专利名称：烟草所含的二氢查耳酮类化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于烟草化学领域，更具体地说，本发明涉及一种新的烟草所含的
二氳查耳酮类化合物及其制备方法，同时，还涉及其在抗氧化和抗HIV-1中的应用。
背景技术：
烟草是人类所认识的各种植物中含化学物质最多的一种.经过几十年的研 究.人们目前从烟草中鉴定出来的单体化学物质就超过3000多种，而且还有许 多成分尚未鉴定出来。烟草除主要用于巻烟生产外，还可从中提取多种有利用 价值的化学成分，因此除作为巻烟消费外，加强烟草及其废弃物的综合利用具 有重要意义。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物。根据其 结构特点，可将黄酮类化合物分类为黄酮、黄酮醇、黄烷醇、二氢黄酮、二氢 黄酮醇、花色素、查尔酮、双黄酮等。黄酮与多糖、生物碱同为植物来源的三 大天然产品，大量的实验研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗菌 消炎、降血糖、抗病毒、抗肿瘤和护胃保肝等功能。本发明从烟草中分离得到 了一种具有抗养化和抗HIV-1活性的新的二氢查耳酮类化合物，该化合物至今 尚未见到相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的二氢查耳酮类化合物。 本发明的另 一个目的是提供一种所述化合物的制备方法。 本发明进一步的目的是提供所述化合物在在抗氧化和抗HIV-1中的应用。 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
A.本发明从烟草中分离出一种新的二氢查耳酮类化合物，该化合物具有下
述结构式
该化合物的命名为烟草酮A (Tobenone A)。
B. 本发明提供了一种所述化合物的制备方法，该方法采用以下步骤
(1)烟草样品粉碎后以70%的丙酮分3次用超声提取，合并提取液；(2)减压 浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物；(3)滤液用乙酸乙酯分3次萃取， 获得乙酸乙酯部分萃取液；(4)将萃取液浓缩成浸膏，浸膏用硅胶柱层析初 分，然后采用高效液相半制备色谱进一步分离，即得到所需的该新化合物。
C. 本发明对所述的新化合物进行了抗氧化活性检测和抗HIV-l效果试验， 化合物显示出良好的抗氧化活性和抗HIV-l效果。
图1为化合物的高分辨质谱(HRESIMS); 图2为化合物的核磁共振氢谱(^腿R); 图3为化合物的核磁共振炭镨(13C丽R); 图4为化合物主要丽BC相关(—)。
具体实施例方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1一一化合物的制备
烟草样品采于云南玉溪，品种为K326。将烟草样品取样2. 5 kg粉碎到30 目，以70%的丙酮用超声提取3次，提取液合并，过滤，减压浓缩提取液至小 体积，静置后滤除沉淀物，滤液用乙酸乙酯分3次萃取，合并乙酸乙酯萃取液 并浓缩成浸膏，得浸膏58.4 g。浸膏用适量氯仿溶解后用80 g粗硅胶(80 -100目)拌样，1. 5 kg硅胶(160 - 200目)装柱进行硅胶柱层析，氯仿丙 酮(l: 0 — 0: l)梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到8个部分(纯 氯仿、氯仿-丙酮20:1、氯仿-丙酮9:1、氯仿-丙酮8:2、氯仿-丙酮3:2、 氯仿-丙酮1:1、氯仿-丙酮1:2、纯丙酮)，其中氯仿-丙酮(l: l)洗脱部分 4.18 g用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以45%的曱醇为流动相， Zorbax SB-C18 (9.4 x 250 mm, 5 —半制备柱为固定相，紫外检测器检测 波长为254 nm,每次进样50 pL，收集15. 7 min的色语峰，多次累加后蒸 干，再次用纯甲醇溶解，再以曱醇为流动相，用Sephadex LH-20凝胶柱层析 分离，可得该新化合物。
实施例2
——化合物的鉴定
本专利化合物为淡黄色粉末；紫外光谱(溶剂为曱醇)，lx (log 入 (log ￡ ) 285 (4.08)， 234 (4.41), 210 (4.62) nm;红外光谱(溴化钾压片) iz固3547， 3502, 2897, 2871， 1748， 1672， 1648, 1615, 1430, 1386， 1128， 1052, 918 cm-1; HRES腦(图-1)给出准分子离子峰m/z 387.1052 [M+Na]T (计算值387. 1056)。结合^和13 C丽R谱给出一个分子式C18H2。08，不饱和度 为9。从4和"C丽R谱(图-2和图-3,数据归属见表-l)信号可以看出从^ 和"C丽R谱可以看到化合物中有2个苯环(包括4个双键次曱基碳，5C 106.4、 117.2、 106.0、 106.0);此外还有1个羰基(5c 198.0)， 1个次曱基 (5C 56.9)， 1个氧化的亚'曱基(5C 66.1)， 3个曱氧基(5C 55.2， 55.8, 55.8)，由此可推测该化合物为二氢查耳酮类化合物。在炭谱中一个苯环只有4个炭信号(包括1个双4建次甲基碳和3个季炭信号，其中次甲基双键炭和1 个季碳信的信号明显比其它炭信号强)，氩镨中只有1组未裂分的单峰(从峰 面积看是2个氢)；由此可推测该化合物的一个苯环为对称取代，经HMBC相关 (图-4)证实即C-8、 C-3， 、 C-5，为曱氧基取代，C-5、 C-7、 C-4，为羟基； 至此本专利化合物的结构得以确定。
表-l化合物的和13C NMR数据No.5c (mult.)& (mult, /, Hz)
la IP66. 1 t4.85, dd， 7=10.8, 8. 6 4.18， dd, 7=10.8, 6. 0
256.9 d5.15-5.19， m
3198. 0 s
4123.8 s
5151.6s
6106.4 d6.26, s
7150.6 s
8144.5 s
9117.2 d7. 03, s
r130. 7 s
2，106. 0 d6.07， s
3，153. 1 s
4，135.7 s
5，153.1 s
6，106.0 d6.07, s
0Me-855. 2 q3. 74, s
OMe-3，55. 8 q3. 78， s
OMe-4'55.9 q3. 75， s
实施例3
——化合物抗氧化活性4企测
抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50 pg/mL为初筛浓 度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜 配制的DPPH乙醇溶液(6. 5 xlO 5 mol/L) 190 (iL/孔，加入;f寺测样品10 pL/ 孔，空白孔加10 |iL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置 30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为 517 nm;样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算 DPPH清除率(W = (A空白-A样品)/ A空自xlO(WA空白空白对照組吸光度值；A料加样品组吸光度值。 样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为6.22 |_ig/L,表 明化合物具有良好的抗氧化活性。 实施例4
——对本发明化合物的抗HIV活性检测
(1) HIV-1感染性滴定按Johnson & Byington所述方法改良进行滴 定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID5Q (50% Tissue Culture Infection Dose)。
(2) 样品对C8166宿主细胞的细胞毒性检4 x io5/rai C8166细胞悬液 100 ul与待测化合物溶液混合，设三个重复孔。同时设置不含化合物的对照 孔，温度37°C, 5% C02培养三天，采用MTT比色法;f企测细胞毒性。ELx800 ELISA仪测定0D值，测定波长为595咖，参考波长为630 mn。计算得到CC5。 值(50% Cytotoxic Concentration),即对50%的正常T淋巴细胞系C8166 产生毒性时的化合物浓度。
(3) 样品对HIV-lmB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制试验将8x lOVmL C8166细胞50 )aL/孔接种到含有100 ja L/孔倍比稀释化合物的96孔细 胞培养板上，然后加入50 juL的HIV-l訓稀释上清(M.O. I. 0.0016)。设三个 重复孔。同时设置不含化合物的正常细胞对照孔。37°C, 5% C02培养三天，倒 置显微镜下(100x)计数合胞体的形成。EC5。(50% Effective Concentration) 为抑制合胞体形成50 %时的化合物浓度。
(4) 样品对HIV感染细胞的保护作用试验将8 x loVml MT由胞50ul/孔 接种到含有100 jul/孔倍比稀释化合物的96孔细胞培养板上，培养板的一半 孔加入50 ju 1的HIV-lmB稀释(M. 0, I. 0. 006)，另一半孔加入50(al培养基。 每个浓度梯度2个重复孔，同时设置不含化合物的对照孔和空白对照孔， 37。C、 5% C02培养，第三天每孔补加100 jil新鲜培养基，第五天或第六天采 用MTT比色法检测细胞存活率。ELxSOO ELISA仪测定0D值，测定波长为
7595nm,参考波长为630 ntn。用公式计算出化合物对正常细胞的毒性和对HIV-
l!m感染细胞的保护作用。
(5)计算公式根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed&Muench法计 算出化合物抑制病毒的50%有效浓度(EC5。) ， 50%抑制细胞生长浓度 (CCs。)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeutic index)为TI -
CC50/EC
细胞生长存活率(%)=实验孔OD值/对照孔0D值x 100
细胞生长抑制率(W =(卜实验孔OD值/对照孔OD值)xlOO
HIV-1致细胞病变的抑制率(%) = (l-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)xlOO
感染细胞的保护率(％) - (实验孔OD值-阳性对照孔OD值)/ (阴性对照孔OD值-阳性对照孔OD
值)xioo
(6)实验结果实验结果清楚地表明，该化合物显示出一定的抗HIV-1活 性，其治疗指数为85. 6,揭示了本发明的化合物在制备抗爱滋病的药物中有 良好的应用前景。
以上所述仅为本发明的4支佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。
权利要求
1.一种具有下述结构式的化合物
2. —种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，该方法采用以下 步骤(1)烟草样品粉碎后以70%的丙酮分3次用超声^是取，合并提取液；(2)减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物；(3)滤液用乙酸乙酯分 3次萃取，获得乙酸乙酯部分萃取液；(4)将萃取液浓缩成浸膏，浸膏用硅 胶柱层析初分，然后采用高效液相半制备色谱进一步分离，即得到所需的化合 物。
3. 权利要求1所述的化合物作为抗氧化剂的应用。
4. 权利要求1所述的化合物在制备用于抗HIV-1药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种烟草所含的新二氢查耳酮类化合物(I)及其制备方法和应用。系将烟草样品粉碎后以70％的丙酮分3次用超声提取，合并提取液，过滤，减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物，滤液用乙酸乙酯分3次萃取，获得乙酸乙酯部分萃取液；将萃取液浓缩成浸膏，浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用高效液相半制备色谱进一步分离，即得到所需新化合物。对该化合物进行了抗抗氧化活性和抗HIV-1活性筛选，实验结果显示化合物显示出较强的抗氧化和抗HIV-1活性。
文档编号C07C49/84GK101648857SQ200910094910
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月1日 优先权日2009年9月1日
发明者何顺琴, 曹靖丽, 忠 李, 杨光宇, 薛景娇, 陈永宽 申请人:云南烟草科学研究院