专利名称：双(5－甲酰基糠基)醚衍生物、制备方法及药学的应用的制作方法
技术领域：
本发明属药物合成领域，具体涉及一类新型天然双(5-甲酰基糠基)醚衍生物，制备方法和在药学上的应用。
自1963年Blumberg等人在人血清中发现乙型肝炎病毒(HepatitisB virus，HBV)以来，HBV在全世界范围内广泛传播。目前有20亿人感染过HBV，我国的感染率高达50～70％，有1亿多人是乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)的携带者。HBV持续感染会导致肝硬化和原发性肝细胞癌等肝脏疾病，病死率高。尽管乙肝疫苗已经广泛使用，在一定范围内对乙型肝炎起到有效的预防，但存在有无应答和不良反应等问题，目前用于临床的抗HBV药物，有以核苷类似物为代表的化学药物、以干扰素为代表的生物类药物和中草药及其有效成分。然而核苷类似物药物虽然是有效的HBV病毒DNA的逆转录酶抑制剂，却存在停药后复发率高、对HBsAg作用不明显、以及有较大不良反应等问题；干扰素生物类药物治疗乙型肝炎的复发率较高，且不良反应大，临床难以广泛使用；中草药有效成分提取纯化难度大，结构复杂因而合成困难。寻找低毒、高效、停药复发率低、结构简单合成容易的抗HBV药物，已成为当今医药学界的一项重要任务。
有研究报道，从植物山里红(Crataegus Pinnatifida Bge.Var.majcrN.E.Br.)的成熟果实山楂、西南忍冬(Lonicera bournei Hemsl)花蕾、薄盖林芝(Ganoderma capense(Lloyd)Teng)深层发酵菌丝体、川芎(Ligusticum chuanxing Hort)的根茎中分离得到化合物双(5-甲酰基糠基)醚(1)和羟甲基呋喃甲醛(2)(Scheme 1)，其中化合物1具有广泛的抗病毒、抗结核杆菌以及抗氧化活性，并经实验证实其能强烈地抑制乙型肝炎病毒(HBV)，达到保护肝细胞的作用。
本发明的另一目的是提供上述双(5-甲酰基糠基)醚衍生物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述新型双(5-甲酰基糠基)醚衍生物在制备治疗病毒性疾病的药物中的应用。
本发明双(5-甲酰基糠基)醚衍生物具有下述式I、II、III、IV、V或VI的结构， 其中R1、R2、R3和R4可以是独立的氢，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，卤素，羧基，羧酸酯，酮基和酰胺基或胺基。R5可以是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基和酰基。X可以是-CH2-、-NH-、-O-。Y可以是-CH-、-N-。 其中R6、R7、R8和R9可以是独立的氢，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，卤素，羟基或胺基。
R10可以是独立的氢，芳基，取代芳基或烷基。
Z可以是-NH-、-O-。
本发明双(5-甲酰基糠基)醚衍生物通过药效学包括体外抑制HepG2 2.2.1.5细胞HBsAg和HBeAg试验研究，显示了很好的抑制HepG2 2.2.1.5细胞HBsAg和HBeAg活性，并且毒副作用小，可研制治疗病毒性疾病尤其是病毒性乙型肝炎病毒的新药。
本发明的优选化合物是具有下述3、4、5结构的化合物 本发明双(5-甲酰基糠基)醚由下式反应获得 本发明实施例1，详细描述了化合物1的新的制备方法，制备过程如下式 本发明公开的上述式II和式IV的双(5-甲酰基糠基)醚衍生物由下式反应获得 其中，X＝-NH-，R1、R2、R3、R4的定义如上所述。本发明实施例2，描述了化合物5的制备方法，制备过程如下式 化合物5的制备工艺包括将吡啶与30％的双氧水在冰醋酸条件下维持80～85℃ 11.5小时，蒸干溶剂并经油泵减压蒸馏后得化合物6纯品。化合物6溶于浓硫酸后加入浓硫酸-发烟硝酸硝化，维持95～100℃ 12小时，然后加入冰水中稀释并经氢氧化钠中和后，用氯仿提取、洗涤、干燥、蒸去氯仿后得化合物7。将7溶于甲醇，加入钯炭、甲酸铵回流15分钟，过滤除滤渣，甲醇洗涤滤渣后与滤液合并、浓缩，用2 N氢氧化钠溶液溶解，乙酸乙酯提取，干燥、浓缩后得化合物8的纯品。将化合物8和化合物2溶解于甲苯中，对甲苯磺酸催化下带水回流110小时，冷至室温后加入甲醇和硼氢化钾、维持35℃搅拌3小时至完全，浓缩后加入少量蒸馏水溶解、氯仿提取、洗涤、干燥、浓缩，经硅胶柱层析分离得到化合物5纯品。
本发明实施例3，描述了化合物3、4的制备方法，制备过程如下式， 化合物3或4的制备工艺包括将化合物8和化合物9溶解于苯中，对甲苯磺酸催化下带水回流84小时，冷至室温后加入甲醇和硼氢化钾、室温搅拌5小时至完全，浓缩后加入蒸馏水溶解、氯仿提取、洗涤、干燥、浓缩，经硅胶柱层析分离得化合物3纯品。将化合物3和DCC溶解于丙酮和三乙胺的混合溶液中，加入呋喃甲酸室温搅拌18小时后，浓缩、乙酸乙酯溶解、蒸馏水洗涤、干燥，浓缩后经硅胶柱层析得到化合物4纯品。
本发明双(5-甲酰基糠基)醚衍生物经乙型肝炎病毒体外药效试验(体外抑制HepG2 2.2.1.5细胞HBsAg和HBeAg试验)结果显示对HbsAg的抑制作用明显超过对照品拉米呋啶(3TC)。细胞毒性试验显示此类双(5-甲酰基糠基)醚衍生物毒性较小(100μg/ml的细胞存活率高于75％)。此类双(5-甲酰基糠基)醚衍生物显示很好的抑制HepG2 2.2.1.5细胞HBsAg活性和较小的细胞毒性作用，可研制治疗病毒性感染疾病尤其是病毒性乙型肝炎的新药。
5-氯甲基呋喃甲醛36.6g(0.253mol)滴加至100mL煮沸的蒸馏水中，回流。薄层色谱跟踪显示反应完全，冷却至室温，用乙酸乙酯提取，无水硫酸镁干燥，蒸尽溶剂，得红棕色液体羟甲基呋喃甲醛35.8g，收率约100％，薄层板经羟甲基呋喃甲醛对照品比较，结果一致，本品直接用于下步反应。
羟甲基呋喃甲醛1.26g(10mmoL)、氯甲基呋喃甲醛1.45g(10mmoL)溶解于100mL丙酮，加入1.6g(11mmoL)碳酸钾和1.9g(11mmoL)碘化钾，氮气下回流12小时。冷却至室温，蒸去丙酮，加入50mL氯仿和30mL蒸馏水，搅拌20分钟。分离出水相和氯仿相，水相用氯仿提取四次(50mL×4)。合并氯仿相，饱和氯化钠溶液洗涤二次(50mL、30mL)至中性，无水硫酸镁干燥过夜。蒸去氯仿，得粗品3.2g，硅胶柱层析分离，得纯品双(5-甲酰基糠基)醚1.01g，收率42.7％，mp112～114℃。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ4.6(4H，s，-CH2-O-)，6.6(2H，dd，ArH)，7.2(2H，dd，ArH)，9.6(2H，s，-CHO)。MS(％)m/z234(1.68)，206(17.59)，123(7.76)，109(100.00)，95(16.36)，81(80.08)，69(10.70)，53(61.22)。
实施例2合成化合物5双[5-(4-吡啶基)氨甲基糠基]醚160mL30％双氧水溶于300mL乙酸，加热至70℃以上，滴加123mL吡啶，控制反应温度80℃以下，维持80～85℃2.5小时，补加160mL双氧水，继续维持80～85℃ 9小时。冷却至室温，减压除去水和过量的乙酸后，油泵减压蒸馏，得产品N-氧化吡啶132.4g，收率91.7％，bp135～138℃/400Pa。
向6g N-氧化吡啶中，搅拌下滴加12mL浓硫酸使之溶解，再滴加含15mL发烟硝酸和17mL浓硫酸的混酸，加热至95～100℃，反应12小时。倒入120g的冰水中，搅拌下，用60g氢氧化钠糊调节至中性，析出固体。过滤，氯仿提取滤液三次，滤渣用氯仿洗涤三次，合并氯仿溶液，无水硫酸镁干燥2小时。减压蒸去氯仿，得淡黄色结晶固体4-硝基-N-氧化吡啶7.3g，收率82.6％，mp162～164℃。
将10.5g 4-硝基-N-氧化吡啶、35.5g甲酸胺和0.9g钯炭溶于350mL甲醇中，加热至60℃，维持15分钟，冷却至室温，过滤，除去钯炭，甲醇洗涤(20mL×4)，合并甲醇溶液。减压蒸去甲醇，析出固体。向固体中加入2N氢氧化钠溶液后，用乙酸乙酯提取八次(60mL×8)，合并乙酸乙酯溶液，无水硫酸镁干燥过夜。减压蒸去乙酸乙酯，得淡黄色固体4-氨基吡啶5.7g，收率81％，mp162～165℃。
300mg 4-氨基吡啶、384mg双(5-甲酰基糠基)醚及催化量的对甲苯磺酸溶解于40mL甲苯，分水器带水回流110小时。冷却至室温，加入920mg钾硼氢和40mL甲醇，油浴35℃加热3小时。停止加热，减压蒸去溶剂，加入50mL氯仿和20mL蒸馏水溶解，分离出水相和氯仿相，水相用氯仿提取三次(50mL×3)。合并氯仿相，饱和氯化钠溶液洗涤二次(50mL、30mL)至中性，无水硫酸镁干燥过夜。次日，蒸去氯仿，得到粗品(15)，硅胶层析柱分离，得纯品双[5-(4-吡啶基)氨甲基糠基]醚140mg，收率21.3％。1H-NMR(300MHz，DMSO)δ4.2(4H，d，-CH2-N-)，4.3(4H，s，-CH2-O-)，5.6(2H，br，NH)，6.1(2H，d，ArH)，6.2(2H，d，ArH)，6.5(4H，d，ArH)，8.1(4H，d，ArH)。MS(％)m/z390(100.00)，203(59.48)，187(88.25)，173(26.66)，102(23.50)，95(64.32)，81(21.15)，51(11.51)。实施例3合成化合物[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇300mg 4-氨基吡啶、384mg5-乙酰氧甲基呋喃-2-甲醛及催化量的对甲苯磺酸溶解于20mL甲苯，分水器带水回流84小时。停止加热，冷却至室温，加入680mg钾硼氢和20mL甲醇，室温搅拌5小时。减压蒸去溶剂，加入50mL氯仿和20mL蒸馏水溶解，分离出水相和氯仿相，水相用氯仿提取三次(50mL×3)。合并氯仿相，饱和氯化钠溶液洗涤二次(50mL、30mL)至中性，无水硫酸镁干燥过夜。次日，蒸去氯仿，得到粗品500mg，硅胶层析柱分离，得纯品[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇240mg，收率52％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ4.3(2H，d，-CH2-N-)，4.6(2H，s，-CH2-O-)，5.0(H，br，NH)，6.2(2H，dd，ArH)，6.5(2H，dd，ArH)，8.1(2H，dd，ArH)。MS(％)m/z204(35.80)，173(10.52)，111(100.00)，94(18.15)，83(35.67)，55(26.21)，51(19.33)，43(13.04)。
实施例4 合成化合物[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇糠酸酯201mg[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇和206mgDCC溶解于35ml丙酮和吡啶(6∶1)的混合溶液，冰浴下滴加含112mg糠酸的35ml丙酮和吡啶(6∶1)的溶液，室温搅拌18小时。停止反应，减压蒸去溶剂，加入100ml乙酸乙酯溶解，蒸馏水洗涤5次(30ml×5)，无水硫酸镁干燥过夜。过滤，蒸净乙酸乙酯苯带吡啶二次，硅胶层析柱分离，得纯品[5-(4-吡啶基)氨甲基]糠醇糠酸酯180mg，收率94.9％。1H-NMR(300MHz，)δ3.6(H，br，NH)，4.3(2H，d，-CH2-N-)，5.2(2H，s，-CH2-O-)，6.3(H，d，ArH)，6.5(2H，d，ArH)，6.7(2H，d，ArH)，7.3(H，t，ArH)，7.9(H，d，ArH)，8.1(2H，d，ArH)。MS(％)m/z298(22.83)，205(41.96)，203(14.98)，187(10.34)，186(18.50)，95(100.00)，78(12.65)，51(15.71)。实施例5化合物的细胞毒性实验测定化合物的细胞毒性之实验方法采用MTT法，即四氮唑盐还原法，简述如下HepG2 2.2.1.5细胞(由教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室提供)在96孔细胞培养板中培养3天后，加入不同浓度的药物，继续培养9天(每3天换液一次)，用MTT法检测样品对HepG2 2.2.1.5细胞的毒性。
本测定以细胞存活率作为判断细胞毒性的指标，细胞存活率＞或＝75％认为无明显的细胞毒性，细胞存活率＜75％认为有细胞毒性。
试验结果表明，化合物毒性较小。100μg/ml浓度下，HepG22.2.1.5细胞存活率均＞或＝75％；200μg/ml浓度下，大部分化合物作用下的HepG2 2.2.1.5细胞存活率＞或＝75％。表1是HepG2 2.2.1.5细胞的存活率。
表1样品HepG2 2.2.1.5细胞存活率(％)200μg/ml100μg/ml50μg/ml1 51.4 77.480.93 75.2 77.285.14 ＜50 66.177.45 76.3 89.195.4
测定化合物的对HepG2 2.2.1.5细胞HBsAg、HBeAg的抑制活性之实验方法采用ELISA法，HBsAg、HBeAg诊断试剂盒购自上海实业科华科技生物技术公司，以拉米呋啶作为阳性对照。
HepG2 2.2.1.5细胞在24孔细胞培养板中培养3天后，加入不同浓度的样品液，继续培养9天，每3天换液一次，用ELISA法检测样品对HepG2 2.2.1.5细胞HBsAg、HBeAg的抑制活性。
实验结果表明化合物对HepG2 2.2.1.5细胞HBsAg具有明显的抑制作用，而且显著高于阳性对照品拉米呋啶；对HepG2 2.2.1.5细胞HBeAg有一定的抑制作用。表2是化合物对HBsAg和HBeAg的抑制活性。
表2样品 对HBsAg的抑制率(％)对HBeAg的抑制率(％)200 100 50 200 100 50μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml1 /46.737.9/ 22.76.33 60.1 42.823.720.810.05.64 // 53.9// 46.85 89.2 67.747.545.2 27.5 22.63TC 29.6 35.权利要求
1.双(5-甲酰基糠基)醚衍生物，其特征是具有式I、II、III、IV、V或VI的结构， 其中R1、R2、R3和R4可以是独立的氢，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，卤素，羧基，羧酸酯，酮基，，酰胺基或胺基等。R5可以是氢，烷基，环烷基，芳基或取代芳基，酰基等。X可以是-CH2-、-NH-、-O-等。Y可以是-CH-、-N-等。 其中R6、R7、R8和R9可以是独立的氢，芳基，取代芳基，烷基，烷氧基，卤素，羟基或胺基。R10可以是独立的氢，芳基，取代芳基或烷基。Z可以是-NH-、-O-。
2.根据权利要求1所述双(5-甲酰基糠基)醚衍生物，其特征是所述衍生物是具有下列结构式的化合物，
3.权利要求1的双(5-甲酰基糠基)醚的制备方法，其特征是由下式反应获得
4.权利要求1的双(5-甲酰基糠基)醚衍生物在制备治疗病毒性疾病药物中的用途。
5.权利要求1的双(5-甲酰基糠基)醚衍生物在制备治疗病毒性病毒性肝炎药物中的用途。
6.权利要求1的双(5-甲酰基糠基)醚衍生物在制备治疗病毒性乙型肝炎药物中的用途。
全文摘要
本发明属药物合成领域，具体涉及一类新型天然双(5－甲酰基糠基)醚衍生物，制备方法和在药学上的应用。本发明双(5－甲酰基糠基)醚由上式反应获得。本发明天然双(5－甲酰基糠基)醚衍生物通过体外抗乙型肝炎病毒药效学研究，结果表明抑制HepG2 2.2.1.5细胞HBsAg的活性明显超过阳性对照品拉米呋啶，体外细胞毒性试验表明毒副作用小，本发明化合物可制备治疗病毒性疾病尤其是病毒性乙型肝炎的新药。
文档编号C07D307/46GK1456556SQ03129068
公开日2003年11月19日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者闻韧, 余凡, 董肖椿, 缪宇平, 周佩, 林志刚, 郑剑斌, 王浩, 黄磊, 青岛均 申请人:复旦大学