包含磷酸化氨基酸、合成的磷酸化肽和胃石蛋白的稳定的无定形碳酸钙的制作方法

专利名称：包含磷酸化氨基酸、合成的磷酸化肽和胃石蛋白的稳定的无定形碳酸钙的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含无定形碳酸钙的组合物及其制备方法，本发明还涉及包含磷酸化 的氨基酸或肽的组合物。特别地，所述肽选自甲壳动物的蛋白质，包括GAP65、GAP22、GAP21 和GAP12。本发明还提供了包含无定形碳酸钙和磷酸化的氨基酸或肽的药物组合物和营养 组合物。
背景技术：
钙是信号转导的核心之一，而且是生物系统中重要的结构元素。从原生动物到脊 椎动物，沉积的钙盐帮助动物保持坚硬的身体形状，磷酸钙是脊椎动物的内骨骼的主要成 分，碳酸钙是无脊椎动物的外骨骼的主要成分。以碳酸钙无机物作为主要组成的钙化外骨 骼广泛分布于棘皮动物、软体动物和节肢动物，提供保护并用作钙储存。一些甲壳动物临时 储藏无定形形式的碳酸钙，这使得碳酸钙更易获得(特别是对于蜕皮后它们的新外骨骼结 构的矿化期间的快速移动来说)。无定形碳酸钙在例如螯虾的活体内的形成是相当引人兴 趣的，因为无定形矿物通常是热力学不稳定的。无定形碳酸钙(ACC)倾向于转变成其多晶 型物，主要是方解石和霰石。W02005/115414使用甲壳动物器官用于提供具有可易于为人类 消耗所利用的稳定ACC的组合物。考虑到钙的总体代谢重要性和生物力学重要性，并且因 为ACC作为饮食补充剂是碳酸钙的潜在的更可溶和更可吸收的形式，本发明的目的在于提 供制备无定形碳酸钙的新方法。本发明的另一目的在于提供包含稳定的ACC的药物组合物和营养组合物本发明的其它目的和优点将随着描述的进行而显现。发明概述本发明涉及一种包含无定形碳酸钙(ACC)和至少一种选自磷酸化氨基酸和磷酸 化肽的成分的组合物。所述磷酸化氨基酸和磷酸化肽可包含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸或 两者。所述磷酸化氨基酸和磷酸化肽能够稳定本发明组合物中的所述碳酸钙的无定形形 式。一方面，本发明的所述磷酸化肽可来自甲壳动物的胃石。在一实施方式中，本发明的 组合物包含ACC、至少一种磷酸化的氨基酸或肽、以及壳多糖(Chitin)或脱乙酰壳多糖 (chitosan)0另一方面，本发明涉及新的甲壳动物的肽和它们在影响碳酸钙晶态中的应用和 在制备制剂中的用途。本发明还涉及所述肽的功能性片段。所涉及分离出的蛋白质包括 GAP65、GAP22、GAP21和GAP12(GAP代表胃石蛋白)；本发明还提供了导出的所述新蛋白质的 氨基酸序列，其被标记为SEQ. ID. NO :1至SEQ. ID. NO :4。本发明提供分离的和纯化的甲壳 动物的肽，该肽基本上具有选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :9、SEQ I D NO :17、SEQ I DNO 24和它们的同源物的序列。本发明中，序列同源物是指具有任何插入、缺失和替换、但至少 保留序列的90%的肽。本发明还包括在其序列中包含子序列的分离的和纯化的肽，所述子 序列是上述甲壳动物GAP肽的片段，优选是至少10个氨基酸长的子序列。所述子序列可具 有例如选自以下序列的序列SEQ ID NO 2-8,SEQ ID N0:10_16和SEQ ID N0:18_23，或序列 SEQ ID NO =USEQ ID NO :9、SEQID NO 17 和 SEQ ID NO 24 的其它片段。本发明所提供 的组合物，其包含一种或多种如上定义的肽，或它们的衍生物或变异体或功能性片段或它 们的混合物，以及无定形碳酸钙(ACC)。所述肽能够稳定所述组合物中所述碳酸钙的无定形 形式。本文中所用的术语“功能上等同的片段、衍生物或变异体”包括具有不影响抑制碳酸 钙结晶能力之修饰的肽。本发明致力于具有选自SEQ ID NO =USEQ ID NO :9、SEQ ID N0:17 禾口 SEQ ID NO: 24的氨基酸序列的肽、以及其具有优选至少90%同源性(相同度)的序列同源物的肽。编 码本发明的肽的DNA序列也是本发明的一部分。本发明提供含有如上定义的肽及其衍生物 的碳酸钙制剂。在本发明的优选实施方式中，提供了 一种包含ACC的碳酸钙制剂，所述制剂保持 稳定至少一个月。本发明公开了一种制备稳定的无定形碳酸钙的方法，其包含以任何顺序 在水相中混合含钙的可溶盐、碳酸盐来源物和磷酸化氨基酸或磷酸化肽。所述碳酸盐来源 物可例如包含溶解在液相中的碳酸盐，或所述碳酸盐来源物可包含气态二氧化碳。本发明提供包含上述组合物的药物制剂，其含有一种或多种如本文所定义的磷酸 化氨基酸或磷酸化肽、或它们的衍生物或变异体或功能片段或它们的混合物、以及ACC。在 本发明的其它方面，上述组合物被有利地用作营养制剂，例如用作食品添加剂。所述药物制 剂优选是口服的，并且可包含填料或溶剂或添加剂。所述药物制剂优选被用于治疗选自如 下一组的病症疼痛、增生性疾病、神经错乱、免疫紊乱、心血管疾病、肺部疾病、营养失调、 生殖疾病、肌肉骨骼疾病和牙齿问题的病症。所述的治疗可导致致病因素的消失或导致症 状的减轻。所述增生性疾病可为例如乳腺癌或支气管癌。所的述治疗可包含减慢或抑制肿 瘤中的细胞增殖。对于所述疼痛，它可为术后疼痛、损伤疼痛、癌症相关疼痛和神经性疼痛。 所提及的神经错乱可选自例如脱髓鞘病、痴呆和运动障碍疾病。所述的病症可为选自多发 性硬化症、阿耳茨海默症和帕金森症的退行性疾病。所述的病症还可包括骨病或骨髓病，可 为例如骨折或骨质疏松症。所述的病症也可为神经退行性疾病。在本发明的一个方面，所述的新肽GAP65、GAP22、GAP21和GAP12或它们的衍生物 被用在药物的制造中。本发明还提供治疗骨病或损伤的方法，以及处理疼痛的方法，包括口 服包含碳酸钙和一种或多种所述新肽或其衍生物的制剂。本发明中术语“衍生物”也包括 通过烷基化、酯化、中和、环化或低聚获得的肽产物。本发明提供了抑制碳酸钙在包含碳酸盐和钙盐的混合物中发生结晶的方法，其包 括向所述混合物中混入磷酸化氨基酸或磷酸化肽。所述磷酸化氨基酸或磷酸化肽优选包 含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。在一实施方式中，本发明提供了一种抑制碳酸钙的结晶的方 法，包括向结晶混合物或沉淀混合物中混合入具有选自SEQ ID NO=USEQ ID NO :9、SEQ ID N0:17和SEQ ID NO :24的序列的肽，或该肽的同源物或功能性片段或衍生物或变异体或它 们的混合物。本发明提供了一种抑制本发明的碳酸钙的结晶的方法，包括提供可溶于水的 钙盐，和将所述盐与选自GAP65、GAP22、GAP21和GAP12的肽接触，或与该肽的功能上等同的 片段、衍生物或变异体接触，或与它们的混合物接触。又一方面，本发明还提供了食品添加剂或功能食品，其包含碳酸钙与磷酸化的氨 基酸或肽的混合物；在一实施方式中，所述肽具有选自SEQ IDNO :1、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 24和这些序列的同源物或片段的序列。


本发明的上述以及其它特征和优点将随以下实施例和附图而更清楚图1显示了胃石可溶蛋白质的分离、GAP65的纯化和局部测序；图IA-胃石的可溶 性蛋白质表达谱的SDS-PAGE考马斯染色，与分子量参照蛋白质(左)比较，以考马斯、“全 染色剂”和“过碘酸-雪夫”(右)染色的包含由DEAE柱色谱纯化的GAP65的部分17的 SDS-PAGE ；图IB-通过在胰蛋白酶消化后的纳米喷雾Qtof 2而获得的GAP65的色谱图，来自 明显的峰的肽的序列通过MS/MS分析获得。图2包括GAP65的完整的推导氨基酸序列和它的生物信息学分析；图2A-GAP65的 开放阅读框的推导氨基酸序列，粗体为预测的信号序列，灰色方框是可能的磷酸化位点，在 氨基酸序号72和173处的黑色方框是预测的O-糖基化位点，浅色方框是预测的N-糖基化 位点；图2B-显示预测的结构域的GAP65序列的示意图ChtBD2是壳多糖结合域2，LDLa是 A类低密度脂蛋白受体结构域，且最后一个是多糖脱乙酰酶结构域；图2C-基于与脂蛋白受 体的同源性的LDLa结构域的3D结构，左方是来自低密度脂蛋白受体相关蛋白的补体样重 复CR3的NMR结构，右方是GAP65的LDLa结构域的预测结构；图3显示GAP65的特异性表达及其在诱导的蜕皮前期期间在胃石的柱状上皮细胞 中的定位；图3A-使用RT-PCR在蜕皮前期期间的GAP65表达的检测，RNA取样自胃石上皮 盘(印ithelial disc)、肝胰腺、表皮下组织、输精管和胃壁，延伸因子2(Eft2)被用来保证 RNA提取，并控制基因组污染；图3B-通过在诱导的蜕皮前期和未经改变的蜕皮中期雄性中 的原位杂交的GAP65表达的定位，左边组代表苏木精和曙红染色(H&E)，中间组代表阴性对 照正义GAP65探针，两个右边组代表GAP65反义探针，最后一组为特异区域的放大，线条表 示200 μ m，但对于诱导的蜕皮前期正义探针，线条表示100 μ m ；图4显示GAP65沉默后在胃石盘中的GAP65的相对转录水平(标示为GASP 65)， 以及在注射有(从左至右)蜕皮激素和GAP65的dsRNA、蜕皮激素和dsRNA载体、蜕皮激素 和红螯螯虾的卵黄蛋白原(CqVg)的dsRNA、蜕皮激素载体和dsRNA载体的螯虾的胃石盘中 使用实时RT-PCR进行的GAP65转录水平的相对定量，字母表示统计显著性；图5是显示在GAP65沉默后胃石的形态学畸形的图片，代表性的胃石被从注射有 蜕皮激素和GAP65的dsRNA (左)、蜕皮激素和dsRNA载体(中)、蜕皮激素载体和dsRNA载 体(右)的螯虾切割出来；图5A-从螯虾切割出的整个胃石的侧视图；图5B和5C-在切割 前上述胃石的X射线图像(背视图)；图6显示在GAP65基因沉默之后胃石结构畸形的扫描电子显微镜(SEM)显微照 片；代表性的胃石是从注射有蜕皮激素+GAP65dsRNA(左)和蜕皮激素+dsRNA载体(右) 的螯虾中切割出来的；图6A和6B-胃石的中心部分的截面图，展示矿物和基质排布(分别 为X50，X200)；图6C-包含纳米球的矿物排布(X15000)；无GAP的蜕皮激素显示出正常 的胃石外观，而蜕皮激素+GAP65dsRNA处理的胃石显得畸形；图7显示在存在/缺失胃石纯化蛋白质的情况下体外沉淀的碳酸钙的SEM图像； 图7A-使用GAP65富集的片段沉淀的碳酸钙(左)、以作为对照的等量的胰蛋白酶沉淀的碳 酸钙(右)；图7B-沉淀后40天的ACC的SEM图像，展示出具有50-500nm的纳米球的典型 无定形结构；
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图8显示通过以GAP65富集的片段沉淀而获得的ACC的拉曼光谱；图8A-通过以 GAP65富集的片段沉淀而获得的碳酸钙的拉曼光谱；图8B-沉淀后27天；图8C-沉淀后6. 5 个月；图9是6. 5个月的ACC (由GAP65诱导)和方解石的拉曼光谱的比较(在1085峰 周围)；图10显示胃石蛋白质的局部测序，所呈现的是通过在胰蛋白酶消化后纳米喷雾 Qtof2而获得的色谱图，来自明显峰的肽的序列通过MS/MS分析获得；图IOA显示GAP22 ；图 IOB 显示 GAP21 ；图 IOC 显示 GAP12 ；图11显示在存在胃石提取物的情况下从氯化钙和碳酸钠的溶液中沉淀出的碳酸 钙的拉曼光谱；图12是表1，显示GAP蛋白质的氨基酸组成；图13显示GAP22cDNA的核苷酸序列和相应的在开放阅读框中的推导氨基酸序列； 星号表示终止密码子，灰色突出显示的序列是未翻译区；N末端的推定的信号肽以下划线 表不；图14显示GAP21cDNA的核苷酸序列和相应的在开放阅读框中的推导氨基酸序列； 各标记具有与图13中的相同的含义；图15涉及GAP序列；图15A显示GAP12cDNA的核苷酸序列和相应的在开放阅读框 中的推导氨基酸序列；各标记具有与图13中的相同的含义；图15B是GAP12和GAP21的序 列比对，两种蛋白质的氨基酸位置被显示在右侧和左侧，序列统一性以“*”表示，保守替换 以“”表示，半保守替换以“.”表示；图16至图27显示实施例9至20中详细描述的拉曼光谱；并且图28至图32显示分别根据实施例9、10和18_20制备的样品的拉曼光谱，这些样 品，如所描述的，在沉淀后在室温下保存。发明的详细描述现已发现，一些磷酸化氨基酸或肽影响体外碳酸钙的沉淀，导致形成碳酸钙的无 定形形式。特别地，当所述肽包含几种存在于红螯螯虾的蜕皮前期的后期的胃石中的蛋白 质时，已观察到这种影响。表观分子量为约65kDa、22kDa、21kDa和12kDa的肽诱导无定形 碳酸钙材料的纳米球的沉淀；作为对比，惰性蛋白质提供CaCO3晶体。纳米颗粒显示通常是 无定形CaCO3的拉曼位移。上述蛋白质(根据通过SDS-PAGE估算出的它们的表观分子量分别被标记为 GAP65、GAP22、GAP21、GAP12)与ACC的沉淀和稳定化有关。含有所述四种蛋白质的胃石提 取物抑制碳酸钙结晶并稳定碳酸钙的无定形形式(ACC)。ACC是在CaCO3W沉淀中利用拉 曼光谱测定法检测的，所述沉淀是由含有CaCl2、Na2CO3和胃石提取物的溶液中制备的(图 11)。ACC的存在通过在约lOSOcnT1处的主峰的存在得到验证。GAP基因的表达对于胃石上 皮盘和表皮下组织(两者均为表皮相关组织)是特异性的。也通过RT-PCR研究了 GAP肽 在几种目标组织中的特异性表达。例如，在更多的表皮相关组织中发现了 GAP65的表达，但 GAP22的表达被发现在胃石表皮盘中进行。获得了相应基因的cDNA序列，并且发现了它们的推导蛋白质(图2、13_15)。所 有四种蛋白质都在它们的N末端具有信号肽(图13-15中的带下划线的氨基酸，图2中的
7粗体)。在保守结构域的数据库中的相似性检索显示，GAP65含有三个保守结构域壳多糖 结合结构域2、A类低密度脂蛋白受体结构域和多糖脱乙酰酶结构域。另一方面，GAP12、 GAP21和GAP22没有显示出于任何已知结构域的显著相似性。GAP 12和GAP 21的Bl as t 比对显示出这些蛋白质的推导氨基酸序列的46. 3%同一性(图15)。推导的蛋白质的物理 化学分析显示，GAP12、GAP21和GAP65的计算的分子量小于预期的分子量，分别为9. 9kDa、 19. 5kDa和60. 8kDa,而GAP22的计算的分子量高于预期，为28. 6kDa (表1)。GAP12、GAP21 和GAP65具有酸性pl，因此它们在胃石的生理pH时(接近pH 8.5)是带负电荷的。GAP12 和GAP21具有高百分率的非极性脂族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸)和高百分率的极 性但无电荷的氨基酸脯氨酸(在表1中以灰色突出显示)。GAP65具有高含量的酸性氨基 酸。GAP22具有碱性pl，因此它在胃石的生理pH时是带正电荷的。它的主要特征是具有高 百分率的极性但无电荷的氨基酸脯氨酸和高百分率的带正电荷的精氨酸。由于新的蛋白质的特别特性，本发明还提供一种抑制碳酸钙结晶的方法，包括向 结晶混合物或沉淀混合物中混入特定量的GAP65或其功能片段，或其衍生物或变异体。在 本发明的其它方面，提供一种抑制碳酸钙结晶的方法，其包括将可溶于水的钙盐与GAP65 或其功能片段、衍生物或变异体接触。GAP65是通过离子交换色谱从胃石可溶性蛋白质提取物中纯化的，并被确定为带 负电荷的糖肽，含有约12mol % Asp+Glu (基于SEQ. ID. NO. 1)。通过MS-MS的肽的测序提供 了七种寡肽子序列(SEQ. ID. NO. 2-8 ；图IB)，这些子序列被用于简并引物的构建，用于基于 胃石表皮盘mRNA获得完整的GAP65编码基因序列。总的推导氨基酸序列显示出548个氨 基酸长的肽(SEQ. ID. NO. 1 ；图2A)。GAP65序列的生物信息学分析显示出存在三个已知结构 域(图2B)从氨基酸29至102的壳多糖结合结构域2 (ChtBD2)、从氨基酸122至159的A 类低密度脂蛋白受体结构域(LDLa)和从氨基酸195至332的多糖脱乙酰酶结构域。LDLa 结构域具有预测的钙结合性质。GAP65的表达通过RT-PCR在蜕皮前期螯虾的几个目标组 织中被测试，并在胃石表皮盘和表皮下组织中检测，这两者均为表皮相关组织(图3A)。原 位杂交显现了 GAP65表达在诱导的蜕皮前期和未经改变的蜕皮中期螯虾的胃石盘中的定 位(图5B)。利用实时RT-PCR测定利用GAP65dsRNA沉默后在胃石表皮盘中的相对GAP65 转录水平(图4)。GAP65在胃石形成中的作用通过RNAi技术、利用向蜕皮中期螯虾的体内 注射GAP65dsRNA而被测试(图5)。通过注射蜕皮激素来启动胃石形成。在注射有GAP65 dsRNA和蜕皮激素的螯虾中可观察查到胃石的形态学畸形(图5A显示切割出的胃石，图5B 和5C是X射线视图)。已发现，GAP65本质上影响螯虾胃石的微结构。从注射有GAP65dsRNA和蜕皮激素 的螯虾或仅注射蜕皮激素的螯虾中切割出的胃石的扫描电子显微镜(SEM)显微照片显示 出由于缺失GAP65而导致的严重的结构异常性(图6)。ACC在球粒中的包裹(packaging) 以及球粒尺寸对于胃石的密实包裹是重要的；与正常的胃石相比，GAP65的缺失导致产生 较大的球粒和较不紧密的结构。为了阐明GAP65在生物矿化过程中的作用，进行了体外碳酸钙沉淀以测试ACC的 稳定化。沉淀的电子显微镜图像清楚地显示在存在/缺失GAP65富集的片段的情况下沉淀 的碳酸钙的不同多晶型组成(图7)。在缺失GAP的情况下的碳酸钙的沉淀，即在存在惰性蛋 白质的情况下的沉淀，导致快速的结晶，提供大至IOym的方解石和/或球文石(vaterite)的晶体。另一方面，在存在GAP65的情况下的碳酸钙的沉淀导致形成无定形CaCO3,观察到 为由40-60nm球粒组成的薄层。在所述球粒中的碳酸钙的无定形性质通过拉曼光谱得到确证，拉曼光谱显示出在 1070CHT1处的独特的ACC峰，并且进一步通过使用粉末χ射线衍射(XRD)来确证，其显示出 来自结晶材料的衍射峰的缺失。GAP65在由体外沉淀形成的ACC球粒中的存在通过从球粒 中的蛋白质的纯化及其通过SDS-PGAE的鉴定而被确认。通过在存在GAP65的情况下沉淀而获得的CaCO3沉淀物最初通过偏振显微镜分析 其特征，鉴定方解石、球文石和ACC。观测结果通过拉曼光谱测定法和粉末XRD确认。ACC 占总CaCO3的约至少50%。ACC在室温条件下保持稳定至少1月。因此本发明提供与螯虾的钙代谢有关的新的蛋白质，其影响碳酸钙的晶态。所提 供的是一种抑制碳酸钙结晶的方法，包括向结晶或沉淀混合物中混入特定量的GAP蛋白质 或其功能上等同的片段或其衍生物或变异体。本发明涉及通过向沉淀混合物中(即，向出 现CaCO3的沉淀并且没有所述蛋白质将出现结晶材料的沉淀的混合物中)混入所述新的蛋 白质而制备ACC的方法。这种混合物的非限制性例子包括包含GAP65的氯化钙的水溶液， 所述水溶液加有碳酸钠溶液。当然，混合成分的顺序可被改变，离子来源物的类型也可被改 变。GAP65在混合物中的浓度可为例如基于CaCO3的总量为约0. 05至5wt%。GAP65在沉 淀混合物中的浓度可为例如约1至100μ g/ml。本发明提供含有ACC和磷酸化氨基酸或肽(例如GAP蛋白质)的组合物。在本 发明的重要的方面，提供一种用于治疗与钙代谢或信号传导有关的疾病的制剂，其包含ACC 和稳定化量的磷酸化氨基酸或肽(例如GAP蛋白质或其衍生物)。该制剂优选用于口服。 本发明的制剂被用作治疗手段，或用作治疗补充剂或用作营养补充剂。在本发明的优选实施方式中，根据本发明制备的ACC被包含在用于治疗与钙代谢 或钙信号传导有关的病症的制剂中。所述病症可选自疼痛、增生性疾病、神经学疾病、免疫 学疾病、心血管疾病、肺部疾病、营养失调、生殖疾病、肌肉骨骼疾病和牙齿问题的病症。所 述治疗可包括减轻疾病的症状。所述增生性疾病可选自肉瘤、癌或淋巴瘤和黑素瘤。所述 癌可为例如乳腺癌或支气管癌。所述治疗可收缩肿瘤、停止它们的生长，或减慢或抑制在肿 瘤中的细胞增殖。所述疼痛可选自术后疼痛、损伤后疼痛、癌症相关疼痛和神经性疼痛。所 述神经学疾病可选自脱髓鞘病、痴呆和运动障碍疾病；所述疾病可为例如多发性硬化症、阿 耳茨海默症、帕金森症或其它退行性疾病。所述可被治疗的病症可包括骨病或骨髓病，可为 例如骨折或骨质疏松症。在优选的实施方式中，本发明的组合物用于治疗神经退行性疾病。本发明涉及包含ACC和稳定化量的磷酸化氨基酸(PAA)或磷酸化肽(PP)的组合 物，例如包含一种或多种PAA，或一种或多种PP (例如GAP肽或它们的功能性片段、衍生物或 变异体)的组合物。本发明还涉及用PAA或PP (例如GAP)稳定的ACC，以用作药物或用于 药物的制造中，或用作食品添加剂。制备ACC的过程可包括以下步骤i)形成具有钙离子的水溶液(利用CaCl2溶液)。ii)添加可溶性或不可溶性“添加剂”(磷酸氨基酸、脱乙酰壳多糖、壳多糖、合成 肽、磷酸化肽/蛋白质或其片段，等等)。iii)添加碳酸根离子(例如用Na2CO3溶液或另外的碳酸盐来源物，像例如CO2或(NH4)2CO3) οiv)搅拌；ν) CaCO3淤浆的沉淀(通过离心、过滤等)。vi)淤浆脱水(通过冷冻干燥机、气流、喷雾干燥等)。产物的分析可包括通过各种方法(例如XRD、电子衍射、SEM)测试所产生的CaCO3 以证实其无定形性质。拉曼光谱测定法(RS)被发现是分析ACC特性的最有效和可靠的方 法。本文记载的矿物的拉曼位移特性是在lOSOcnT1处的碳酸盐峰，峰的主要形状(broad shape)表示ACC并与其含量成比例。在950CHT1处的磷酸盐峰与样品中的磷酸盐含量成比 例。而且，1080与950CHT1的比率是成比例的，但不直接显示C0327P043_比率。在溶液中的钙离子和碳酸根离子(碳酸钙由它们沉淀出来)通常在约IOmM至约 500mM的范围内。磷酸化氨基酸(PAA)与钙的摩尔比通常在0. 01至0. 5的范围内。更高浓 度的PAA抑制自发的沉淀。当存在时，脱乙酰壳多糖为0. 03至0. 3衬％的范围。通过不同蛋白水解酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶)从脱矿的红螯螯 虾胃石中提取出的肽诱导ACC的形成。磷酸氨基酸和磷酸肽已表明可诱导ACC形成且可使 其稳定。该未经改变的蛋白质可能具有额外的功能。拉曼光谱和EDS分析显示出通过总不 可溶性基质(I SM)诱导出的与ACC相似的大量的磷酸钙，表明ISM中的磷酸盐与蛋白质相 联合。所沉淀出的碳酸钙在长周期内检查其无定形状态/晶态。已发现的是，通过本发 明的方法获得的ACC样品在室温下保持稳定超过七个月，保持它们的无定形状态。
具体实施例方式实施例1按[W0 2005/115414]所描述的那样制备红螯螯虾的胃石。来自蜕皮前期的后期 的胃石的可溶性蛋白质的SDS-PAGE分离显示存在至少6个主要的不同蛋白质(图IA左 侧)，最丰富的蛋白质尺寸为约65kDa(胃石蛋白质65，GAP65)。使用DEAE色谱法HPLCjlJ 用最高为IM的NaCl梯度从整个胃石可溶性蛋白质含量中进一步纯化GAP65。GAP65洗脱在 300mMNaCl时开始，但主要在600mM(部分17)时持续。通过SDS-PAGE分析GAP65富集的部 分17，并且如图IA右侧所示，用考马斯(非特异性蛋白质染色)、“全染色剂”(带负电荷的 蛋白质染色)和“过碘酸-雪夫”(糖蛋白染色)进行染色。这些染色表明，GAP65在此富 集的部分是主要的蛋白质，并且它是带负电荷的糖蛋白。GAP65的胰蛋白酶消化、随后利用 纳米喷雾Qtof2分离并利用MS-MS进行肽的测序，产生了 7种预测的肽序列(图1B)，这些 序列被用来构建简并引物，用于基于胃石上皮盘mRNA获得完整的GAP65编码基因序列。图 2A展示了 GAP65开放阅读框的推导氨基酸序列，显示出蛋白质的N末端的预测的信号序列 (粗体显示)。约4.6%的GAP65的总氨基酸被预测为可能的磷酸化位点(灰色方框)，但 发现只有三个预测的N-糖基化位点(包括三个字母的浅色方框)和两个预测的0-糖基化 位点(在氨基酸72和173号处的黑色方框)。负电荷部分地来自于酸性残基天冬氨酸和谷 氨酸，它们站蛋白质的约12mol%。GAP65序列的生物信息学分析表明存在三种已知的结构 域(图2B)从氨基酸29至102的壳多糖结合结构域2 (ChtBD2)、从氨基酸122至159的A 类低密度脂蛋白受体结构域(LDLa)和从氨基酸195至332的多糖脱乙酰酶结构域。图2C显示出基于与来自低密度脂蛋白受体相关蛋白的补体样重复CR3的NMR结构的同源性而预 测的LDLa结构域的3D结构。实施例2通过RT-PCR测试GAP65在蜕皮前期的螯虾的几个目标组织中的特异表达(图 3A)。在胃石表皮盘和表皮下组织中检测GAP65的表达，两者均为表皮相关组织。未在肝胰 腺、胃壁和输精管中检测到GAP65的表达。通过原位杂交的、GAP65表达在诱导的蜕皮前期 和未经改变的蜕皮中期的螯虾中的胃石盘中的定位被呈现在图3B中。左边组代表胃石盘 的苏木精和曙红染色，中间组是对照正义探针，其为检测到表达。右边两组表示反义探针， 最后一组是特定区域的放大。反义探针显示GAP65的表达仅可在诱导的螯虾的胃石盘的柱 状上皮细胞中检测到，而在未经改变的蜕皮中期螯虾中，未检测到该表达。实施例3利用实时RT-PCR测定利用GAP65dsRNA沉默后在胃石上皮盘中的相对GAP65转录 水平，并呈现在图4中。评价在注射有蜕皮激素和GAP65dsRNA、蜕皮激素和dsRNA载体、蜕皮 激素和红螯螯虾卵黄蛋白原(CaVg) dsRNA的螯虾中和在注射有两种载体的对照中的GAP65 水平。CqVg是一种主要在生殖雌性中发现的肝胰腺特异性基因，其用作序列特异性沉默的 对照。注射有蜕皮激素和GAP65dsRNA的螯虾的转录水平显著低于注射有蜕皮激素和dsRNA 载体的螯虾中的转录水平。在注射有蜕皮激素和CqVgdsRNA的螯虾中，GAP65转录是水平 类似于在注射有蜕皮激素和dsRNA载体的组中检测到的水平。在对照中，载体注射的螯虾 GAP65转录水平高于在蜕皮激素和GAP65dsRNA注射的螯虾中检测到的水平，但低于在注射 有蜕皮激素和dsRNA的螯虾和注射有蜕皮激素CqVg dsRNA的螯虾中检测到的水平。但在 对照中，载体组与三个其它组没有统计学上的显著区别。实施例4为了测试GAP65在胃石形成中的作用，使用了利用向蜕皮中期螯虾体内注射 GAP65dsRNA的RNAi技术。通过注射蜕皮激素启动胃石形成。在图5中可看见注射了蜕皮 激素+GAP65dsRNA、蜕皮激素+dsRNA载体、或蜕皮激素载体和dsRNA载体的螯虾的胃石。图 5A是切割自每个处理组的代表性胃石的侧视图。从该图像中，胃石的形态学畸形可在注射有 GAP65dsRNA和蜕皮激素的螯虾中观察到，而在仅注射有蜕皮激素和dsRNA载体的螯虾中，胃 石显得正常且没有畸形。在载体注射的对照中，胃石显得未形成或处于初始生长阶段。图5B 图示螯虾和切割前的胃石的X射线背视图，而图5C呈现B组图像的更加强的反差图像。在注 射有GAP65dsRNA和蜕皮激素的螯虾中，存在这样的一些区域，其中矿物的较不密实检测被重 新编码(recode)而胃石盘形结构被保留。在蜕皮激素+dsRNA载体注射的螯虾中，胃石显得 正常且对矿物密度没有影响。对照载体胃石太小而不能被X射线成像检测到。实施例5切割自注射有GAP65dsRNA和蜕皮激素的螯虾以及仅注射有蜕皮激素和dsRNA载 体的螯虾的胃石的扫描电子显微镜(SEM)图像被呈现在图6中。图6A-6B图示了穿过胃石 的中心部分的横截面的图像。在注射有GAP65dsRNA和蜕皮激素的螯虾的胃石中，当与仅 注射有蜕皮激素和dsRNA载体的螯虾的胃石相比，观察到了严重的结构异常。在蜕皮激素 和载体注射的螯虾的胃石中观察到的紧密矿物层状结构被在蜕皮激素和GAP65 dsRNA注射 的螯虾的胃石中的松散结块的柱状矿化结构所代替，该矿化结构类似于中空稻草。在球粒中的ACC的包裹以及球粒尺寸对于胃石的紧密包裹是重要的。比较两种处理的球粒尺寸的 15000倍放大被呈现在图6C中。在注射有蜕皮激素和GAP65 dsRNA的螯虾的较不紧密排布 的胃石中，球粒尺寸为约100至300nm，而在注射有蜕皮激素和dsRNA载体的螯虾的胃石中 沉积的正常ACC中，球粒具有较窄的尺寸分布，约为40至60nm。实施例6为了阐明GAP65在生物矿化过程中的作用，建立起测试ACC的稳定化的体外碳酸 钙沉淀实验。图7代表在存在GAP65和存在其它蛋白质(胰蛋白酶)的情况下的碳酸钙 的沉淀结果。图7A中的SEM图像显示在每个处理中的碳酸钙的不同的多晶型物。在存在 GAP65的情况下的碳酸钙的沉淀导致无定形形式(ACC)的沉积，被观察到为由100至500nm 球粒组成的薄层。在相同条件下进行的但在存在胰蛋白酶的情况下的沉淀实验导致快速的 结晶，观察到大至IOym的方解石和球文石球粒的单个晶体。图7B确认了在存在GAP65的 情况下沉淀的碳酸钙中的ACC的性质。拉曼分析显示ACC的独特光谱，在lOTOcnr1处具有 清晰的宽峰。在由体外沉淀形成的ACC球粒中的GAP65的存在通过从沉淀物的矿物部分的 蛋白质的纯化及其通过与原始GAP65富集部分对照的SDS-PAGE的鉴定来确认。实施例7利用GAP65沉淀的ACC的稳定性通过在室温下保持的样品的拉曼光谱测定法来测 试。添加100 μ 1的IM CaCl2至IOml双蒸水中(终浓度10mM)。添加80 μ 1的蛋白质提 取溶液(1. 2 μ g/ μ 1)(终浓度约10 μ g/ml)。在剧烈摇晃后，添加100 μ 1的IM Na2CO3 (终 浓度10mM)。小瓶被以4000rpm离心5分钟，沉淀物被涂在载玻片上，并立刻用气流吹干。 CaCO3沉积物的特性最初通过偏振显微镜被分析为是方解石、球文石和ACC的混合物。该 观察结果通过拉曼光谱测定法确认。ACC是薄“硬皮”的形式，估计其占总CaCO3的约至少 50%。如在沉淀后1天、沉淀后27天和沉淀后6. 5个月ACC的拉曼光谱所显示的(图8A、 8B、8C)，ACC在室温下保持稳定至少1个月。6. 5个月的ACC的拉曼光谱(在1085峰周围) 与方解石的比较(图9)显示混合物表面上看来包含ACC和球文石(当考虑1085峰上的肩 部可能是辨别球文石的峰分裂的开始时)。实施例8胃石提取物抑制碳酸钙结晶并稳定碳酸钙的无定形形式(ACC)。通过拉曼光谱测 定法在由含有CaCl2、Na2C03和胃石提取物的溶液制备的CaCO3沉淀中检测ACC (图11)。ACC 的存在通过在约lOSOcnT1处存在主要的宽峰而被证实。在560处的峰是由玻璃基材引起的。 GAP基因的表达被发现对于胃石上皮盘和表皮下组织(两者均为表皮相关组织)是特异性 的。类似于实施例2中所描述的，GAP21、GAP22和GAP65在几种目标组织中的特异性表达 通过RT-PCR被检查。GAP21和GAP65表达在两个表皮相关组织中都被发现。GAP22表达仅 在胃石上皮盘中被发现。获得了相应基因的cDNA序列并发现了它们的推导蛋白质(图13 至15)。所有四种蛋白质被发现在它们的N末端含有信号肽(图13-15中的带下划线的氨 基酸和图12中的粗体)。在保守结构域的数据库中的相似性检索显示，GAP65含有三个保 守结构域壳多糖结合结构域2、A类低密度脂蛋白受体结构域和多糖脱乙酰酶结构域。另 一方面，GAP12、GAP21和GAP22没有显示出与任何已知结构域的显著相似性。GAP 12和GAP21的Blast比对显示，这些蛋白质的推导氨基酸序列具有46. 3%同 一性(图 15B)。
12
推导蛋白质的物理化学分析显示，GAP12、GAP 21和GAP 65的计算的分子量小于 预期，分别为9. 9、19. 5和60. 8kDa,而GAP22的计算的分子量高于预期，为28. 6kDa (表1， 图12)。GAP12、GAP21和GAP65具有酸性pl，因此他们在胃石的生理pH时(接近pH 8. 5) 带负电荷。GAP12和GAP21具有高百分率的非极性脂族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸) 和高百分率的极性但无带和的氨基酸脯氨酸(在表1中以灰色突出显示)。GAP65具有高 含量的酸性氨基酸，但不具有其它可区别的特征。GAP22具有碱性pl，因此它在胃石的生理 PH时带正电荷。它的主要特征是高百分率的极性但无电荷的氨基酸脯氨酸和高百分率的带 正电荷的精氨酸。根据生物信息学分析，GAP12和GAP21显示出和已知与甲壳动物中钙沉 淀相关的其它蛋白质在氨基酸组成方面的一些相似性。实施例9将100μ 1的IM CaCl2添加至IOml双蒸水(DDW)中，获得IOmM的终浓度。将200 μ 1 的P-丝氨酸(P-Ser)溶液(IOOmM)添加至溶液中，获得2mM的P-Ser。在剧烈摇晃后加入 100 μ 1的IM Na2CO3 (终浓度IOmM)。在室温下，将小瓶在4000rpm离心5分钟。除去上层 溶液，将沉淀涂在载玻片上并立即用气流吹干。RS显示出ACC(图16)。将样品在室温下保 存，并在沉淀后5个月测试ACC稳定性(图28)实施例10将100 μ 1 的 IM CaCl2 添加至 IOml DDff 中(终浓度10mM)。将 100 μ 1 的 P-苏 氨酸(P-Thr)溶液(IOOmM)添加至溶液中，获得ImM的P-Thr。在剧烈摇晃后加入100 μ 1 的IM Na2CO3 (终浓度IOmM)。在室温下，将小瓶在4000rpm离心5分钟。除去上层溶液，将 沉淀涂在载玻片上并立即用气流吹干。RS显示出ACC(图17)。将样品在室温下保存，并在 沉淀后4. 5个月测试ACC稳定性(图29)。实施例11将100 μ 1 的 IM CaCl2 添加至 IOml DDff 中(终浓度10mM)。将 200 μ 1 的 P-丝 氨酸溶液(IOOmM)添加至溶液中。在剧烈摇晃后加入100 μ 1的IM Na2CO3 (终浓度10mM)。 在室温下，将小瓶在4000rpm离心5分钟。除去上层溶液，将沉淀在液氮中冷冻并在冷冻干 燥机中冻干。RS显示出ACC(图18)。实施例12改变实施例11中描述的条件将CaCl2和Na2CO3的终浓度由IOmM改为100mM。RS 显示出ACC(图19)。实施例13改变实施例10中描述的条件将脱水方法由流动空气改为冻干。RS显示出 ACC (图 20)。实施例14包含20mM CaCl2,20mM Na2CO3^2mM P-Ser的系统，在钙添加至0. 3wt %的终浓度 后，向沉淀溶液中加入脱乙酰壳多糖(3wt%溶解在0. 2M乙酸中)。RS显示出ACC(图21)。实施例I5改变实施例14中描述的条件使用0. 5M CaCl2、0. 5M Na2CO3和3mMP_Ser。该组合 物代表浓度上限。RS显示出ACC (图22)。实施例I6
胃石被从内分泌地(endocrinologically)诱导的蜕皮前期螯虾中切割、称重、以 蒸馏水漂洗和保存在-20°C。在刮去胃石的外层以除去任何材料的外部材料后，利用液氮 冷冻胃石，并利用研钵和杵研磨成粉末。通过将每克胃石粉末在放置于冰上的PH 7.0的 20ml的0. 02M乙酸铵、0. 5MEGTA中搅拌而脱矿。当CaCO3完全溶解，离心悬浮液(2000rpm、 15-20分钟、4°C )并收集上清液。残留的不可溶性基质(I SM)被用做添加剂加至钙化溶液 中(步骤ii)。将200 μ 1的I SM(估计约30 μ g蛋白质)添加至IOml的包含IOmM CaCl2 和IOmM Na2CO3的结晶混合物中，随后进行气流脱水。RS显示出ACC(图23)。实施例17 改变实施例16所述的条件将CaCl2的终浓度由IOmM改为20mM，将I SM的体积 改为100 μ 1 (约15 μ g蛋白质)，同时通过冷冻干燥脱水。RS显示出ACC(图24)。实施例18使用各种蛋白水解酶处理ISM以从壳多糖不可溶相中释放壳多糖结合蛋白(氢键 键合或共价键合)，并证实所产生的肽在ACC诱导和稳定方面的活性(图25)。将28ml的乙酸铵(2mM)添加至7ml的ISM。将IOml的该溶液与IOml的在乙酸铵 (2mM)中的胰蛋白酶(3.8mg/ml)混合。具有蛋白水解酶的I SM悬浮液在漩涡(vortexed) 条件下在4°C温育2小时。温育后，将小瓶以4000rpm离心5分钟。除去含有ISM消化的蛋 白质的上清液；将Iml的上清液(等于100 μ 1的不可溶基质，并且等于约150 μ g蛋白质) 添加至IOml的CaCl2(IOmM)中。在剧烈摇晃后添加100 μ 1的IM Na2CO3 (终浓度=IOmM)。 在室温下，将小瓶以4000rpm离心5分钟，将沉淀涂在载玻片上并立即用气流吹干。RS显示 出ACC(图25)。将样品在室温下保存，并在沉淀后7个月测试ACC稳定性(图30)。实施例19将28ml的乙酸铵(2mM)添加至7ml的ISM。将IOml的该溶液与IOml的在乙酸 铵(2mM)中的来自灰色链霉菌的蛋白酶(Sigma P6911,0. 6mg/ml)混合。具有蛋白水解酶 的ISM悬浮液在漩涡条件下在4°C温育2小时。温育后，将小瓶以4000rpm离心5分钟。除 去含有ISM消化的蛋白质的上清液；将Iml的上清液添加至IOml的CaCl2(IOmM)中。在剧 烈摇晃后添加100 μ 1的IM Na2CO3 (终浓度10mM)。在室温下，将小瓶以4000rpm离心5分 钟，将沉淀涂在载玻片上并立即用气流吹干。RS显示出ACC峰(在1080处)，以及额外的 次峰，该次峰可能是由磷酸钙引起的(在950处的峰)(图26)。将样品在室温下保存，并在 沉淀后7个月测试ACC稳定性(图31)。实施例20将28ml的乙酸铵(2mM)添加至7ml的I SM。将IOml的该溶液与IOml的在乙酸 铵(2mM)中的木瓜蛋白酶(0.26mg/ml)混合。具有蛋白水解酶的ISM悬浮液在漩涡条件下 在4°C温育2小时。温育后，将小瓶以4000rpm离心5分钟。除去现含有ISM消化的蛋白质 的上清液；将Iml的上清液添加至IOml的CaCl2(IOmM)中。在剧烈摇晃后添加100 μ 1的 IM Na2CO3 (终浓度10mM)。将小瓶以4000rpm离心5分钟，将沉淀涂在载玻片上并立即用 气流吹干。RS显示出ACC，并且可能显示出磷酸钙(图27)。将样品在室温下保存，并在沉 淀后7个月测试ACC稳定性(图32)。虽然本发明已就一些特定实施例进行了描述，但可能存在许多改进和改变。因此， 可以理解，在所附权利要求的范围内，本发明可以不同于所特定描述的方式来实现。
权利要求
一种组合物，其包含无定形碳酸钙(ACC)和至少一种选自磷酸化氨基酸和磷酸化肽的成分。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的磷酸化氨基酸和磷酸化肽包含磷酸丝氨 酸或磷酸苏氨酸或两者。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的磷酸化氨基酸和磷酸化肽稳定所述碳酸 钙的无定形形式。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的磷酸化肽来自甲壳动物的胃石。
5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述的磷酸化肽是甲壳动物的肽，该甲壳动物的 肽具有选自于如下一组的序列:SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :9、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 24 和它们的同源物。
6.一种分离和纯化的甲壳动物的肽，其具有选自于SEQ ID NO=USEQ ID NO :9、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 24和它们的同源物的序列。
7.一种分离和纯化的肽，该肽在其序列中包含如权利要求6所述的甲壳动物的肽的片 段，所述片段包括至少十个氨基酸。
8.一种肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO :1或与该序列的相同度至少为90%的同源序列。
9.一种肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO :9或与该序列的相同度至少为90%的同源序列。
10.一种肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO :17或与该序列的相同度至少为90%的同源 序列。
11.一种肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO :24或与该序列的相同度至少为90%的同源 序列。
12.—种编码如权利要求7所述的肽的DNA序列。
13.如权利要求1所述的组合物，其包含如权利要求7所述的肽或其功能性片段、衍生 物或变异体。
14.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含壳多糖或脱乙酰壳多糖。
15.一种碳酸钙制剂，其含有磷酸化氨基酸或磷酸化肽。
16.如权利要求15所述的碳酸钙制剂，其包含ACC。
17.如权利要求16所述的碳酸钙制剂，其能保持稳定至少一个月。
18.一种制备稳定的无定形碳酸钙的方法，其包括在水相中以任何顺序混合包含钙的 可溶性盐、碳酸盐来源物、磷酸化氨基酸或磷酸化肽。
19.一种药物制剂，其包含如权利要求1所述的组合物。
20.如权利要求19所述的药物制剂，其任选地包含用于口服的填料。
21.一种营养制剂，其包含如权利要求1所述的组合物。
22.如权利要求19所述的药物制剂，其用于治疗选自于如下一组的病症疼痛、增生性 疾病、神经错乱、免疫紊乱、心血管疾病、肺部疾病、营养失调、生殖疾病、肌肉骨骼疾病和牙 齿问题。
23.如权利要求22所述的药物制剂，其中，所述的治疗包括减轻所述病症的症状。
24.如权利要求22所述的药物制剂，其中，所述的增生性疾病是乳腺癌或支气管癌。
25.如权利要求22所述的药物制剂，其中，所述的治疗包括减慢或抑制肿瘤中的细胞增生。
26.如权利要求22所述的药物制剂，其中，所述的疼痛选自于术后疼痛、损伤后疼痛、 癌症相关疼痛和神经性疼痛。
27.如权利要求22所述的药物制剂，其中，所述的神经错乱选自于脱髓鞘病、痴呆和运 动障碍疾病。
28.如权利要求22所述的药物制剂，其中，所述的病症为选自于多发性硬化症、阿耳茨 海默症和帕金森症的退行性疾病。
29.如权利要求22所述的药物制剂，其中，所述的病症包括骨病或骨髓病。
30.如权利要求29的药物制剂，其中，所述的病症包括骨折或骨质疏松症。
31.如权利要求22所述的药物制剂，其中，所述的病症是神经退行性疾病。
32.如权利要求6或7所述的肽在药品制造中的用途。
33.一种处理疼痛的方法，其包括口服包含碳酸钙和如权利要求7所述的肽的制剂。
34.一种治疗骨病或骨损伤的方法，其包括口服包含碳酸钙和如权利要求7所述的肽 的制剂。
35.一种抑制碳酸钙在包含碳酸盐和钙盐的混合物中发生结晶的方法，该方法包括向 所述混合物中混入磷酸化氨基酸或磷酸化肽。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述的磷酸化氨基酸或磷酸化肽包含磷酸丝氨 酸或磷酸苏氨酸。
37.一种抑制碳酸钙的结晶的方法，该方法包括提供可溶于水的钙盐，并将所述盐与选 自于GAP65、GAP22、GAP21和GAP12的肽或与这些肽功能上等同的片段、衍生物或变异体或 它们的混合物相接触。
38.一种食品添加剂或功能食品，其包含碳酸钙和肽的混合物，所述的肽具有选自于 SEQ ID NO =USEQ ID NO :9、SEQ ID NO 17, SEQ ID NO :24 和其同源物或片段的序列。
全文摘要
本发明提供了一种包含无定形碳酸钙(ACC)和稳定所述碳酸钙的无定形形式的磷酸化氨基酸和磷酸化肽至少之一的组合物。特别地，该肽可选自甲壳动物的蛋白质，所述蛋白质也由本发明提供，即GAP65、GAP22、GAP21和GAP12。本发明的组合物可用在药物制剂和营养制剂中。
文档编号C07K14/435GK101969962SQ200880113395
公开日2011年2月9日 申请日期2008年10月22日 优先权日2007年10月22日
发明者舒缪·本托夫, 阿米尔·伯曼, 阿米尔·萨希, 阿萨夫·瑟尔特 申请人:艾玛菲克有限公司