一种快速大量提纯质粒dna的新方法

专利名称：一种快速大量提纯质粒dna的新方法
专利说明一种快速大量提纯质粒DNA的新方法 本发明涉及分子生物学研究领域，为一种快速大量提纯质粒DNA的新方法。质粒DNA一般是指细胞质中独立于染色体以外的共价闭环的小分子双链DNA，它具有独立的复制能力，并可在细胞分裂中与染色体一道分配到子细胞中。质粒可以在同种、同属的细菌内转移，也可以在不同种细菌间转移。某些质粒还能整合到染色体DNA上，因此质粒的转移同时又是基因的转移。由于质粒分子小，便于分离和提取，经改造后可以成为克隆基因的重要载体，目前，应用于基因工程的主要质粒有pBR322及其衍生质粒、表达型质粒和穿梭型质粒，均为人工改造后的质粒载体(参见孙树汉.基因工程原理与方法.北京人民军医出版社，2001，43-44)应用质粒作为基因克隆的载体，最重要的前提是要获得大量纯化的质粒DNA分子，因而高效快速地从细菌细胞中纯化质粒具有重要意义。
目前已有的常规提取质粒的方法为碱裂解法。但对于质粒的纯化方法却有很多蔗糖或氯化铯-乙啡啶溴化物密度梯度离心是质粒纯化的标准分子生物学方法，但该法不仅耗时难以放大，还使用了毒性和诱变性试剂，因此不适合质粒DNA制备。色谱分离法是利用待分离核酸的分子大小和化学性质、与配体结合的能力和因分子超螺旋结构引起的拓扑限制，通过核酸与固定相的相互作用，有选择地从杂质中分离和纯化DNA分子。目前色谱纯化的主要方式有阴离子交换色谱、体积排阻色谱、疏水色谱、三链DNA-亲和色谱、反向色谱等(参见PrazeresDM等人，Chromatography A，1998(806)31；Horn NA等人，Human gene therapy，1995(6)565；Diogo MM等人，Bioseparation，2002(10)211；Wils P等人，Gene Therapy，1997，4(4)323；Green AP等人，Biopharm，1997，552)。阴离子交换色谱因其很强的特异性，能很好地将质粒DNA捕获。体积排阻色谱可用于缓冲液的交换并可分离出一些小分子的污染物。疏水色谱近年来也被用于大规模制备超螺旋质粒，而反向色谱和亲和色谱虽然也被用于质粒DNA的纯化，但主要只应用于实验室水平。近年来，纳米技术已成为生物物理学和生物化学研究的热点。Schluep等应用三螺旋结构作为中介，从细菌裂解液中纯化质粒DNA。他们将连有链霉亲和素的纳米磁性粒子与合成的连有生物素的寡核苷酸探针反应，再与制备好的细菌裂解液孵育，使质粒DNA与寡核苷酸探针充分形成三螺旋结构，在强磁场作用下进行洗涤，质粒DNA从三螺旋结构上洗脱下来。Levison则用包有超顺磁性成分的琼脂糖微球从细菌裂解液中成功分离出高纯度的质粒DNA(参见孙敏莉.张皓，生物工程学报，2001，17(6)601)雷涵等构建了以Mn-Zn铁磁体为磁核、苯乙烯-丙烯酸共聚物为高分子壳层、表面带羧基的磁性高分子微球，在高浓度的聚乙二醇溶液和一定盐浓度纯在的条件下，DNA能选择性地结合到表面带羧基微球上，经过短时间的反应，这种DNA-磁性微球复合物能被70％冷乙醇彻底清洗，之后用洗脱液将DNA洗脱下来，这样得到高纯度的DNA且超螺旋构象未被破坏(参见雷涵等人，高技术通讯，2002，875)可以说，磁性材料分离质粒DNA具有安全、低耗、快速、高效等特点，但是否能应用于大规模制备，目前尚无相关报道。Lander等对用十六烷基溴化铵(CTAB)选择性沉淀质粒DNA，结构成功地将质粒DNA从其它宿主污染物中分离出来(参见Lander RJ，Biotechnol Bioeng，2002，79(7)，776)CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在此条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和酸性多聚糖以外的多聚形成复合物，但是不能沉淀核酸；另外，CTAB分子中相邻的疏水尾巴的亲和性增强了其有次序地同其它分子分离的作用，因此CYAB可用于从某些革兰氏阴性菌的部分菌株中制备DNA，另一些可替代的方法是用硫酸铵、亚精胺和精胺等通过选择性沉淀来分离质粒DNA分子也获得了成功。另有研究用离子交换与硝酸纤维膜过滤结合，将离子交换洗脱后的液体通过0.4μm硝酸纤维膜。多数的质粒DNA大分子穿过膜并可从滤出液中回收，而变性的染色体DNA被滤膜截留。在1.5mol/L NaCl的作用下，RNA分子也被滤膜截留。利用Southern杂交分析收集的样品，发现RNA污染水平从超过27％降到1％以下(参见Levy MS等人，Biotechnol，2000，76(2-3)197)。Giovannini等则应用高效膜色谱分离超螺旋质粒DNA，结果在同步洗脱或高离子强度其始液的梯度洗脱条件下，线性质粒、开环质粒和超螺旋质粒依次被洗脱下来(参见Giovannini R等人，Anal Chem，1998，70(16)1971)。Poeder等(1998)报道了通过制备级电泳制备超螺旋质粒DNA的方法，先通过碱裂解方法后，将上清液装入一个多室电泳仪中，当电场强度为8cm，细胞浓度为30g时，经过60min的电泳后回收率可达75％±2％。
总之，在传统的方法基础上所做的改良，其获取的质粒DNA得量低，质量不高，且提取过程耗时长，又有酚和氯仿有毒物质，既污染环境，又危害试验操作人员健康，不适宜大规模提纯。近年来发展的新方法虽然克服了传统方法的缺点，大大简化了提纯过程，但其所用材料价格高，操作技术难度大等特点决定了它们不能普遍使用。因此，使用上述方法很难满足临床免疫试验中所需要的大量提纯的高质量质粒DNA，从而需要找出一种能够快速、大量、简易、高效、高质、价廉和无害的质粒DNA的提纯新方法。本发明人已作过广泛的比较研究工作，作为结果发现硅藻土具有本身是一种吸附核酸的良好的吸附剂，但其吸附核酸的长度也有一定的限制，通常在500bp～5kb之间，而一般常用的质粒均在此范围内；细菌的染色体DNA由于一般均大于10kb，因此在吸附时不易被吸附，即使被吸附，在洗涤是也会被洗涤下来的特点。
基于以上特点，本发明找到了经过一定处理后能对质粒DNA有特异吸附功能的硅藻土。利用常规碱裂解法制备的质粒DNA，经过与特殊处理的硅藻土混合，特异的吸附质粒DNA，从而大大减少了细菌染色体和内毒素的污染。通过在提取液R1中加入了RNase，细菌的RNA在提取时大部分即被消化了，其RNA的污染也被降到了较低的水平，这就大大减少了常规方法后续处理所花的时间。因此用硅藻土提纯的质粒电泳可清楚的看到没有细菌染色体和RNA的污染；整个提取过程缩短到一个半小时以内，简化了提取过程，提高了工作效率，降低了实验成本，并且提取得到的质粒可直接用于包括酶切、DNA序列测定等在内的各种分子生物学操作和临床动物免疫试验，整个提纯过程不需用特殊仪器，试验人员也不用进行专门的操作培训。本发明人基于把它运用于实践生产的目的，作了进一步研究，确实找到了利用硅藻土快速提纯质粒DNA的方法。
所以，本发明的目的是提供一种快速、大量、简易、高效、高质、价廉和无害的质粒DNA的提纯新方法。
在质粒DNA提取技术中，要获取质量好、纯度高的质粒DNA，关键技术在于菌体裂解、蛋白质和RNA的消除。本发明的核心部分是所用试剂采用不同pH和不同浓度的盐，在高盐状态下，处理的硅藻土能专一地吸附DNA，而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来，所提取的质粒DNA纯度能满足分子生物学有关试验，包括克隆鉴定酶切、连接、序列测定和转染等，并能满足临床动物试验的要求。
本发明包括9种试剂，即菌体清洗液、菌体重悬缓冲液(R1)；菌体裂解液(R2)；裂解中和液(R3)；异丙醇(R4)、硅藻土悬液(R5)；蛋白洗涤液(R6)；80％乙醇(R7)；DNA稀释液(R8)。它们的组成及配比分别为试剂 菌体清洗液组分0.1mmol/LNaCl10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)配比配制100ml溶液取2.5mol/L NaCl4ml1mol/L Tris-HCl1ml5mol/LEDTA 1ml双蒸水 80ml用消毒双蒸水定容至100ml，115℃灭菌20分钟，4℃保存。
试剂R1组分50mmol/L 葡萄糖50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)150μg/mlRNaseA配比配制100ml R1取葡萄糖(C6H12O6) 0.991克双蒸水 80ml0.5mol EDTA(pH8.0) 2ml1mol Tris-HCl(pH8.0) 2.5ml用消毒双蒸水定容至100ml，115℃灭菌20分钟，使用时按每100ml溶液中加入150mgRnaseA。4℃保存。
试剂R2组分0.2molNaOH1％ SDS配比配制100ml R2取10mol NaOH 2ml双蒸水 80ml10％SDS 10ml用消毒双蒸水定容至100ml，室温保存。
试剂R3组分4mmol/L KAc，pH4.8取醋酸钾 23.55克双蒸水60ml搅拌溶解后，加入28.5ml冰醋酸，用约1.5ml浓盐酸调pH为4.8，补消毒双蒸水至100ml。室温保存。
试剂R4异丙醇(分析纯)为商业化试剂。
试剂R5组分盐酸胍 69.9克双蒸水 60ml硅藻土 5克取68.9克盐酸胍用40ml的消毒双蒸水溶解，再定容至100ml。
硅藻土的处理取一定量的硅藻土加入一定体积的浓硝酸处理约30分钟。弃去硝酸，用蒸馏水清洗后，离心，烘干即可。
试剂R6组分50％ 乙醇0.1mol/L NaCl0.01mol/L Tris-HCl pH7.5，0.05mol/L EDTA配比配制100ml R5取无水乙醇 50ml2.5mol/L NaCl 4ml1mol/L Tris-HCl 10ml0.05mol/L EDTA(pH8.0) 10ml用消毒的水蒸水定容至100ml.室温保存。
试剂R7组分无水乙醇 80ml双蒸水 20ml搅拌混合后，室温保存。
试剂R8组分TE缓冲液(pH7.6) 100ml配比配置100ml TE缓冲液取Tris盐(分析纯) 1.58克EDTA(分析纯) 0.372克双蒸水 80ml搅拌溶解后，调至pH7.6，用灭菌双蒸水定容至100ml。4℃保存。
与现有报道的方法比较表明，本发明主要的优点为操作简便，结果稳定；耗时短，90分钟以内可完成全部过程；得量高，对一高拷贝质粒，常规培养18小时，当细菌生长密度OD600约为3.5时，1.5ml菌液可获得10-15μg DNA；纯度好，无蛋白质和RNA污染，提取的质粒DNA可供内切酶酶切、连接、序列测定、真核细胞转染等分子生物学试验用，并经过放大可用于DNA疫苗的制备；价廉，与国内外同类产品比较，价格降低50％；由于不需用酚和氯仿，既消除了环境污染之虑，又对试验操作人员身体无害；操作简单，无需对试验人员进行专门的操作培训；试验所用仪器简单，不用购买特殊昂贵的仪器。
应用本方法提取质粒DNA可按下列具体方法操作(1)按常规摇瓶大量培养细菌扩增质粒(详见《分子克隆试验指南》)；
(2)取经常规培养18-20小时的菌体，取500ml菌液，室温以5000rpm离心10分钟，弃上清；(3)用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支50ml离心管中，室温以6000rpm 5分钟，弃上清；(4)沉淀中加5ml预冷的R1，充分振荡混匀；(5)加入10ml新鲜配制的R2，轻轻颠倒5次混匀，冰浴约10分钟；(6)加入7.5ml预冷的R3，轻轻颠倒5次混匀，冰浴约5分钟；(7)4℃，以12000rpm离心10分钟，取上清至另外的50ml离心管中；(8)加入0.6倍体积的R4，颠倒混匀，室温放置10分钟，4℃，以12000rpm离心10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明；(9)加入5ml R8(TE)使之溶解；(10)加入5ml R5，取用时摇匀，室温吸附5分钟，12000rpm离心5分钟，弃去离心液；(11)加入5ml R6，室温12000rpm离心5分钟，弃去离心液；(12)加入5ml R7，室温12000rpm离心5分钟，弃去离心液，室温放置10分钟，使之干燥；(13)用1ml R8溶解，室温放置8分钟(或37℃放置5分钟)，解吸附，室温12000rpm离心5分钟，--20℃保存备用；所得质粒DNA，取2μL电泳(0.8％琼脂糖，80V，30分钟)检测其纯度并用紫外分光光度计定量。

图1对含同一质粒DNA的菌体应用本方法和应用Qiagen柱式纯化试剂盒和国产赛百盛树脂型试剂盒提取的质粒DNA电泳图谱。图中，Mark为DL15000分子量标志物1A、2A为使用本方法所提取的质粒DNA；3A、4A为使用Qiagen柱式纯化试剂盒所提取的相应质粒DNA；5A、6A为使用赛百盛树脂型试剂盒所提取的相应质粒DNA。图1结果表明使用本发明提取的质粒DNA与国内外质粒纯化试剂盒比较，在纯度和产量方面无明显区别。
权利要求
1.一种快速大规模提纯质粒DNA的新方法，其特征材料在于包括(1)菌体清洗液，组分为0.1mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)；(2)菌体重悬缓冲液(R1)，R1的组分为50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，200μg RnaseA；(3)菌体裂解液(R2)，R2的组分为200mmol/L NaOH，1％SDS；(4)裂解中和液(R3)，R3的组分为4mmol/L KAc，pH4.8；(5)异丙醇(R4)，R4的组分为商业分析纯试剂；(6)硅藻土悬液(R5)，R5的组分为5克硅藻土与50ml 7mol/盐酸胍混合，取用时摇匀；(7)蛋白洗涤液(R6)，R6的组分为50％乙醇，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L EDTA；(8)80％乙醇(R7)，R7的组分为80％的分析纯的乙醇；(9)DNA稀释液(R8)，R8的组分为TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl pH7.5，1mmol/L EDTA)；(10)另需有若干50--100ml离心管。
2.权利要求1所述的大量提纯质粒DNA的新方法，其特征在于按如下步骤操作(1)按常规摇瓶大量培养细菌扩增质粒(详见《分子克隆试验指南》)；(2)取经常规培养18-20小时的菌体，取500ml菌液，室温以5000rpm离心10分钟，弃上清；(3)用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支50ml离心管中，室温以6000rpm 5分钟，弃上清；(4)沉淀中加5ml预冷的R1，充分振荡混匀；(5)加入10ml新鲜配制的R2，轻轻颠倒5次混匀，冰浴约10分钟；(6)加入7.5ml预冷的R3，轻轻颠倒5次混匀，冰浴约5分钟；(7)4℃，以12000rpm离心10分钟，取上清至另外的50ml离心管中；(8)加入0.6倍体积的R4，颠倒混匀，室温放置10分钟，4℃，以12000rpm离心10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明；(9)加入5ml R8(TE)使之溶解；(10)加入5ml R5，取用时摇匀，室温吸附5分钟，12000rpm离心5分钟，弃去离心液；(11)加入5ml R6，室温12000rpm离心5分钟，弃去离心液；(12)加入5ml R7，室温12000rpm离心5分钟，弃去离心液，室温放置10分钟，使之干燥；(13)用1ml R8溶解，室温放置8分钟(或37℃放置5分钟)，解吸附，室温12000rpm离心5分钟，--20℃保存备用；
3.按权利要求1所述的提纯质粒DNA的材料，其特征在于所述试剂R4的配制为5克硅藻土与50ml 7mol/L盐酸胍混合，取用时一定摇匀，且硅藻土必须要求酸化处理。
4.按权利要求1所述的提纯质粒DNA的材料，其特征在于所述试剂R5的配制为50％乙醇，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
全文摘要
本发明涉及分子生物学研究领域，为一种简易快速大规模提纯质粒DNA的新方法。本方法所用试剂包括菌体清洗液、菌体重悬缓冲液、菌体裂解液、裂解中和液、异丙醇、硅藻土悬液、蛋白洗涤液、80％乙醇、DNA稀释液九种试剂和50ml－100ml离心管。本发明与现有提纯方法比较操作简便，一次提取仅需90分钟。本发明结果稳定，得量高，纯度好，无蛋白质和RNA污染，与应用Qiagen柱式纯化试剂盒和国产赛百盛树脂型试剂盒提取相同的质粒DNA比较，所得DNA的电泳条带同样清晰，无RNA混杂。本发明价格低廉，不需用酚和氯仿等有毒试剂，经放大可用于DNA疫苗的制备。
文档编号C07H1/06GK1660878SQ20041008144
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者王红宁, 汪洋, 周生, 胡慧琼, 余祖华, 陈萍 申请人:四川农业大学, 王红宁