草莓上能引起叶斑病，主要危害叶片，起初 产生红褐色病斑，后中央变为浅褐色，产生轮纹，边缘出现明显的暗褐色坏死带，严重时叶 片枯死。
[0033]采用对峙培养验证解淀粉芽孢杆菌JN2对镰刀菌和拟盘多毛孢菌的拮抗作用。镰 刀菌和拟盘多毛孢菌为本实验室保存病害菌种，将病害菌种的新鲜菌丝接种于马铃薯葡萄 糖固体培养基平板中央，按等边三角形三个顶点的方向将JN2接种于病害菌周围，于28°C条 件下黑暗倒置培养。以只接种病害菌，不接种JN2的平板作为对照。7天以后观察病害菌生长 状况。从图5中可以明显看出，与对照相比，接种JN2菌株的镰刀菌和拟盘多毛孢菌生长明显 受到抑制，说明JN2对镰刀菌和拟盘多毛孢菌有强烈的拮抗作用。
[0034]实验例3:解淀粉芽孢杆菌(Bacillus&11171〇1丨9116€3(^6118)见2对纤维素的降解作 用的检测： 以羧甲基纤维素酶(CMCase)和滤纸酶活(FPase)为指标优化JN2菌株的发酵条件。采用 国标20287-2006《农用微生物菌剂》中的还原糖法测定滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力。 以lmL酶液，lmin产生Uig葡萄糖定义为1个酶活力单位(U)。标准曲线见图6,其回归方程为y =0.0002x-0.0223，R2 值为0.9904，线性关系良好。
[0035] 1.JN2菌株在不同纤维类底物诱导下纤维素酶活力的变化：以羧甲基纤维素钠、滤 纸条、玉米秸杆粉、稻草粉、锯末为诱导底物，分别配制不同的发酵培养基。具体的基础培养 基配方为:底物15g/L，酵母粉lg/L，磷酸二氢钾lg/L，硝酸铵lg/L，硫酸镁0.5g/L，取培养了 24h的JN2种子发酵液接种于不同的发酵培养基中，37°C，160r/min摇床培养，5天后离心， 取上清液作为粗酶液，测定酶活。
[0036]不同底物的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活值见图7,可见在羧甲基纤维素钠、滤纸 条、玉米秸杆粉、稻草粉、锯末5种诱导底物条件下，所产生的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活 均有差异，其中，玉米秸杆的诱导能力最大，CMC酶活能达到1344U，滤纸酶活能达到835U。故 选择玉米秸杆为最佳诱导底物。
[0037] 2.JN2菌株在不同pH条件下纤维素酶活力的变化:根据在不同纤维类底物诱导下 纤维素酶活力的检测的结果，以玉米秸杆作为诱导底物，按pH值为3、4、5、6、7、9分别配制不 同的发酵培养基。具体的培养基配方、培养条件同不同纤维类底物诱导下纤维素酶活力检 测的培养基和培养条件。培养5天后测定滤纸酶活力。结果见表3。可见，pH值为7时，JN2产生 滤纸酶活最高，7为最适培养pH条件。
[0038]表3不同dH条件下滤纸酶活
3.JN2菌株