专利名称：：一种藁本内酯的制备方法
技术领域：
：本发明属于一种从植物中提取有效成份的方法，特别是一种从当归与川芎的混合药材的粉末中提取制备藁本内酯的方法。技术背景-藁本内酯(ligustilide)是当归、川芎、藁本、茶芎等药材中挥发油的主要活性成分，日本当归(JapaneseDanggui)、朝鲜当归等中也含有藁本内酯。现代药理学研究表明，藁本内酯对心脑血管系统、循环系统、免疫系统等具有较强的药理作用，具有解痉、止咳平喘等抗胆碱活性，可抗血栓，改善血液循环，松弛平滑肌，降血压，镇痛，可作为指标性成分用于这些药材及其相关制剂的质量控制。但是，藁本内酯在室温下不稳定，对光、热、氧敏感，容易发生氧化作用、异构化作用、二聚作用等，所以制备时间、温度是影响其纯度的重要因素，尤其是提取步骤至关重要，直接影响到后续的纯化与干燥的步骤及藁本内酯的纯度。现有技术公开超临界提取当归与川芎的混合物的方法如下超临界co,萃取当归和川芎的研究(郁威，张锋，苏克曼.中成药，2002,24(6):411-415,433)通过对单味当归、单味川芎及复方当归和川^(1:1)在不同工艺条件分别萃取结果的比较，考察提取率的变化规律，考察的目标之一是所提取到的超临界油，二是油中具有药理活性的成分薬本内酯。结果表明，复方当归和川芎(1:1)的提取率明显高于单味产物提取率之和。该法采用的当归与川芎的1:1的配比与超临界提取条件，所提取出的藁本内酯的提取率为1.022.32%。文献报道的是包括藁本内酯在内的3种内酯的总的提取率，因此单独就藁本内酯而言，最高的提取率为小于2.32%。
发明内容本发明的目的在于提供一种藁本内酯的制备方法，解决了现有技术中的提取制备藁本内酯的工艺复杂、纯度低的技术问题。本发明一种制备藁本内酯的方法，包括一个从药材当归与川芎的粉末混合物中经超临界C02流体提取富含藁本内酯的提取物的过程，在该过程中，将提取物利用硅胶柱一次洗脱纯化，再经冷冻干燥，直到获得纯度〉99%的藁本内酯，其中，在超临界C02流体提取步骤中，超临界提取的条件为当归和川芎混合的重量比为0.2:1〈1:1或2:1〉1:1，即，当归和川芎的重量比例为当归的重量在小于1份且大于等于0.2份的重量单位之间，或者在大于1份且小于等于2份的所述的重量单位之间，川芎的重量为1份所述的重量单位，萃取温度在466(TC之间、萃取压力在2040MPa之间、0)2流速在2060L/h之间、萃取时间在1.53.0h之间。进一步的，在超临界C02流体提取步骤中，超临界提取的条件为当归和川芎混合的重量比为0.2:1〈1:1，艮口，当归的重量在小于1份且大于等于0.2份的重量单位之间，川芎的重量为1份所述的重量单位，萃取温度在4855。C之间、萃取压力在2535MPa之间、C02流速在2545L/h之间、萃取时间在1.82.5h之间。进一步的，在超临界C(V流体提取步骤中，超临界提取的条件为当归和川芎混合的重量比为0.33:1;萃取温度为50°C、萃取压力为30MPa、C02流速为30L/h、萃取时间为2.0h。具体的，所述的藁本内酯的制备方法，包括如下歩骤第一步骤，将当归和川芎按照重量百分比进行混合，然后进行粉碎，粉碎后的当归和川芎的粉末在3080目之间，将粉碎后获得的当归和川芎的混合粉末投入超临界萃取装置的萃取釜内，经超临界(U流体萃取得到富含藁本内酯的提取物；第二步骤，将第一步骤中得到的富含藁本内酯的提取物上中压硅胶柱，上柱后进行洗脱，用石油醚-乙醚(99:1)洗脱，石油醚的沸点为306(TC，得到流份；第三步骤，合并第二步骤中获得的流份，并将合并物放置在-20-5(TC温度下的冻干箱中预冻1.06.0h，然后进行20.048.0h的冷冻干燥，将获得的淡黄色油状物在低于-2(TC温度的条件下进行密闭保存。进一步的，在所述的第一步骤中，当归与川芎的混合比例0.2:1〈1:1或2:1〉1:1，萃取温度为4660°C、萃取压力为2040MPa、C(V流速为2060L/h、萃取时间为1.53.0h。本发明和现有技术相比，从当归与川芎的混合药材的粉末(0.2:1〈1:1或2:1〉1:1)经超临界C02流体提取富含藁本内酯的提取物，更利于后续的纯化步骤与干燥步骤；经硅胶柱纯化时，一次洗脱就可达到〉99%的纯度，而不需经反复多次洗脱或梯度洗脱；经冷冻干燥，得到纯度〉99%的藁本内酯。本发明采用超临界流体提取技术、柱层析技术、冷冻干燥技术三种技术联用，保持在低温条件下，快速制备纯度>99%的藁本内酯。图1是当归与川芎不同配比影响藁本内酯提取率的示意图。图2是采用本发明一种藁本内酯的制备方法获得的藁本内酯的HPLC色谱图。图3是采用本发明一种薬本内酯的制备方法获得的藁本内酯的HPLC色谱图。图4是采用本发明一种藁本内酯的制备方法获得的藁本内酯的HPLC色谱图。图5是采用本发明一种藁本内酯的制备方法获得的藁本内酯的HPLC色谱图。图6是采用本发明一种藁本内酯的制备方法获得的藁本内酯的MS结构鉴定图。具体实施方式实施例1本发明比较了当归与川芎不同配比及不同超临界提取条件对藁本内酯提取率的影响。首先，比较了当归与川芎不同配比对藁本内酯提取率的影响。比较了当归与川芎的混合比例为5:10.2:1时藁本内酯的提取率，实验表明，当当归与川芎的混合比例为0.2:1〈1:1或2:1〉1:1时藁本内酯的提取率大于当归与川芎的混合比例为1:1时藁本内酯的提取率;当当归与川芎的混合比例为0.33:1时，藁本内酯的提取率最高。实验数据如图l、表1所示。表1当归与川芎不同配比对藁本内酯含量的影响当归川芎藁本内酯提取率(%)5:11.31%4:11.49%3:11.83%2:12.52%1:12.35%0.5:12.98%0.33:13.23%0.25:13.19%0.2:13.15%实施例2本发明比较了不同超临界提取条件对藁本内酯提取率的影响。采用正交实验，考察了萃取温度、萃取压力、C(V流速、萃取时间四个因素对藁本内酯提取率的影响，实验表明，超临界提取藁本内酯的最优条件为萃取温度为5CTC、萃取压力为30MPa、0)2流速为30L/h、萃取时间为2.0h。实验数据如表2所示。表2不同超临界提取条件对藁本内酯含量的影响试验号因素薬本内酯提取率(%)A萃取温度(。c)B萃取压力(MPa)CC02流速(L/h)D萃取时间(h)i4020202.02.41%24025302.52.36%34030403.02.52%<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明采用的当归与川芎的混合比例0.2:1〈1:1或2:1〉1:1与超临界提取条件所提取的藁本内酯的提取率高于现有技术，更有利于后续的柱层析纯化步骤和冷冻干燥步骤，使制备的藁本内酯纯度更实施例3将当归与川芎的混合药材(0.33:1)粉末(40目)200g投入1L的萃取釜中，用超临界C02进行萃取。萃取釜温度50。C，压力30MPa;分离釜I温度5(TC，压力8MPa;分离釜II温度30。C，压力6MPa;C02流速为30L/h;萃取时间为2.0h。得到富含藁本内酯的提取物，藁本内酯的提取率为3.23%。将上述提取物上中压硅胶柱，在l(TC低温与避光的条件下，用石油醚(306(TC)-乙醚(99:1)洗脱，250ml为1个流份收集，经TLC薄层色谱检査后，HPLC测定，合并纯的流份，3CTC减压回收溶剂，用乙醚转移至小瓶中，挥干乙醚，冷冻干燥，得淡黄色油状物，密闭(《-2(TC)保存。薄层色谱检测取藁本内酯溶于少量乙醚，点样于硅胶G薄层板上，展开剂为石油醚(6090°C)-乙酸乙酯(2:1)，展开，晾干，置紫外灯(365mn)下检视。结果呈一个亮蓝色荧光斑点，Rf值为0.75。高效液相色谱检测色谱柱为Diamonsil(钻石)C18，5ym(250mmX4.6mm)(迪马公司)，流动相为甲醇-水-乙酸(75:24.8:0.2)，检测波长为326nm，流速为1.0ml/min，柱温为30.(TC,采集时间比保留时间延长3倍。结果表明，为一个主峰，所得的淡黄色油状物为单一成分，保留时间为9.447min。如图2所示，归一法计算藁本内酯的纯度99.63%。该化合物经ESI-MS图谱鉴定相对分子质量为190，与文献(《中药活性成分分析手册》常新全，丁丽霞.学苑出版社，2002:280)报道一致，该化合物为藁本内酯。MS图如图6所示。实施例4将当归与川芎的混合药材(0.25:1)粉末(50目)200g投入1L的萃取釜中，用超临界C02进行萃取。萃取釜温度46r，压力40MPa;分离釜I温度50°C,压力8MPa;分离釜II温度30°C,压力6MPa;C02流速为25L/h;萃取时间为3.0h，得到富含藁本内酯的提取物，藁本内酯的提取率为3.19%。将上述提取物上中压硅胶柱，在15。C低温与避光的条件下，用石油醚(306(TC)-乙醚(99:1)洗脱，250ml为1个流份收集，经TLC薄层色谱检查后，HPLC测定，合并纯的流份，25。C减压回收溶剂，用乙醚转移至小瓶中，挥干乙醚，冷冻干燥，得淡黄色油状物，密闭(《-20。C)保存。薄层色谱检测取藁本内酯溶于少量乙醚，点样于硅胶G薄层板上，展开剂为石油醚(6090°C)-乙酸乙酯(2:1)，展开，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。结果呈一个亮蓝色荧光斑点，Rf值为0.75。高效液相色谱检测色谱柱为Diamonsil(钻石)C18，5ym(250mmX4.6mm)(迪马公司)，流动相为甲醇-水-乙酸(75:24.8:0.2),检测波长为326nm，流速为1.0ml/min，柱温为30.(TC，采集时间比保留时间延长3倍。结果表明，为一个主峰，所得的淡黄色油状物为单--成分，保留时间为9.398min。如图3所示，归一法计算藁本内酯的纯度99.34%。实施例5将当归与川芎的混合药材(0.2:1)粉末(60目)200g投入lL的萃取釜中，用超临界C02进行萃取。萃取釜温度48"，压力35MPa;分离釜I温度50。C，压力8MPa;分离釜II温度30。C，压力6MPa;C(V流速为45L/h;萃取时间为2.5h，得到富含藁本内酯的提取物，藁本内酯的提取率为3.15%。将上述提取物上中压硅胶柱，在5t:低温与避光的条件下，用石油醚(3060。C)-乙醚(99:1)洗脱，250ml为1个流份收集，经TLC薄层色谱检查后，HPLC测定，合并纯的流份，28。C减压回收溶剂，用乙醚转移至小瓶中，挥干乙醚，冷冻干燥，得淡黄色油状物，密闭(《-20°C)保存。薄层色谱检测取藁本内酯溶于少量乙醚，点样于硅胶G薄层板上，展幵剂为石油醚(6090°C)-乙酸乙酯(2:1)，展开，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。结果呈一个亮蓝色荧光斑点，Rf值为0.75。高效液相色谱检测色谱柱为Diamonsil(钻石)C18，5um(250mmX4.6聽)(迪马公司)，流动相为甲醇-水-乙酸(75:24.8:0.2)，检测波长为326nm，流速为1.Oml/min，柱温为30.(TC，采集时间比保留时间延长3倍。结果表明，为一个主峰，所得的淡黄色油状物为单一成分，保留时间为9.398min。如图4所示，归一法计算藁本内酯的纯度99.34%。实施例6将当归与川芎的混合药材(0.5:1)粉末(30目)200g投入lL的萃取釜中，用超临界C02进行萃取。萃取釜温度55'C，压力25MPa;分离釜I温度50。C，压力8MPa;分离釜II温度30。C，压力6MPa;CO2流速为60L/h;萃取时间为1.8h，得到富含藁本内酯的提取物，藁本内酯的提取率为2.98%。将上述提取物上中压硅胶柱，在8"C低温与避光的条件下，用石油醚(3060。C)-乙醚(99:1)洗脱，250ml为1个流份收集，经TLC薄层色谱检査后，HPLC测定，合并纯的流份，26。C减压回收溶剂，用乙醚转移至小瓶中，挥干乙醚，冷冻干燥，得淡黄色油状物，密闭(《-20°C)保存。薄层色谱检测取藁本内酯溶于少量乙醚，点样于硅胶G薄层板上，展开剂为石油醚(6090°C)-乙酸乙酯(2:1)，展开，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。结果呈一个亮蓝色荧光斑点，Rf值为0.75。高效液相色谱检测色谱柱为Diamonsil(钻石)C18，5"m(250,X4.6mm)(迪马公司)，流动相为甲醇-水-乙酸(75:24.8:0.2)，检测波长为326nm，流速为1.Oml/min，柱温为30.(TC，采集时间比保留时间延长3倍。结果表明，为一个主峰，所得的淡黄色油状物为单--成分，保留时间为9.382min。如图5所示，归一法计算藁本内酯的纯度99.21%。实施例7将当归与川芎的混合药材(0.99:1)粉末(80目)100g投入1L的萃取釜中，用超临界C02进行萃取。萃取釜温度6(TC，压力20MPa;分离釜I温度50°C，压力8MPa;分离釜II温度30°C，压力6MPa;C(^流速为20L/h;萃取时间为1.5h，得到富含藁本内酯的提取物，藁本内酯的提取率为2.38%。将上述提取物上中压硅胶柱，在3'C低温与避光的条件下，用石油醚(306(TC)-乙醚(99:1)洗脱，250ml为1个流份收集，经TLC薄层色谱检查后，HPLC测定，合并纯的流份，24'C减压回收溶剂，用乙醚转移至小瓶中，挥干乙醚，冷冻干燥，得淡黄色油状物，密闭(《-20°C)保存。薄层色谱检测取薬本内酯溶于少量乙醚，点样于硅胶G薄层板上，展开剂为石油醚(6090°C)-乙酸乙酯(2:1)，展开，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。结果呈一个亮蓝色荧光斑点，Rf值为0.75。高效液相色谱检测色谱柱为Diamonsil(钻石)C18，5um(250mmX4.6mm)(迪马公司)，流动相为甲醇-水-乙酸(75:24.8:0.2)，检测波长为326nm,流速为1.0ml/min，柱温为30.(TC，采集时间比保留时间延长3倍。结果表明，为一个主峰，所得的淡黄色油状物为单一成分，保留时间为9.387min，归一法计算藁本内酯的纯度为99.33%。实施例8将当归与川芎的混合药材(1.01:1)粉末(70目)150g投入1L的萃取釜中，用超临界C02进行萃取。萃取釜温度52。C，压力2脂Pa;分离釜I温度5(TC，压力8MPa;分离釜II温度30°〔〕，压力6MPa;C0:!流速为35L/h;萃取时间为2.2h，得到富含薬本内酯的提取物，藁本内酯的提取率为2.37o/Q。将上述提取物上中压硅胶柱，在3"C低温与避光的条件下，用石油醚(306(TC)-乙醚(99:1)洗脱，250ml为1个流份收集，经TLC薄层色谱检査后，HPLC测定，合并纯的流份，24"C减压回收溶剂，用乙醚转移至小瓶中，挥干乙醚，冷冻干燥，得淡黄色油状物，密闭(《-20°C)保存。薄层色谱检测取藁本内酯溶于少量乙醚，点样于硅胶G薄层板上，展开剂为石油醚(6090°C)-乙酸乙酯(2:1)，展开，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。结果呈一个亮蓝色荧光斑点，Rf值为0.75。高效液相色谱检测色谱柱为Diamonsil(钻石)C18，5um(250鹏X4.6腿)(迪马公司)，流动相为甲醇-水-乙酸(75:24.8:0.2)，检测波长为326nm，流速为1.0ml/min，柱温为30.0°C，采集时间比保留时间延长3倍。结果表明，为一个主峰，所得的淡黄色油状物为单一成分，保留时间为9.387min，归一法计算藁本内酯的纯度为99.33%。实施例9将当归与川芎的混合药材(2:1)粉末(40目)250g投入lL的萃取釜中，用超临界C02进行萃取。萃取釜温度58。C，压力32MPa;分离釜I温度50。C，压力8MPa;分离釜II温度3(TC，压力6MPa;C(V流速为32L/h;萃取时间为2.8h，得到富含藁本内酯的提取物，藁本内酯的提取率为2.52%。将上述提取物上中压硅胶柱，在or低温与避光的条件下，用石油醚(3060。C)-乙醚(99:1)洗脱，250ml为1个流份收集，经TLC薄层色谱检查后，HPLC测定，合并纯的流份，26i:减压回收溶剂，用乙醚转移至小瓶中，挥干乙醚，冷冻干燥，得淡黄色油状物，密闭(《-20。C)保存。薄层色谱检测取藁本内酯溶于少量乙醚，点样于硅胶G薄层板上，展开剂为石油醚(6090°C)-乙酸乙酯(2:1)，展开，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。结果呈一个亮蓝色荧光斑点，Rf值为0.75。高效液相色谱检测色谱柱为Diamonsil(钻石)C18，5um(250腿X4.6腿)(迪马公司)，流动相为甲醇-水-乙酸(75:24.8:0.2)，检测波长为326nm，流速为1.0ml/min，柱温为30.(TC，采集时间比保留时间延长3倍。结果表明，为一个主峰，所得的淡黄色油状物为单一成分，保留时间为9.378min，归一法计算藁本内酯的纯度为99.35%。权利要求1.一种制备藁本内酯的方法，包括一个从当归与川芎的粉末混合物中利用超临界CO2流体提取富含藁本内酯的提取物的过程，在该过程中，将所述的提取物经硅胶柱一次洗脱纯化，再冷冻干燥，直到获得的藁本内酯的纯度大于99％，其特征在于在进行超临界CO2流体提取的步骤中，当归和川芎的重量比例为当归的重量在小于1份且大于等于0.2份的重量单位之间，或者在大于1份且小于等于2份的所述的重量单位之间，川芎的重量为1份所述的重量单位，萃取温度在46～60℃之间、萃取压力在20～40MPa之间、CO2流速在20～60L/h之间、萃取时间在1.5～3.0h之间。2.如权利要求1所述的藁本内酯的制备方法，其特征在于在超临界C02流体提取步骤中，当归和川芎的重量比例为当归的重量在小于1份且大于等于0.2份的重量单位之间，川芎的重量为1份所述的重量单位，萃取温度在4855T:之间、萃取压力在2535MPa之间、C02流速在2545L/h之间、萃取时间在1.82.5h之间。3.如权利要求l所述的藁本内酯的制备方法，其特征在于在超临界C02流体提取步骤中，当归和川芎的重量比为0.33:1;萃取温度为5(TC、萃取压力为30MPa、C(V流速为30L/h、萃取时间为2.Oh。全文摘要本发明公开了一种藁本内酯的制备方法，包括如下步骤超临界流体萃取的步骤、柱层析纯化的步骤、冷冻干燥的步骤。本发明从当归与川芎的混合药材的粉末经超临界CO<sub>2</sub>流体提取富含藁本内酯的提取物；经硅胶柱纯化时，一次洗脱就可达到＞99％的纯度，而不需经反复多次洗脱或梯度洗脱；经冷冻干燥，得到纯度＞99％的藁本内酯。本发明采用超临界流体萃取技术、柱层析技术、冷冻干燥技术三种技术联用，保持在低温条件下，快速制备纯度＞99％的藁本内酯。文档编号C07D307/00GK101210003SQ20061014830公开日2008年7月2日申请日期2006年12月29日优先权日2006年12月29日发明者杨义芳,玫许申请人:上海医药工业研究院