专利名称：可完全溶解于葡萄酒中的新的甘露糖蛋白及其在对葡萄酒加以稳定的过程中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的甘露糖蛋白、它的制备方法及其在对葡萄酒加以稳定的过程中的用途。
背景技术：
酒石酸盐、酒石酸氢钾(KHT)、酒石酸钙(CaT)的存在以及蛋白质浑浊的发生是造成葡萄酒不稳定的主要原因。
酒石酸是葡萄浆果发育过程中产生的主要有机酸。在加工浆果的过程中，酒石酸以钾盐和钙盐的形式溶解进葡萄汁。在发酵过程中，酒石酸盐的溶解度随着(糖发酵所致的)乙醇浓度的增加而下降。
在新酿的葡萄酒中，酒石酸氢钾(KHT)的浓度总是过饱和，并自发地结晶。在将葡萄酒装瓶之后，由于结晶的不可预测的性质，KHT不稳定性可能会成为商业性的问题。此外，消费者通常将葡萄酒瓶中存在晶体看作是葡萄酒质量差的象征。可以在将葡萄酒装瓶之前使用物理处理以防酒石酸盐结晶。这些处理包括通过将葡萄酒冷却至-4℃来促进结晶，或通过电渗析或使用离子交换树脂来消除钾离子和酒石酸离子。然而，这些费时且耗能的方法被推测会改变葡萄酒的胶体平衡。
替代物理处理的方法是使用可以防止KHT晶体成核和/或生长的添加剂。
羧甲基纤维素和偏酒石酸属于可抑制KHT晶体生长的添加剂。但不幸地，羧甲基纤维素并不被葡萄酒界接受，原因是它可能会对处理过的葡萄酒产生不良的感官(organoleptic)影响。另一方面，偏酒石酸在葡萄酒的pH下以及储存葡萄酒的温度下不稳定。偏酒石酸会随时间水解，并且它的保护作用也会随时间消失。因此，它的用途被限制在快速消费的低质量葡萄酒。另一缺陷在于，理想而言，添加剂应当是葡萄酒的天然组分。而这显然并非可采用偏酒石酸或羧甲基纤维素的情况。
葡萄酒不稳定的另一个原因是不稳定的葡萄酒类蛋白质的聚集，这会导致蛋白质浑浊的形成，其作用于降低感觉的葡萄酒质量。目前，使用斑脱土(bentonite)来从葡萄酒中去除蛋白质浑浊的形成。然而，这种处理会对葡萄酒的感官特性产生不良影响。此外，这样的处理需要酿葡萄酒者付出额外的劳动，并由于被斑脱土吸收而导致葡萄酒的损失。
可以抑制蛋白质浑浊形成并对KHT晶体的成核和生长速率具有活性的天然添加剂相对于化学添加剂而言是优选的。
天然添加剂的例子是甘露糖蛋白。甘露糖蛋白以及葡聚糖是酵母细胞壁的主要成分(Lipke P.N.等，J.Bacteriol.(1998)180(15)3735-3740)。主要通过两类方法从酵母细胞获得甘露糖蛋白物理方法和酶促方法。获得甘露糖蛋白的最常用的物理方法描述于Peat S.等，J.Chem.Soc.London(1961)28-35中，在该方法中，在柠檬酸盐缓冲液中将酵母在138℃下高压灭菌2小时，在去除细胞壁之后，通过添加乙醇使产物沉淀，通过渗析进一步纯化，然后通过冷冻干燥将其分离。由酵母获得甘露糖蛋白的酶促方法描述于WO 96/13571和WO 97/49794中，该方法主要包括用β-葡聚糖酶制剂处理已分离的酵母细胞壁，然后通过超滤分离产物。
通过已知方法制备的(例如通过高压灭菌获得的)甘露糖蛋白具有如下缺点它一旦被加入葡萄酒中即产生不期望看到的浑浊度，并且有时会产生副产物沉淀。此外，所述甘露糖蛋白防止KHT晶体成核和/或生长或防止蛋白质浑浊形成的效果并不总是令人满意。
EP-A-1094117描述了制备可溶性甘露糖蛋白的方法，所述方法减轻了在甘露糖蛋白制备中存在的由副产物引起的浑浊度问题。在此方法中，酵母细胞壁在自溶之后被分离，随后在95-100℃下进行选择性水解15-30小时，从而将甘露糖蛋白和其它杂质溶解。需要数个步骤来纯化已溶解的甘露糖蛋白，包括超滤，然后在0-6℃下保持数小时，以及通过澄清离心机(clarification centrifuge)分离胶体副产物。此方法很复杂，并不真正适合以商业规模生产甘露糖蛋白。
因此，需要新的(可溶性)甘露糖蛋白(或其制剂)，所述甘露糖蛋白在加入葡萄酒中后不存在副产物引起的浑浊和/或副产物沉淀的问题。此甘露糖蛋白可以呈现抑制KHT晶体形成或蛋白质浑浊形成的改善的活性。还需要制备所述新的甘露糖蛋白的更有效的方法。
发明详述在第一方面，本发明提供了甘露糖蛋白的制备方法，所述方法包括a)对酵母细胞的悬浮液进行酶促水解，以使所述酵母细胞降解，并使甘露糖蛋白和其它酵母组分从已降解的细胞中溶解并释放；b)回收已溶解的甘露糖蛋白；以及可选地c)用pH至少为9的碱性溶液处理被回收的甘露糖蛋白。
在本文中，“甘露糖蛋白”定义了下述产物，所述产物是用本发明的方法从酵母得到的，并可以通过标准分析方法(例如氨基酸分析、碳水化合物分析等)将该产物确认为蛋白质部分与包含主要由甘露糖构成的聚合物的碳水化合物部分的组合。碳水化合物部分和蛋白质部分不需要彼此共价键合。
在本发明的步骤a)中，对酵母细胞的悬浮液进行酶促水解，以使所述酵母细胞降解，并使甘露糖蛋白和其它酵母组分从已降解的细胞中溶解并释放。
任何类型的酵母可以用于本发明的方法。具体地，可以适宜地使用属于Saccaromyces、Kluyveromyces或Candida属的酵母菌株。优选属于Saccaromyces属的酵母菌株，例如Saccaromyces cerevisiae的菌株。
本发明的方法可以以酵母细胞在水性液体中的悬浮液(例如所述酵母细胞的发酵培养液)开始。形成发酵细胞悬浮液的合适发酵方法在本领域中是已知的。在有些情况下，在将发酵培养液用于本方法之前，可以例如通过离心或过滤将其浓缩。例如，可以使用膏状酵母(被浓缩至15-27％(w/w)干物质含量的面包酵母)。
在步骤a)中，通过使酵母细胞悬浮液经历天然酵母酶和/或添加的外源酶的作用，可以进行对所述悬浮液的酶促水解。
用于进行酶促水解的条件取决于所用酶的类型，并可被本领域的技术人员容易地确定。通常，酶促水解在4-10的pH和40-70℃的温度下进行。通常，酶促水解进行的时间为1-24小时。
可选地，在添加任何外源酶之前，将天然酵母酶灭活。本领域的技术人员知道如果将天然酵母酶灭活。灭活可以例如通过pH处理或热激来进行，优选热激方法。适宜地，热激可以通过在80-97℃的温度下处理酵母细胞悬浮液5-10分钟进行。一旦天然酵母酶已灭活，即可将外源酶加入酵母细胞悬浮液，以进行酶促水解。为了此目的，优选使用蛋白酶，更优选使用内切蛋白酶。可选地，使用酶将RNA转化为5’-核糖核苷酸，例如用5’-Fdase，可选地，还可以在用上述酶进行处理的同时或之后使用脱氨酶(例如腺苷酸脱氨酶)。
在一种优选实施方式中，通过使酵母细胞悬浮液自溶进行酶促水解。自溶是下述过程，其中，通过(部分地)破坏和/或分裂酵母细胞壁而打开酵母细胞之后，在介质中释放出的活性天然酵母酶至少部分地进行对酵母细胞和聚合酵母物质的降解。
自溶可按照本领域中已知的方法(例如，Conway J.等，Can.J.Microbiol.(2001)4718-24)进行。
典型地，通过机械、化学或酶促处理(部分地)破坏和/或分裂酵母细胞壁而打开酵母细胞，由此引发酵母细胞的自溶。优选地，以酶促方式实现通过(部分地)破坏和/或分裂微生物细胞壁打开酵母细胞。可以使用数种酶，但优选使用蛋白酶，更优选内切蛋白酶。通常，用于打开酵母细胞和以酶促方式破坏和/或分裂微生物细胞壁的条件将与在微生物自溶过程中所用的条件相符合。当用酶来通过(部分地)破坏和/或分裂酵母细胞壁而打开酵母细胞时，所述酶还作用于酵母细胞和聚合酵母物质的降解。
在步骤b)之前，通常例如用前述方法将步骤a)中所用的(多种)酶灭活。
在本发明的方法的步骤b)中，从已降解的酵母细胞溶解并释放的甘露糖蛋白被回收。优选地，在步骤b)中，在回收甘露糖蛋白之前，通常通过固-液分离方法，优选通过离心或过滤，去除例如从酵母细胞壁得到的不溶性物质。可以通过任何合适的方法回收甘露糖蛋白。优选地，通过超滤(UF)来回收甘露糖蛋白。当用UF来回收甘露糖蛋白时，可以使用分子量分离点为100kD或更低、优选3-50kD、更优选3-10kD的过滤器。甘露糖蛋白保留在超滤步骤所得的滞留物中。如果在超滤之前未去除不溶性材料，则包含甘露糖蛋白的滞留物和不溶性材料可重新悬浮(于溶液中)，因此优选去除不溶性材料。
可选地，在步骤b)之后但在步骤c)之前，可以使用Fdase处理回收的甘露糖蛋白，以去除一部分RNA残余物。
在本发明的方法的步骤c)中，用pH至少为9的碱性溶液处理回收的甘露糖蛋白。优选地，所述处理在至少10、优选10-13、更优选11-13的pH下进行。通常，步骤c)中的处理在室温(例如20℃)至120℃、更优选室温(例如20℃)至100℃的温度下进行。通常，所述处理进行的时间为1小时至1星期，这取决于温度。通常，较高的pH需要较低的反应温度，而较高的反应温度需要较短的反应时间。因此，在pH12和室温下进行1个星期的处理以及在pH12和70℃下进行2小时的处理或者在pH10和70℃下进行24小时的处理，均落在本发明的范围内。可以使用任何合适的食品级的碱来进行该pH处理。合适的碱的例子是氢氧化钠或氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾、磷酸钠或磷酸钾、氢氧化铵。优选氢氧化钠或氢氧化钾。
优选地，步骤c)中的处理在下述温度、持续时间和pH条件下进行，所述温度、持续时间和pH条件使得与处理前的甘露糖蛋白在相同条件下测定的31P-NMR谱相比，步骤c)中得到的产物的31P-NMR(在27℃下，在pH为8的D2O中测定，并使用甘油磷酰胆碱(GPC)作为内标(取GPC的化学位移值为0.43))表明，在4.5与5.5ppm之间出现由磷酸甘露糖单酯所产生的一个或更多个峰或所述峰的强度增加，在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的一个或更多个峰消失或强度减小。优选地，用碱性溶液进行的处理在如下条件下进行，所述条件使得在所述31P-NMR谱中，在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的一个或更多个峰的面积与在4.5与5.5ppm之间由磷酸甘露糖单酯所产生的一个或更多个峰的面积之比为至少90∶10，优选至少75∶25，更优选至少50∶50，甚至更优选至少25∶75，甚至更优选至少10∶90，最优选约0∶100。因此，最优选地，反应优选在如下条件下进行，所述条件使得在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的所述一个或更多个峰(几乎)完全消失，并被在4.5与5.5ppm之间由磷酸甘露糖单酯所产生的一个或更多个峰取代。本领域的技术人员可以例如通过二维NMR(例如通过31P-1H相关波谱法，参见例如Chary K.V.R.等，J.Magn.Reson.Series B(1993)10281-83)来区分由磷酸甘露糖的磷酸单酯和磷酸二酯所产生的峰与由属于其它化合物(例如RNA、单-、寡-和多核糖核苷酸)的其它磷酸单酯和磷酸二酯所产生的峰。
在一种优选实施方式中，步骤c)中的处理在下述温度、持续时间和pH条件下进行，所述温度、持续时间和pH条件使得RNA、寡-和多核糖核苷酸导致的杂质至少部分、优选至少50％、甚至更优选全部被降解为单核糖核苷酸。此降解可通过31P-NMR验证。在与上述相同的条件下测定的尤RNA、寡-和多核糖核苷酸导致的磷酸二酯的31P-NMR包括在约0ppm处的一个或更多个峰，而单核糖核苷酸导致的磷酸单酯的31P-NMR包括在约5ppm、通常约4-5ppm(略高于磷酸甘露糖单酯的区域)处的一个或更多个峰。
可选地，一旦已完成碱性处理，即可使用本领域技术人员已知的食品级的酸来中和反应混合物。
优选地，本发明的方法还包括步骤d)通过超滤纯化经处理的甘露糖蛋白。
典型地，通过对在步骤c)中得到的经处理的甘露糖蛋白进行一个或更多个超滤步骤来进行步骤d)。可以使用具有如上所述分子量分离点的超滤膜。
在步骤c)的处理过程中，可能形成一些不溶物。在此情况下，可以在步骤c)之后且步骤d)之前和/或步骤d)之后，通过常用的固-液分离方法(例如过滤或离心)除去这些不溶物。
步骤c)或d)后所得的甘露糖蛋白通常作为溶液获得，可以用本领域技术人员已知的方法将其进一步浓缩和/或干燥，例如通过在真空下浓缩甘露糖蛋白溶液以及对经浓缩的溶液进行喷雾干燥或冷冻干燥来进行。
在第二方面，本发明提供了可由第一方面的方法获得的甘露糖蛋白。
本发明的甘露糖蛋白的分子量优选至多100kDa，更优选1-50kDa，甚至更优选3-30kDa之间的分子量。本发明的甘露糖蛋白优选通过以下方式表征基于甘露糖蛋白干物质的碳水化合物含量为至少50％(w/w)，基于碳水化合物总量的碳水化合物含量为70％(w/w)，由甘露糖寡聚物或多聚物形式的甘露糖残基组成。
如上所述测定的本发明的甘露糖蛋白的31P-NMR优选包括在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的一个或更多个峰和/或在4.5与5.5ppm之间由磷酸甘露糖单酯所产生的一个或更多个峰。更优选地，在所述31P-NMR谱中，在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的一个或更多个峰的面积与在4.5与5.5ppm之间由磷酸甘露糖单酯所产生的一个或更多个峰的面积之比为至少90∶10，优选至少75∶25，更优选至少50∶50，甚至更优选至少25∶75，甚至更优选至少10∶90，最优选约0∶100。
十分令人惊讶地，当以有效量将可由本发明的方法获得的甘露糖蛋白添加至葡萄酒中时，可仅引起最小程度的可见浑浊和/或副产物沉淀。当以有效量添加至葡萄酒中时，甚至在高甘露糖蛋白浓度(例如800mg/l)下，本发明(例如在步骤c)中获得)的甘露糖蛋白可以完全不产生浑浊或副产物沉淀。这些结果与用已知方法制备的甘露糖蛋白获得的结果大不相同。例如，当用上述Peat等的方法获得的甘露糖蛋白被加入葡萄酒中时，会形成浑浊以及不想要的沉淀。
已观察到，甘露糖蛋白在葡萄酒中提高的溶解度以及可选增加的作为葡萄酒稳定剂的活性与本发明的甘露糖蛋白按照上述方法测定的31P-NMR谱中在4.5与5.5ppm之间由磷酸甘露糖单酯所产生的峰的面积增大相关。
本发明的甘露糖蛋白在葡萄酒中的溶解度提高，使此甘露糖蛋白特别适合作为添加剂用于对葡萄酒加以稳定的过程中。
本发明的甘露糖蛋白可以作为单独葡萄酒添加剂或以组合物的形式使用。因此，本发明的第三方面提供了包含第二方面的甘露糖蛋白和一种或更多种葡萄酒添加剂的组合物。葡萄酒添加剂的例子是偏酒石酸或阿拉伯胶。优选的组合物包含根据本发明的甘露糖蛋白和阿拉伯胶。
本发明的第四方面提供了第二方面的甘露糖蛋白或第三方面的组合物在对葡萄酒加以稳定的过程中的用途。
具体地，本发明提供了通过防止和/或延迟酒石酸盐结晶以稳定葡萄酒的方法，其中本发明的甘露糖蛋白或本发明的组合物被加入葡萄酒中或用于制造葡萄酒的葡萄汁中。优选地，在成熟(ageing)期间(即发酵后且装瓶前)将甘露糖蛋白或其组合物加入葡萄酒中。本发明非常适用于白葡萄酒、玫瑰葡萄酒，但同样适用于红葡萄酒。
本发明的甘露糖蛋白以足以获得稳定效果的量添加。所述稳定效果相当于或优于以相同量使用的已知甘露糖蛋白所达到的稳定效果。通常，本发明的甘露糖蛋白可以以每升葡萄酒10-1000mg的浓度添加至葡萄酒中。添加甘露糖蛋白至每升葡萄酒10-400mg的最终浓度，即可得到良好结果。本领域技术人员应当理解，添加的量还将取决于例如其它葡萄酒稳定剂的添加或存在，以及添加之前葡萄酒中的KHT的过饱和度。
可以通过以下方法对葡萄酒中的KHT的成核和晶体生长进行测定和定量(Moutounet等Actualités OEnologiques 1999 Vieme SymposiumInternational d’Oenologie de Bordeaux(Lonvaud-Funel ed.))。
对晶体成核加以指示的第一种方法测定当在-4℃下储存时在葡萄酒中出现晶体的时间。每天进行目测，以天数表示检测到晶体出现所需的时间(Tcrys)。
对晶体生长加以指示的第二种方法测定葡萄酒的酒石酸不稳定度(DTI)。在-4℃下搅拌葡萄酒，并测定初始电导率。随后，加入经校正的KHT晶体，然后测定达到稳定值之后的电导率。DTI被定义为初始电导率减少的百分比。
第三种方法测定溶解的酒石酸的真实浓度。将精确体积的葡萄酒转移到玻璃小瓶中，并且与相同精确体积的包含浓度精确已知的马来酸的D2O混合。在完全松弛的条件下进行1H HMR，比较内标(马来酸)的积分(integral)与酒石酸的积分。以此方式，可以以非常高的精度和准确度确定溶解的酒石酸的浓度。
本发明还提供了通过防止和/或减少蛋白质浑浊形成来对葡萄酒加以稳定的方法，其中本发明的甘露糖蛋白或本发明的组合物被加入葡萄酒中或用于制造葡萄酒的葡萄汁中。而且，在此情况下，本发明的甘露糖蛋白以足以达到稳定效果的量添加。按照以下方法，可以测定在葡萄酒中添加本发明的甘露糖蛋白之后与蛋白质浑浊形成有关的葡萄酒稳定性。在80℃下加热葡萄酒样品6小时，然后冷却至4℃。在不稳定蛋白质引起浑浊之后进行浊度测定(860nm)或吸光度测定(540nm)。
与酒石酸盐结晶相关的不稳定的葡萄酒的Tcrys可在0.5与15天之间变化。根据本发明的另一方面，通过以适合防止和/或延迟酒石酸盐结晶的浓度，在葡萄酒中或在制造葡萄酒的发酵中所用的葡萄汁中添加第二方面的甘露糖蛋白，可以获得经过稳定的葡萄酒。所述经过稳定的葡萄酒的特征是如上述第一种方法测定的Tcrys(经过稳定的葡萄酒)/Tcrys(不稳定的葡萄酒)为至少2，优选至少5，更优选至少10，甚至更优选20-40。
如果需要，本发明的一个方面的优选特征可以同样地应用于另一个方面。
通过以下实施例描述本发明，但这些实施例无意于限制本发明。
实施例通过用Kjeldahal方法测定总氮量并将所得值乘以因子6.25，可以确定本发明的甘露糖蛋白中的蛋白质的量。
可以根据公知的蒽酮比色法确定本发明的甘露糖蛋白中的碳水化合物的量(基于甘露糖蛋白干物质)。
可以使用离子交换色谱测定本发明的甘露糖蛋白中的甘露糖的量。在用4N的TFA在100℃下水解甘露糖蛋白4小时之后，对水解产物进行分析，所述分析以纯甘露糖为标准，使用在注射阀前面装备有内嵌预处理Amino TrapTM柱(Dionex-USA)、Borate Trap柱(Dionex-USA)的CarboPacTMPA10阴离子交换柱(Dionex-USA)，并使用升高梯度的NaOH。通过使用脉冲电流滴定检测来进行甘露糖的检测。
可根据公知的AES-ICP方法(带电感耦合等离子辅助的原子发射光谱)来测定甘露糖蛋白中磷的量。
实施例1通过自溶酵母提取过程由酵母制备甘露糖蛋白将2L源自Saccharomyces cerevisiae的膏状酵母加热至51℃。然后，添加3.0ml Pescalase(可从荷兰的DSM Food Specialties购得的丝氨酸蛋白酶)，并将混合物在pH5.1以及51.5℃下培养24小时。接着，在65℃下加热自溶产物1小时，以使所有酶灭活。通过离心将提取物(可溶性部分)与不溶性细胞壁分离。
通过在分子量分离点为10kDa的过滤器上进行超滤，将可溶性部分中存在的高分子量甘露糖蛋白与其它可溶物分离。将甘露糖蛋白回收于超滤滞留物部分中。
关于甘露糖蛋白(MP-0)回收的数据示于表1。
表1
在前面提到的条件下测定的MP-0的31P-NMR包括从δ+0.14至δ-0.14的宽信号(多核苷酸)以及在δ-1.33和δ-1.40处的两个尖信号(甘露糖磷酸二酯)。
实施例2对实施例1中所得的甘露糖蛋白的碱性处理将实施例1的方法所得的粗制甘露糖蛋白制备成浓度为20g/l的溶液。用4M的氢氧化钠溶液将该溶液的pH调节至12.0，并将其在室温下保存1星期。在此期间两次将pH调成12.0。1星期后，用4M的盐酸溶液中和所述溶液。最后，通过使用分离点为10kD的膜进行超滤去除盐和降解产物。将滞留物(MP-1)冷冻干燥。
MP-1的31P-NMR包括在δ+5.13和δ+5.01处的两个尖信号(甘露糖磷酸单酯)。
实施例3实施例1和2中所得的甘露糖蛋白对不稳定葡萄酒中KHT结晶的影响通过标准热提取及上述Peat等的方法得到分子量为3-100kD的甘露糖蛋白MP-2，并将其性能与MP-0和MP-1的性能进行比较。
MP-2的31P-NMR包括从δ+0.14至δ-0.14的宽信号(多核苷酸)以及在δ-1.32和δ-1.38处的两个尖信号(甘露糖磷酸二酯)。
以20g/l的浓度将MP-0、MP-1和甘露糖蛋白MP-2溶解在水中。在不稳定的白葡萄酒中添加少量体积，以使最终浓度达到100、150、200、300、400和600mg/l。在-4℃下保存溶液。
由于当加入葡萄酒中时MP-0和MP-2引起不想要的浑浊和沉淀，因此在以所需浓度向葡萄酒中添加MP-0和MP-2之后，将样品在4℃下保存2小时。在此期间产生显著沉淀，通过离心将其去除。将MP-0和MP-2的上层清液再次保持在-4℃。针对KHT晶体的出现，每天监测全部溶液。
表2列出了以按照前述第一种方法测定的Tcrys表示的结果。
表2表明，在将在4℃下2小时形成的沉淀通过离心去除之后，MP-0并未再生成浑浊和沉淀。另一方面，在将首先形成的沉淀去除之后，MP-2仍生成大量沉淀。这清楚地表明，本发明的甘露糖蛋白比通过高压灭菌制备的甘露糖蛋白更多地溶解于葡萄酒中。此外，表1清楚地表明，MP-1是唯一不需要去除浑浊和沉淀、并在甚至许多天后以高浓度保持完全溶于葡萄酒的甘露糖蛋白样品。而且，与所有其它的产品相比，MP-1作为葡萄酒稳定剂十分有效。MP-2也是有效的葡萄酒稳定剂，当将其加入葡萄酒中时会产生浑浊和副产物沉淀，这是不期望的副效应。
表2
实施例4对用实施例2中所述的方法得到的甘露糖蛋白的表征首先用与实施例1中所述相同的方法得到粗制甘露糖蛋白，然后用与实施例2中所述相同的方法对其进行处理，用碳水化合物、蛋白质和磷的含量对所述甘露糖蛋白进行表征。结果示于表3。
表3
以P2O5表示的磷的量相当于0.77％(w/w，基于干物质)。
权利要求
1.甘露糖蛋白的制备方法，所述方法包括a)对酵母细胞的悬浮液进行酶促水解，以使所述酵母细胞降解，并使甘露糖蛋白和其它酵母组分从已降解的酵母细胞中溶解并释放；b)回收已溶解的甘露糖蛋白；以及可选地c)用pH至少为9的碱性溶液处理被回收的甘露糖蛋白。
2.如权利要求1的方法，其中步骤a)中的所述酶促水解通过使所述酵母细胞的悬浮液自溶来进行。
3.如权利要求1或2的方法，还包括d)通过超滤纯化经处理的甘露糖蛋白。
4.如权利要求1-3中任何一项的方法，其中通过超滤回收步骤b)中的所述已溶解的甘露糖蛋白。
5.如权利要求1-4中任何一项的方法，其中，在步骤b)中所述的回收已溶解的甘露糖蛋白之前，通过固-液分离方法，优选通过离心或过滤，去除不溶性物质。
6.如权利要求1-5中任何一项的方法，其中步骤c)中的所述处理在至少10、优选10-13、更优选11-13的pH下进行。
7.如权利要求1-6中任何一项的方法，其中步骤c)中的所述处理在室温至120℃、优选室温至100℃的温度下进行。
8.如权利要求1-7中任何一项的方法，其中所述处理的进行时间为1小时至1星期。
9.如权利要求1-8中任何一项的方法，其中步骤c)中的所述处理在下述温度、持续时间和pH条件下进行，所述温度、持续时间和pH条件使得与处理前的甘露糖蛋白在相同条件下测定的31P-NMR谱相比，步骤c)中得到的产物的31P-NMR表明，在4.5与5.5ppm之间出现由磷酸甘露糖单酯所产生的一个或更多个峰或所述峰的强度增加，在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的一个或更多个峰消失或强度减小，所述测定在27℃下，在pH为8的D2O中进行，并使用甘油磷酰胆碱(GPC)作为内标，其中GPC的化学位移值取为0.43。
10.如权利要求9的方法，其中用碱性溶液进行的所述处理在如下条件下进行，所述条件使得在所述31P-NMR谱中，在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的所述一个或更多个峰的面积与在4.5与5.5ppm之间由磷酸甘露糖单酯所产生的所述一个或更多个峰的面积之比为至少90∶10，优选至少75∶25，更优选至少50∶50，甚至更优选至少25∶75，甚至更优选至少10∶90，最优选约0∶100。
11.如权利要求1-10中任何一项的方法，其中步骤c)中的所述处理在下述温度、持续时间和pH条件下进行，所述温度、持续时间和pH条件使得RNA、寡-和多核糖核苷酸杂质的至少部分、优选至少50％、甚至更优选全部被降解为单核苷酸。
12.可由权利要求1-11中任何一项的方法获得的甘露糖蛋白。
13.如权利要求12的甘露糖蛋白，其中所述甘露糖蛋白的31P-NMR优选包括在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的一个或更多个峰和/或在4.5与5.5ppm之间由磷酸甘露糖单酯所产生的一个或更多个峰，更优选地，在-1与-2ppm之间由磷酸甘露糖二酯所产生的所述一个或更多个峰的面积与在4.5与5.5ppm之间由磷酸甘露糖单酯所产生的所述一个或更多个峰的面积之比为至少90∶10，优选至少75∶25，更优选至少50∶50，甚至更优选至少25∶75，甚至更优选至少10∶90，最优选约0∶100，所述测定在27℃下，在pH为8的D2O中进行，并使用甘油磷酰胆碱(GPC)作为内标，其中GPC的化学位移值取为0.43。
14.包含权利要求12或13的甘露糖蛋白以及一种或更多种葡萄酒添加剂的组合物。
15.权利要求12或13的甘露糖蛋白或如权利要求14的组合物在对葡萄酒加以稳定的过程中的用途。
16.通过防止或延迟酒石酸盐结晶以对葡萄酒加以稳定的方法，其中权利要求12或13的甘露糖蛋白或如权利要求14的组合物被加入葡萄酒中或用于制造葡萄酒的葡萄汁中。
17.通过防止或减少蛋白质浑浊的形成以对葡萄酒加以稳定的方法，其中权利要求12或13的甘露糖蛋白或如权利要求14的组合物被加入葡萄酒中或用于制造葡萄酒的葡萄汁中。
18.包含权利要求12或13的甘露糖蛋白的葡萄酒。
全文摘要
本发明描述了一种新的甘露糖蛋白，所述甘露糖蛋白可由以下方法获得，所述方法包括a)对酵母细胞的悬浮液进行酶促水解，以使所述酵母细胞降解，并使甘露糖蛋白和其它酵母组分从已降解的细胞中溶解并释放；b)回收已溶解的甘露糖蛋白；以及可选地c)用pH至少为9的碱性溶液处理被回收的甘露糖蛋白。所述新的甘露糖蛋白可以很好地溶于葡萄酒，并在防止酒石酸盐沉淀或蛋白质浑浊形成的对葡萄酒加以稳定的过程中十分有效。
文档编号C07K14/39GK101087872SQ200580044743
公开日2007年12月12日 申请日期2005年12月20日 优先权日2004年12月23日
发明者彼得·菲利普·兰克豪斯特, 伯图斯·诺丹姆 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司