专利名称：一种小桐子毒蛋白的连续化提取方法
技术领域：
本发明属于毒蛋白提取技术领域，具体涉及一种以小桐子为原料连续 化提取毒蛋白的方法。
背景技术：
小桐子(/a"op^ c"rc^L.),又名麻疯树、黄肿树、假花生、芙蓉 树、亮桐、南洋油桐，属大戟科0^/^o/"6/"eae)麻疯树属植物，主要分布 于热带和亚热带地区如云南、贵州、四川、广西、广东等。小桐子核糖体 失活蛋白(Curcin)是小桐子种仁中一种毒蛋白，又称小桐子毒蛋白9小桐 子壽蛋白在生物农药、医药方面具有广阔的应用前景，目前已受到广泛关 注。因此，小桐子毒蛋白的提取纯化具有重要意义。如何提高小桐子毒蛋 白提取率及纯度，并用于大规模生产之中，是国内外专家正在进行的一项 重要研究。
目前提取纯化小桐子毒蛋白的方法主要有①葡聚糖凝胶柱层析纯化 法黄德如等采用磷酸盐缓冲液提取，硫酸铵盐析及葡聚糖凝胶G-100柱层 析后得小桐子毒蛋白。②聚氨酯功能泡沬塑料粉末柱层析纯化法梁渠等釆 用丙酮脱脂，磷酸盐缓冲液提取，功能泡塑填料柱层析后得到小桐子毒蛋 白.③专利CN 1714863A公开了 一种麻疯树毒蛋白提取方法及其用途，釆用
匀浆、搅拌、透析、凝胶柱层析得到毒蛋白。但上述方法均存在毒蛋白提 取率不高，柱层析只能得到少量毒蛋白等问题，无法满足大规模工业生产
的需要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种提取时间短、效率高、可大规模连续化生产小桐子毒蛋白的提取工艺。 本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种小桐子毒蛋白的连续化提取工艺，其特征在于小桐子种仁经粉 碎、超声提取、离心分离脱脂、等电点沉淀、膜分离纯化、再次等电点沉 淀和再次膜分离纯化后得到高纯度毒蛋白溶液。
具体包括以下步骤
1、 粉碎小桐子种子经粗破后，将种仁粉碎至粒度200 ~ 1000目；
2、 超声提取将粉碎好的种仁粉末与浓度O. 1 lmol/L的磷酸盐缓冲 液以体积比1:5 ~ 1:20均匀混合后超声提取，超声频率20 - 80 KHz,超声 时间20~60 min，搅拌速率0 ~ 500rpm;
3、 离心分离脱脂将提取液输送到离心机，离心速率1000 ~ 4000rpm， 离心10~30 min,将油脂层转入油脂贮存罐，分离上清液和沉淀物；
4、 等电点沉淀上清液中加入浓度0. l~lmol/L的磷酸盐缓冲液，调 节上清液pH值为7. 0~9. 0,沉降10~2化，膜分离脱盐，得粗蛋白浓缩液；
5、 膜分离纯化先釆用截流分子量4万的生物膜除去4万以上的大分子
蛋白，再使用截流分子量l万的生物膜除去l万以下的蛋白质，超滤压力差 0. 2~0. 6MPa,料液浓度2~8%,得浓缩液；
6、 所得浓缩液再重复步骤(4)和(5),经等电点沉淀和膜分离纯化
后得到高纯度毒蛋白溶液。
步骤(3)中，离心分离得到的沉淀物再次进行超声提取和离心分离脱
脂，所得到的上清液和沉淀物分别与第一次分离得到的上清液和沉淀物合
并；
所述的离心分离得到的沉淀物以丙酮为溶剂，经超声波提取得到小桐 子油。
提取了.小桐子油后的沉淀物残渣作为动物伺料或肥料。 本发明相对于现有技术具有如下优点
i.超声波提取小桐子毒蛋白，提取时间短，能耗低，提取效率高；2. 膜分离脱盐浓缩效率高，可显著降低成本；
3. 等电点盐析和膜分离纯化相结合，提取的毒蛋白纯度高；
4. 该方法可工业化连续生产。
附图为本发明小桐子毒蛋白提取工艺的流程示意图。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但它们不是对本发明 的限定。 实施例l
将小桐子种子粗破后，由进料装置输送至粉碎机粉碎。粉碎粒度200 目；将粉碎后的种仁粉末与浓度0. lmol/L的磷酸盐缓冲液以体积比1:5均 勾混合后超声提取，超声频率20KHz,超声波功率9. 6KW,超声时间20min， 搅拌速率400rpm。提取液经泵输送到离心机，离心速率2000rpm,离心10 min。将油脂层转入油脂贮存罐，分离出上清液和沉淀物。沉淀物再与磷酸 盐缓冲液以体积比1:5均匀混合后超声提取，超声频率20 KHz,超声波功 率9.6KW,超声时间20min,搅拌速率400rpm。提取液经泵输送到离心机， 离心速率2000rpm,离心10min。将油脂层转入油脂贮存罐，分离出上清液。 合并两次离心分离得到的上清夜，在上清液中加入浓度0. lmol/L的磷酸盐 缓冲液，pH 7. O,沉降10h,膜分离脱盐，得粗蛋白浓缩液。先釆用截流分 子量4万的生物膜除去4万以上的大分子蛋白，再使用截流分子量1万的 生物膜除去1万以下的蛋白质，超滤压力差0.2MPa,料液浓度3%,得浓 缩液。在所得浓缩液中加入浓度0. lmol/L的磷酸盐缓冲液，pH值7. O,沉 降10h，膜分离脱盐。先釆用截流分子量4万的生物膜除去4万以上的大分 子蛋白，再使用截流分子量1万的生物膜除去1万以下的蛋白质，超滤压 力差0.2MPa,料液浓度3%,即得到高纯度小桐子毒蛋白溶液。将小桐子种子粗破后，由进料装置输送至粉碎机粉碎。粉碎粒度400 目；将粉碎后的种仁粉末与浓度0. 3mol/L的磷酸盐缓冲液以体积比1: 10均 匀混合后超声提取。超声频率80KHz,超声波功率14. 4KW，超声时间40min， 搅拌速率500rpm。提取液经泵输送到离心机，离心速率4000rpm,离心20 分钟。将油脂层转入油脂贮存罐，分离出上清液和沉淀物。沉淀物重复上 述超声提取和离心分离步骤，合并上清液。在上清液中加入浓度0. 3mol/L 的磷酸盐缓冲液，PH 7.5，沉降16h,膜分离脱盐，得粗蛋白浓缩液。先采 用截流分子量4万的生物膜除去4万以上的大分子蛋白，再使用1万的生 物膜除去l万以下蛋白质，超滤压力差O. 4MPa,料液浓度4%,得浓缩液。 所得浓缩液经再次等电点沉淀和膜分离纯化得高纯度毒蛋白溶液。
实施例3
将小桐子种子粗破后，由进料装置输送至主机粉碎。粉碎粒度300目； 将粉碎后的种仁粉末与浓度0. 5mol/L的磷酸盐缓冲液以体积比1:12均勻 混合后经超声提取。超声频率20KHz,超声波功率9. 6KW，超声时间50min, 搅拌速率200rpm;提取液经泵输送到离心机，离心速率1000rpm，离心30分 钟，将油脂层转入油脂贮存罐，分离出上清液和沉淀。沉淀重复超声提取 和离心分离步骤，合并上清夜；上清液中加入浓度0. 5mol/L的磷酸盐缓冲 液，pH7.2，沉降18h,膜分离脱盐，得粗蛋白浓缩液；先釆用截流分子量4 万的生物膜除去4万以上的大分子蛋白，再使用1万的生物膜除去1万以 下蛋白质，超滤压力差0. 3MPa，料液浓度5%,得浓缩液。所得浓缩液经 再次等电点沉淀和膜分离纯化得高纯度毒蛋白溶液。
实施例4
将小桐子种子粗破后，由进料装置输送至主机粉碎。粉碎粒度600目； 将粉碎后的种仁粉末与浓度lmol/L的磷酸盐缓冲液以体积比1:16均匀混 合后经超声撻取。超声频率80 KHz,超声波功率14. 4KW，超声时间30min, 搅拌速率30rpm;提取液经泵输送到离心机，离心速率3000rpm，离心15分
6钟，将油脂层转入油脂贮存罐，分离出上清液和沉淀。沉淀重复超声提取
和离心分离步骤，合并上清夜；上清液中加入浓度lmol/L的磷酸盐缓冲液， pH8. 0,沉降2011,膜分离脱盐，得粗蛋白浓缩液；先釆用截流分子量4万的 生物膜除去4万以上的大分子蛋白，再使用1万的生物膜除去l万以下蛋 白质，超滤压力差0MMPa，料液浓度7%,得浓缩液。所得浓缩液经再次 等电点沉淀和膜分离纯化得高纯度毒蛋白溶液。 实施例5
重复实施例l,有以下不同点离心分离后的沉淀物再以丙酮为溶剂， 以超声波提取小桐子油，提取率35%~40%。 实施例6
重复实施例5,有以下不同点进一步地，将提取了小桐子油后的沉淀 物残渣作为动物饲料或肥料。
权利要求
1、一种小桐子毒蛋白的连续化提取方法，其特征在于小桐子种仁经粉碎、超声提取、离心分离脱脂、等电点沉淀、膜分离纯化、再次等电点沉淀和再次膜分离纯化后得到高纯度毒蛋白溶液。
2、 根据权利要求l所述的小桐子毒蛋白连续化提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤(1) 粉碎小桐子种子经粗破后，将种仁粉碎至粒度200 ~ 1000目；(2) 超声提取将粉碎好的种仁粉末与浓度0. 1 lraol/L的磷酸盐缓冲液以体积比1:5-1: 20均匀混合后超声提取，超声频率20 - 80 KHz，超声时间20~60 min,搅拌速率0 ~ 500rpra;(3) 离心分离脱脂将提取液输送到离心机，离心速率1000 4000rpm,离心10~30 min，将油脂层转入油脂贮存罐，分离上清液和沉淀物；(4) 等电点沉淀上清液中加入浓度0. 1^1mol/L的磷酸盐缓冲液，调节上清液pH值为7. 0~9. 0，沉降10 24h,膜分离脱盐，得粗蛋白浓缩液；(5 )膜分离纯化先釆用截流分子量4万的生物膜除去4万以上的大分子蛋白，再使用截流分子量l万的生物膜除去l万以下的蛋白质，超滤压力差 MPa,料液浓度2~8%,得浓缩液；(6)所得浓缩液再重复步骤(4)和(5)，经等电点沉淀和膜分离纯化后得到高纯度毒蛋白溶液。
3、 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤(3)中，离心分离得到的沉淀物再次进行超声提取和离心分离脱脂，所得到的上清液和沉淀物分别与第一次分离得到的上清液和沉淀物合并。
4、 根据权利要求2或3所述的提取方法，其特征在于所述的沉淀物以丙酮为溶剂，经超声波提取得到小桐子油。
全文摘要
本发明公开了一种小桐子毒蛋白的连续化提取方法。小桐子种仁经粉碎、超声提取、离心分离脱脂、等电点沉淀、膜分离纯化、再次等电点沉淀和再次膜分离纯化后得到高纯度毒蛋白溶液。该方法实现了小桐子毒蛋白的工业化连续生产。运用超声波技术提取小桐子毒蛋白，提取时间短，能耗低，提取效率高。膜分离脱盐浓缩效率高，可显著降低成本。等电点盐析和膜分离纯化相结合，提取的毒蛋白纯度高。具有良好的市场应用前景。
文档编号C07K1/36GK101463073SQ20091009401
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月8日 优先权日2009年1月8日
发明者刘云虎, 张绍志, 真 方, 杨成源, 欣 邓 申请人:中国科学院西双版纳热带植物园