专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒m蛋白ctl细胞表位及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞表位的识别和鉴定，尤其涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋 白CTL细胞表位的识别和鉴定，本发明还涉及表达M蛋白的WR株牛痘病毒的重组病毒，属 于猪繁殖与呼吸综合征的防制领域。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的猪的一种高度传染病，又称"猪蓝耳病"。本病以妊娠母猪的繁殖障 碍(后期流产、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病(间质性肺 炎)为特征。1987年在美国中西部首先发现该病，1991年7月由荷兰中央兽医研究所首次 分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，并命名为Lelystadvirus (Lv)，其后在加拿大、 德、法、荷兰、英、西班牙、比利时、澳大利亚、日本、菲律宾等国家发生，曾被称为"猪神秘 病"(Swine mystery disease, SMD)、"猪蓝耳病"(Blue-ear disease)、猪不孕与呼吸综合 征(SIRS)。 1992国际兽疫局在国际专家研讨会上采用猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)这一名 称。同年，国际兽疫局(0IE)将该病列为B类传染病。20世纪90年代以来，PRRSV几乎已 传播到世界上所有养猪的国家，成为危害规模化养猪业的重要传染病，严重阻碍了世界养 猪业的发展。 我国于1996年首次分离到PRRSV，并将其命名为CH-la株，属于北美洲型。自分离 到首株PRRSV以来，该病已严重阻碍了我国养猪业的发展。尤其是2006年5月以来，在我 国南方由变异的高致病性PRRSV引发的以高热、高发病率和高死亡率为特征的猪传染病， 对我国养猪业特别是养猪业比较发达的省份造成了巨大的经济损失。目前虽有商品化的弱 毒疫苗和灭活苗被用于该病的防制。但由于PRRSV的变异与重组、病毒的ADE特性以及其 主要侵害免疫系统[而且还可以造成感染猪群的持续感染等因素，致使现有疫苗难以有效 控制该病的发生。对于病毒传染性疾病，只有在搞清楚其发病机制与免疫机制的基础上，才 能更加有效地开展预防与治疗研究工作。关于PRRS的免疫机制，目前尚缺乏系统的了解。 很长时间以来，有不少学者认为体液免疫在防制PRRS方面发挥主要作用，这在一定程度上 促使了有关PRRS的体液免疫的研究，也为预防和控制该病的发生起到了积极的作用。而有 关该病细胞免疫方面的研究不过深入，这导致我们对PRRS的免疫机制缺乏全面了解。
对于大多数病毒性疾病，细胞免疫在清除病毒感染方面的作用不容忽视。细胞毒 性淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是机体有效控制各种病毒感染及抗肿瘤、抗移 植物的免疫细胞之一。在病毒感染时，MHC I类分子限制的抗原特异性CTL反应是清除病 毒、控制病毒复制和扩散的主要机制。对大多数病毒性疾病来说，体液免疫与细胞免疫在清 除病毒感染过程中是相辅相成不可或缺的。研究证实，PRRSV感染后可以诱发机体产生体液 免疫应答和细胞免疫应答，尤其是近来的研究表明，细胞免疫在清除机体PRRSV感染方面 可能起着更重要的作用，这为我们进一步开展研究PRRS的细胞免疫机制提供了理论依据。
M蛋白是PRRSV的膜基质蛋白，也是北美洲和欧洲株结构蛋白中最为保守的蛋白。 并且该蛋白具有较强的免疫原性，可诱导产生一定的中和抗体和特异性细胞免疫应答，而 且其与GP5蛋白诱导的免疫反应可能与感染猪清除体内PRRSV有关。张治涛等人研究表明， 重组腺病毒表达的M蛋白、GP5及其二者的融合蛋白对猪具有较强的免疫效力。这些资料 均表明，PRRSV M蛋白在PRRSV与机体相互作用的过程中扮演着十分重要的角色。
CTL细胞表位是指胞内抗原经抗原递呈细胞(APC)加工后与主要组织相容性复合 体(MHC)I类分子结合，并共同被特异性递呈给T细胞受体(TCR)从而引起CTL免疫应答的 短肽。确定CTL细胞表位对于研究病毒感染的细胞免疫机制、发病机制、免疫应答机制以及 研制多肽疫苗和基因疫苗等具有重要意义。
发明内容
本发明之一是提供一株重组牛痘病毒，该重组牛痘病毒含有PRRSV M基因；
本发明之二是识别和鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的CTL细胞表位；
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的 —株重组牛痘病毒，其微生物保藏号是CGMCC NO. 3206 ;分类命名为痘病毒；保 藏时间是2009年7月23日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
—种构建上述重组牛痘病毒的方法，包括以下步骤将猪繁殖与呼吸综合征病毒
M基因克隆到pSCll上得到重组牛痘病毒转移载体pSCll-PRRSV-M ;将WR株牛痘病毒液稀 释后接种于TK—143细胞，37t:感作1 2h ;将转移重组质粒pSCll-PRRSV-M在脂质体的介 导下转染到已感染病毒的单层TK—143细胞上；筛选，鉴定，得到重组病毒rWR-PRRSV-M。
在动物机体受到病毒感染时，由MHC I类分子限制的抗原特异性CTL反应是清除 病毒、控制病毒复制和扩散的主要机制[6]。 CTL表位一般是由8-11个氨基酸构成，其在CTL 免疫应答过程中扮演着十分重要的角色，其决定了 CTL特异性杀伤效应。因此，CTL表位的 鉴定具有重要意义。 本发明利用预测合成的短肽对免疫小鼠的脾淋巴细胞进行体外剌激，然后利用 细胞内胞内因子染色法(Intracellular cytokine staining, ICS)与酶联斑点免疫法 (Enzyme-link Immunospot Assay,ELISP0T)两种实验方法检测IFN-y分泌情况。结果表 明，小鼠脾淋巴细胞经PMA+Ionomycin组合物及K93FITSRCRL和F57GMTFVHF两条短肽剌激 后，可以检测到分泌IFN- y的CD3+CD8+T淋巴细胞，而经不相关肽和其它短肽剌激后没有检 测到分泌IFN-y的T淋巴细胞。这说明在阳性对照与阴性对照成立的条件下，K^FITSRCRL 和F57GMTFVHF两条短肽均能剌激记忆性CD3+CD8+T淋巴细胞，使其增值并分泌IFN- y ，因 此，可确认K93FITSRCRL和F57GYMTFVHF两条肽段即为PRRSV M蛋白针对BALB/c小鼠的CTL 表位。 考虑到鉴定CTL表位对实验动物模型及其生物安全级别均有较高的要求及实验 条件，本发明最终选用SPF级近交系BALB/c小鼠作为动物模型。由于PRRSV不感染小鼠， 本发明在构建DNA疫苗的同时又构建了表达PRRSV M蛋白的牛痘重组病毒。在此基础上采 用Priming-Boosting策略免疫小鼠，这样不仅增强了免疫效果，也为Priming-Boosting策 略的免疫效果提供了实验数据。鉴于单一的CTL表位预测方法的原理及侧重点不同，本发明利用SYFPEITHI、 BIMAS、 PREDBALB/e三种常用的生物信息学预测方法同时对PRRSV M蛋白 氨基酸序列进行预测，然后筛选并化学合成短肽，这样不仅提高了准确率，也节省了人力物 力。 目前用于鉴定CTL表位的实验方法有很多，主要包括51Cr释放法、荧光测定 法、有限稀释法(Limiting dilution analysis, LDA) 、 MHC 1/肽四聚体技术(MHC 1/ p印tidetetr咖er)、细胞内胞内因子染色法(Intracellular cytokine staining, ICS)、酶 联斑点免疫法(Enzyme-link Immunospot Assay, ELISP0T)。鉴定CTL表位的一个主要指 标就是分泌IFN- y的CD3+CD8+T淋巴细胞的数量，因此本发明将免疫鼠的脾淋巴细胞用短 肽进行体外剌激，然后利用PerCP标记的土拨鼠抗小鼠CD3e抗体、PE标记的大鼠抗小鼠 CD8a抗体及FITC标记的大鼠抗小鼠的IFN-y抗体进行三色荧光染色，具体原理是以总T 淋巴细胞(CD3+T淋巴细胞)设门，然后圈定CD3+CD8+T淋巴细胞，在此基础上直接检测分泌 IFN- y的CD8+T淋巴的数量，这样就能从单个CD8+T淋巴细胞水平上来反映细胞因子的分泌 情况，试验结果更加直接可靠。为验证试验结果的可靠性，本发明又进行了 ELISPOT实验。 对于本发明而言，该实验检测的是所有分泌IFN- y的T淋巴细胞，而ICS是检测特异性分 泌IFN-y的CD3+CD8+T淋巴细胞，将这两种方法结合在一起，这样通过两种实验结果的一致 性更能说明鉴定结果的可靠性。 腿C分子在小鼠上被称为H-2分子，因而H-2即代表了小鼠的腿C复合体，其基因 位于小鼠第17号染色体上。其中经典的H-2I类基因包括H-2K、 H-2D和H_2L三个亚类。 对BALB/c小鼠来说，编码H-2分子的等位基因为d，故BALB/c小鼠的H_2I类分子就包括 H-2Kd、H-2Dd和H-2Ld三个亚类。本发明鉴定出了两个CTL表位，其中K93FITSRCRL为H_2Kd 限制性的CTL表位，而F57GMTFVHF为H_2Dd限制性的CTL表位。即PRRSV M存在一个H_2Kd 限制性的CTL表位和一个H-2Dd限制性的CTL表位。 PRRSV给世界养猪业造成的危害越来越引起人们的重视，各国学者也纷纷在为有 效的预防控制该病而努力。全面了解PRRSV的免疫机制，尤其是对细胞免疫机制的认识是 有效防控该病的基础。本发明首次利用小鼠这一动物模型鉴定PRRSVCTL表位，将为进一步 阐明该病免疫机制奠定基础。
图1PRRSV M基因RT-PCR扩增结果；M :DL2000DNAmarker ;1 :PRRSV M基因的PCR 产物；2:阴性对照。 图2小鼠泛素基因RT-PCR扩增结果；M :DL2000DNA Marker ;1 :小鼠泛素基因PCR 产物；2:阴性对照。 图3PRRSV M蛋白的SDS-PAGE实验结果；M :蛋白分子量marker ;1 :纯化的重组 PRRSVM。 图4PRRSV-M蛋白的Western blot实验结果；M :预染色的蛋白分子量marke ;1 :重 组PRRSVM。 图5蛋白标准品BSA浓度标准曲线。 图6重组质粒pVAXl-M的Xba I酶切鉴定；M :DL15000DNA Marker ;2 :pVAXl-M/Xba I。
图7重组质粒pVAXl-U-M的BamHI和EcoR I酶切鉴定；1 :DL15000DNAMarke ; 3pVAXl-U-M/BamH I禾P EcoR。 图8pVAXl-M和pVAXl-U-M转染BHK-21细胞后IFA鉴定结果；A :pVAXl-M ;B : pVAXl-U-M ;C :pVAXl。 图9重组转移质粒pSCll-PRRSV-M的构建。 图lO重组转移质粒pSCll-PRRSV-M连接方向鉴定；M :DL2000DNA marker ;1，2，3 : 正向连接；3 :反向连接。 图11重组牛痘病毒rWR-PRRSV-M感染；TK—143细胞后出现蓝色蚀斑。 图12重组牛痘病毒rWR-PRRSV-M的基因组鉴定；M :DL2000DNA marker ; 1 ， 2 :
rWR-PRRSV-M的PCR产物；3 :WR株牛痘病毒。 图13rWR-PRRSV-M的Western blot结果；FM :预染色的蛋白分子量marke ; 1 : rWR-PRRSV-M ;2 :WR株牛痘病毒。 图14rWR-PRRSV-M感染BHK-21细胞后IFA鉴定结果；A :rWR-PRRSV-M ;B :WR株牛
痘病毒。 图15按照prime-boost策略免疫小鼠后，ELISA抗体水平检测结果。 图16剌激后小鼠脾淋巴细胞流式检测结果。 图17剌激后小鼠脾淋巴细胞流式检测数据统计结果。 图18酶联免疫斑点试验结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例
1材料与方法 1.1.1实验材料PRRSV CH-la株、PRRSV阳性血清、PRRSV阴性血清、抗PRRSVM蛋 白单抗由中国农科院哈尔滨兽医研究所猪病研究室惠赠；WR株牛痘病毒、重组转移质粒 pSCll、 BHK-21细胞、TK—143细胞及各种E. coli感受态细胞均由本所人畜共患病课题组步 志高研究员惠赠。 1. 1. 2主要试剂pVAXl质粒、Lipofectamine 2000Reagent购自Invitrogen公 司；pGEX-6p-l质粒购自Pharmacia公司。各种限制性内切酶、连接酶、反转录酶、Taq酶、 Pyrobest酶、pMD18_T Vector、 DNA Marker均购自TaKaRa公司；质粒小量抽提试剂盒、 胶回收小量试剂盒购自上海华舜生物试剂有限公司；RNeasy MiniKit、 QIAquick PCR Purification Kit、 EndoFree Plasmid Maxi Kit购自QIAGEN公司；蛋白Marker购自 Fermentas公司；EZ-S印111 Mouse IX Lymphocyte S印aratio騰di咖购自达科为生物技术 有限公司；BRADFORD法测定蛋白质浓度试剂盒购自上海碧云天生物试剂有限公司；FITC标 记的兔抗猪IgG抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶标记兔抗 猪IgG抗体、佛波醇酯(PMA)、娄诺霉素(Ionomycin)、布雷菲尔德菌素(Brefeldin A)、皂苷
6(saponin)购自SIGMA公司；胎牛血清购自GIBC0BRL公司；FACSCalibur流式细胞仪、FITC 标记的大鼠抗小鼠的IFN- y抗体；PE标记的大鼠抗小鼠CD8a抗体、PerCP标记的土拨鼠 抗小鼠CD3e抗体、ELISPOT Set、 AEC Substrate Set购自BD公司；HPLC纯化多肽(纯度 > 98% )由中科亚光生物科技有限公司合成；实验所使用的引物均由Invitrogen公司合 成；不相关肽为鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白T细胞表位肽N71—78(WRRQARYK)，由上海 吉尔生化有限公司合并由本实验室保存。 1. 1. 3实验动物SPF级BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，所有实 验小鼠均在SPF隔离器内饲养。
1. 2方法 1. 2. 1PRRSV M基因与小鼠Ub基因的克隆 用^6&37@11!11 Kit提取PRRSV CH_la株与小鼠脾脏的总RNA，用随机引物 进行逆转录反应后，进行PCR扩增，两目的片段的扩增条件均为95°C 5min;94°C 30s， 55°C 45s，72°C lmin，35个循环；72。C延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、胶回收后与 pMD18-TVector连接，连接产物转化至感受态细胞JM109。经质粒抽提、PCR鉴定正确后测 序，鉴定正确的重组质粒分别命名为pMD-M、 pMD-U。
1. 2. 2PRRSV-M蛋白的截短表达、纯化及Western blot分析 由于M蛋白在体外表达系统中难以表达，在设计引物(表l)PRRSV-M-JD-F、 PRRSV-M-JD-R时将氨基端疏水性较强氨基酸残基去掉。以重组质粒pMD-M为模板PCR扩增 截短后的M基因，扩增产物经纯化、酶切、胶回收后与经同样处理的pGEX-6P-l载体连接，连 接产物转化感受态细胞DH5a ，经质粒抽提、PCR、酶切鉴定正确后测序，鉴定正确的重组质 粒命名pGEX-M。将pGEX-M转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，IPTG (终浓度为0. 8mM)诱 导培养4 6h，收集菌体沉淀进行超声破碎。包涵体用含0. 6%十二烷基肌氨酸钠盐(SKL) 缓冲液进行缓慢溶解后，加入终浓度为0. 2%的PEG 4000与终浓度为1. 0mM氧化型谷胱甘 肽及还原型谷胱甘肽进行复性。然后利用GST纯化试剂盒进行纯化。将纯化后的蛋白进行 Westernblot与SDS-PAGE分析，以同样条件处理的pGEX-6P-l空载体为对照。
1. 2. 3PRRSV-M蛋白的浓度测定 将蛋白纯化后使用Bradford法测定蛋白浓度。即将蛋白标准样品(BSA)稀释至 终浓度为0. 5mg/mL ;然后将蛋白标准样品(BSA)按0 y L、 1 y L、2 y L、4 y L、8 y L、 12 y L、 16 ii L、20 y L分别加到96孔ELISA板中，同时加标准品稀释液补足到20 y L ;然后相应体积 的待测样品到96孔ELISA板中，同样加标准品稀释液补足到20 ii L ;各孔加入200 y L G250 染色液，室温静置3 5分钟；测定波长为595nm处的吸光值并使用Microsoft Office Excel (2003)绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测样品中的蛋白浓度。
1. 2. 4Ub基因与PRRSV M的融合 利用S0E技术将Ub基因与M基因进行融合，根据融合原理针对PRRSV-M设计上下 游弓I物PRRSV-M-Ub-F、 PRRSV-M-Ub-R (表1)。以上述构建好的重组质粒pMD-M与pMD-U 为模板进行PCR扩增，对PRRSV-M与Ub的扩增产物分别进行胶回收，以回收产物为模板，以 Ub基因的上游引物与PRRSV-M基因的下游引物进行PCR，反应条件为95°C 5min ;94°C 30s ; 63. 5°C 45s ;72°C lmin，35个循环；72。C延伸10min。融合产物经琼脂糖凝胶电泳、胶回收后 与pMD18-T Vector连接，连接产物转化至感受态细胞JM109。经质粒抽提、PCR鉴定正确后测序，鉴定正确的重组质粒命名为pMD-U-M。 1. 2. 5真核表达质粒pVAXl-M与pVAXl-U-M的构建 以重组质粒pMD-M、 pMD-U-M为模板，分别以引物(见表1)PRRSV_M_F、 PRRSV-M-R 与PRRSV-M-Ub-F、PRRSV-M-Ub-R亚克隆M基因与Ub_M融合基因，对其产物进行纯化、酶切、 胶回收后与经同样处理的pVAXl载体连接，连接产物转化感受态细胞DH5 a ，经质粒抽提， PCR、酶切鉴定正确后测序，鉴定正确的重组质粒分别命名为pVAXl-M、 pVAXl-U-M。
1. 2. 6表达产物的间接免疫荧光(IFA)实验 按照Lipofectamine 2000说明书进行操作，即在转染前一天将BHK-21细胞用无 抗生素的DMEM培养液以0. 5 2xl05Cel 1 s/孔接种24孔细胞培养板；24h后，将纯化的阳性 重组质粒pVAXl-M、 pVAXl-U-M与空质粒pVAXl在脂质体的介导下转染到长成80% 90% 的单层BHK-21细胞上(质粒转染量为0. 8 g) 。 48h后冷丙酮固定30min，PBST洗涤三次， 用含有1 % BSA的PBS封闭2h ;PBST洗涤三次，加入一抗(抗PRRSV阳性血清)，37。C作用 2h ;PBST洗涤三次，接着加入FITC标记的兔抗猪的二抗，37t:作用2h ;PBST洗涤三次，于荧 光显微镜下观察和拍照。 1. 2. 7重组牛痘病毒转移载体pSCll-PRRSV-M的构建 以上述构建好的重组质粒pMD-M为模板，以引物pSCll-M-F、 pSCll-M-R(表1) 进行PCR，反应条件为95 °C 5min ;94 °C 30s ;60。C 45s ;72 °C lmin，35个循环；72。C延伸 10min。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、酶切、胶回收后与经同样处理的重组转移质粒pSC11 连接，连接产物转化至感受态细胞JM109。质粒抽提后，进行目的片段的连接方向鉴定， 即使用引物P7. 5-F与pSCll-M-R进行PCR，反应条件为95°C 5min ;94°C 30s ;55°C 30s ; 72°C lmin，35个循环；72。C延伸10min。 PCR鉴定方向正确后测序，构建正确的重组质粒命 名为pSCll-PRRSV-M。
表IPCR扩增引物设计
8引物序列限制性位点和连接子
PRRSV-M-FCCC4w4GC7TAGCATGGGGTCGTCTCTAGA倫證
PRRSV匿M-RCCGCTCG^GCTATTT GGCATATTTGACA'勘及I
Ub-FTCAG04rcCGCCGCCGCCATGCAGATTTTCGTG扁
Ub-RGG^GCCTG0404AQCACCTCTCAGGCGAAGGAC
PRRSV匿M匿Ub -FrCTCO G(7CTCCATGGGGTCGTCTCTA
PRRSV-M-Ub-RCCC0^77rCTATTTGGCATATTTGACAAGGTT
PRRSV-M-JD-FCCG0147TCATGGGAGTGTACTCGGCC ATAG'
PRRSV-M-JD匿RCCGCTC04GCTATTTGGCATATTTGAC勘I
pSCll-M-FATAGrc04CGCCGCCGCCATGGGGTCGTCTCTAGM
pSCll-M-RGCCGrC04CCTATTTGGCATATTTGACAAGGTTTAC緒
P7.5-FGCACGGTAAGGAAGTAGAAT 引物Ub-F和pSCll-M-F的黑体字是Kozak序列；引物Ub-R的下划线部分代表所设计的突变位点，斜体字部分是连接子序列。
1. 2. 8病毒重组 病毒重组前一天用含有终浓度为25 g/mL的5'-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)[20]的MEM培养液将TK—143细胞以0. 5 2X105cellS/孔接种6孔细胞培养板。次日，待细胞融合度达到80%时，将WR株痘病毒液(M. 0. I = 1)以10倍梯度稀释后接种于TK—143细胞，37。C感作l 2h。按照Lipofectamine 2000说明书进行操作，将纯化的转移重组质粒pSCll-PRRSV-M在脂质体的介导下转染到已感染病毒的单层TK—143细胞上(质粒转染量为2. 0 g)。将细胞于37t:培养并观察细胞病变(CPE)，待CPE达到80%时收毒。
1. 2. 9重组病毒rWR-PRRSV-M的筛选 在终浓度为25 ii g/mL的BrdU的压力下，将感染转染后的培养物在TK—143细胞上盲传2 3代，至细胞稍圆縮，但不形成蚀斑时，在Hela细胞上做蚀斑实验纯化病毒(X-gal染色)2 3代至没有可见的非重组病毒斑(白斑)。即取盲传扩增的病毒液接种Hela单层细胞，37t:感作2h后弃掉病毒液，加入含1%低熔点琼脂糖的DMEM营养琼脂，培养24 48h，待出现典型的CPE时，再覆盖一层含250 ii g/mLX-gal的DMEM营养琼脂，继续培养12 24h后挑取蓝斑，进行新一轮的蚀斑纯化，共进行5轮蚀斑纯化。筛选纯化的重组病毒命名为rWR-PRRSV-M。 1. 2. 10rWR-PRRSV-M基因组中PRRSV M基因的PCR鉴定 将纯化的rWR-PRRSV-M感染TK—143细胞，培养后收取病毒液，用碱裂解方法提病毒DNA进行PCR鉴定。即收取病毒培养液437. 5 y L，然后加入适量蛋白酶K(终浓度为500iig/mL)与10% SDS(终浓度为1 % ) ， 37。C水浴30min ;加入酚/氯仿抽提，4"离心后取上层水相并加入1/10体积的3M NaAC(pH5. 2) 、2倍体积的冷乙醇，-2(TC放置过夜；4"离心后取适量上清，加入O. 5mL无水乙醇，-2(TC放置3h ;4。C离心15min，沉淀用20 y L灭菌去离子水溶解；取病毒DNA 1 ii L做PCR鉴定，反应条件为95。C 5min ;94。C 30s ;55。C 30s ; 72°C lmin，35个循环；72。C延伸10min。
1. 2. llrWR-PRRSV-M的间接免疫荧光 在病毒感染前一天将BHK-21细胞用DMEM培养液以每孔0. 5 2xl05cells接种 24孔细胞培养板；24h后，将rWR-PRRSV-M以M. 0. I为0. 01的感染量接种细胞，待细胞出现 明显CPE时，弃去培养液，用PBS冼两次；用90%乙醇固定30min， PBST冲洗5 10min，用 含有1 % BSA的PBS封闭2h ;PBST洗涤三次，加入一抗(原核表达PRRSV M蛋白纯化后免 疫小鼠所制备的血清)，37t:作用2h ;PBST洗涤三次，接着加入FITC标记的兔抗鼠的二抗， 37t:作用2h ;PBST洗涤三次，于荧光显微镜下观察和拍照。
1. 2. 12质粒DNA的制备与小鼠免疫 用EndoFree Plasmid Maxi Kit纯化质粒DNA后，用Prime-boost策略对SPF级 BALB/c进行肌肉免疫。即将6-8周龄的BALB/c小鼠随机分成4组(30只/组)。分别肌 肉注射免疫pVAXl、pVAXl-M、pVAXl-U-M，免疫量为100 y g/只，共免疫4次，每次间隔3周。 四次免疫后一周使用M. 0. I约为0. 1的量进行腹腔加强免疫，同时空载体组使用WR株牛 痘病毒进行免疫。分别在二免、三免、四免、加强免疫后一周(即一免疫后第28d、49d、70d、 84d)分离血清进行ELISA抗体水平检测。
1. 2. 13ELISA抗体水平的检测与分析 以上述原核截短表达、纯化的PRRSV M蛋白为检测抗原，阳性对照的检测抗原为紫 外灭活后的全病毒(紫外线照射25分钟)。按常规方法建立间接ELISA法，首先通过方阵 滴定实验来确定抗原包被浓度与血清稀释浓度，并在此基础上进一步确定酶标二抗的稀释 度以确定最佳工作浓度，建立ELISA方法。同时用方差分析F检验-双样本方差分析试验 结果，P < 0. 05为差异显著，P < 0. 01为差异极显著。1. 2. 14CTL表位的预测、筛选及合成
使用SYFPEITHI、 BIMAS、 PREDBALB/c三种生物信息学预测方法对PRRSV M蛋白进行 CTL表位预测。然后根据预测分数进行筛选并化学合成(见表2)。
表2化学合成的短肽
生物信息学方法
SYFPEITHI BIMAS PREDBALB'C
多肽 结合评^_#肽 结合评分 多肽 结合评分
K93FITSRCRLBS=23K93FITSRCRLBS=230《000
T25YTPVMIYABS=24T25YTPVMIYABS=72.000KmFITSRCRLBS=9.70
S12TAPQKVLLBS=20S12TAPQKVLLBS=57.600T25YTPVMIYABS=5.3
S140TTVNGTLVBS=19SM0TTVNGTLVBS=14.400S12TAPQKVLLBS=6.J0
TM6LVPGLKGLBS=19T146LVPGLKGLBS=115.200S 140TTVNGTLVBS=6.10
A21FSITYTPVBS=18A21FSITYTPVBS:345扁T146LVPGLKGLBS=9.10
H-2KdR4。LLGLLHLLBS=18R4oLLGLLHLLBS=96.00A21FSITYTPVBS= 9.54
L34KVSRGRLLBS=17L34KVSRGRLLBS=9.600R4。LLGLLHLLBS=7.80
H^FQSTNRVABS=17HMF(3STNRVABS=28.800L34KVSRGRLLBS=5.64
C,02LLGRKYILBS=17C,02LLGRKYILBS=96.00H64FQSTNRVABS=5.64
Q16KVLLAFSIBS=16L162KVSRGRLLBS=11.520C102LLGRKYILBS=7.84
L162KVSRGRLLBS=16L162KVSRGRLLBS=0.012L162KVSRGRLLBS=5.80
S23ITYTPVMIBS=14S23ITYTPVMIBS=48.000L162KVSRGRLL S23ITYTPVMIBS=6.10 BS=8.50
Y26TPVMIYALBS=20.000Y26TPVMIYALBS=9.82
F57GYMTFVHFBS=7.200F57GYMTFVHFBS=10.00
T13APQKVLLABS=12.000T13APQKVIiABS=8.58
H-2Dd(31MGVVNLVKYBS=2.000Q164GVVNLVKYBS=9.40
F122HPIAANDNBS=2.400F122HPIAANDNBS=9.20
P138GSTTVNGTBS=0.200P13SGSTTVNGTBS=9.20
A14PQKVLLAFBS=24A14PQKVLLAFBS-450細A14PQKVLLAFBS=9.38
V 8PGLKGLVLBS=24V148PGLKGLVLBS=150.000V148PGLKGLVLBS=9.50
DUSTAPQKVLBS=20DuSTAPCJKVLBS=25.000DUSTAPQKVLBS= 7.50
H-2LdY86SAIETWKFBS=20Y貼SAIETWKFBS=50.000YS6SAIETWKFBS=7.50
EU7SAAGFHPIBS=20EU7SAAGFHPISS=6.500EU7SAAGFHPIBS=4.70
T邻SRCRLCLLBS=19T96SRCRLCLLBS=7.500T96SRCRLCLLBS=7.60
G139STTVNGTLBS=18G13!)STTVNGTLBS=25.000G139STTVNGTLBS=7.40
F22SITYTPVMBS=15F22SITYTPVMBS=25.000F22SITYTPVMBS=7.00 1. 2. 15小鼠脾淋巴细胞的制备、体外刺激及流式检测 加强免疫后对小鼠实施安乐死后无菌采取脾脏，并将其剪碎研磨后使用EZ-S印tm 小鼠的淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，对细胞计数后使用完全1640培养液将淋巴细胞 重悬，按106cellS/孔加入到96孔细胞培养板中。然后加入终浓度为20p g/ml短肽进行 剌激，用PMA与Ionomycin复合物刺激的细胞孔为阳性对照，不相关肽刺激的细胞孔与不加 任何剌激物的细胞孔为阴性对照。37°C ， 5% C02培养2 3h后加入Brefeldin A进行阻 断，然后继续培养6 8h。完毕后4"，250Xg离心10min，弃培养液加入PBS/NaN3(含有 0.09%NaN3)洗一遍；加入l : 100稀释的PE标记的大鼠抗小鼠CD8a抗体与1 : 200PerCP 标记的土拨鼠抗小鼠CD3e抗体，4°C ，避光染色30min ;完毕后4°C ， 250 X g离心10min，弃抗 体稀释液加入PBS/NaN3洗2遍；1%多聚甲醛4"固定20min ;4。C，500Xg离心10min，弃 固定液加入PBS/NaN3洗2遍；加入1 %皂素室温避光透膜20min ;4。C，500Xg离心10min，弃透膜液；加入l : 200FITC标记的大鼠抗小鼠的IFN-Y抗体，4t:，避光染色30min ;完毕 后4°C ， 500 X g离心10min，弃抗体稀释液加入PBS/NaN3洗2遍；PBS/NaN3重悬细胞，上机 检测分析，并运用方差分析统计数据。
1. 2. 16酶联免疫斑点试验(ELISPOT) 按照ELISPOT Set说明书进行，即先将捕获抗体以5 y g/mL的终浓度4。C包被过 夜；24h后用含有10% FBS的1640培养液室温封闭2h ;将小鼠脾淋巴细胞按5X 105Cells/ 孔加到检测孔中，同时加入短肽、阳性剌激物、阴性剌激物(同流式检测试验)，371:，5% C02培养24h ;弃掉细胞并洗涤，加入终浓度为2 ii g/rnL的检测抗体，室温2h ;弃掉检测抗 体并洗涤，加入酶标亲和素，室温lh ;弃掉酶标亲和素并洗涤，加入AEC底物显色液室温作 用30min ;弃掉底物显色液并洗涤，然后上机读板并运用方差分析统计数据。
2实验结果 2. 1PRRSV M基因及小鼠Ub基因的扩增、克隆及鉴定 应用RT-PCR方法从PRRSV CH-la株与小鼠脾脏的总RNA中分别扩增出了大小约 为546bp与258bp左右的特异性片段(图1、图2)，与预期大小相符。
2. 2PRRSV M蛋白的截短表达、纯化及其免疫活性检测 将重组质粒pGEX-M转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，以终浓度为0. 8mMIPTG 进行诱导表达4 6h，菌体诱导培养物经超声波破碎后进行SDS-PAGE，结果获得了大小约 为36KDa的PRRSV-M蛋白，然后对按照上述的方法对表达产物进行纯化，并对纯化产物进行 SDS-PAGE与Western blot实验。结果表明，在大约36KDa处均出现了 PRRSV M蛋白的条 带。这说明本研究获得了较纯的PRRSV M蛋白(图3)，并且所获得的目的蛋白具有较强的 免疫原性(图4)。 2. 3重组质粒pGEX-M表达PRRSV M蛋白浓度测定 表3蛋白标准品标准曲线的绘制
蛋白标准品的浓度(mg/mL)00.0250.050.10.20.30.40.5
OD59500.03930.08180.13770.26030.3640.48070.5803 空白调零后，纯化蛋白的0D595的值为0. 4493，根据标准曲线和标准方程计算得 纯化蛋白液的浓度大约为0. 419mg/mL(图5)。将纯化蛋白加甘油到50%，分装后-S(TC保存。 2. 4真核重组质pVAXl-M、 pVAXl-U-M的构建 阳性重组质粒pVAXl-M经Xbal酶切后获得了大小分别约为3000bp、534bp的两条 带(图6);而pVAXl-U-M分别经BamH I与EcoR I酶切后获得了大小约为765bp、3000bp的 两条带。条带大小均与预期相符(图7)。
2. 5表达产物的间接免疫荧光(IFA)实验IFA实验将重组质粒转染BHK-21细胞后，IFA实验表明pVAXl-M、pVAXl-U_M在真核细胞内
能够进行有效的转录，并表达目的蛋白(图8)。 2. 6重组牛痘病毒转移载体pSCl l-PRRSV-M的构建 以上述构建好的重组质粒pMD-M为模板，以引物(见表l)pSCll-M-F、 pSCll-M-R进行PCR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、酶切、胶回收后与经同样处理的重组转移质粒pSC11 连接，连接产物转化至感受态细胞JM109。质粒抽提后，进行正反方向鉴定，PCR扩增得到了 大小约为5S0bp的特异性条带，鉴定正确的重组质粒命名pSCll-PRRSV-M(图9，图10)。
2. 7rWR-PRRSV-M的筛选及基因组的PCR鉴定 将重组转移质粒pSCl l-PRRSV-M转染至已感染WR株痘病毒的TK—143细胞， pSCll-PRRSV-M与野毒WR株发生同源重组，重组牛痘病毒带有LacZ基因，在含X-gal的营 养琼脂上产生蓝色蚀斑(图11)，而野毒对照无蓝色蚀斑(图略)；通过连续5轮蓝斑筛选、 纯化后的rWR-PRRSV-M形成的蚀斑均为蓝色。将纯化的重组病毒rWR-PRRSV-M感染TK—143 细胞后，收取病毒液用碱裂解方法提病毒DNA进行PCR鉴定，结果表明PRRSV-M基因准确重 组到牛痘病毒WR株基因组中(图12)。
2. 8rWR-PRRSV-M的Western blot实验结果 待感染rWR-PRRSV-M的BHK-21CPE达到90 %时，收集细胞进行裂解，然后进行 Western blot实验，用同样处理的野毒感染的BHK-21作为对照。结果表明，rWR-PRRSV-M 感染的细胞样品在约19kDa处出现了反应条带，而野毒感染的细胞样品则没有相应条带出 现(图13)。这说明，rWR-PRRSV-M在感染的细胞内成功表达了 PRRSV M蛋白，并且所表达 的蛋白保持了良好的免疫原性。 2. 9重组病毒rWR-PRRSV-M的间接免疫荧光结果将rWR-PRRSV-M以M. 0. I为0. 01的感染量接种BHK-21细胞，待细胞出现明显CPE 时，进行IFA实验。结果表明rWR-PRRSV-M在BHK-21细胞内成功表达了 PRRSVM蛋白。
2. 10免疫后ELISA抗体水平检测 方阵滴定实验的结果表明，抗原包被浓度为0.5iig/mL，血清稀释度为1 : 100 时，ELISA结果的P/N值最高，将上述抗原包被浓度和血清稀释度定为本实验的工作浓度。 ELISA结果表明，二次免疫之后，重组质粒pVAXl-M、 pVAXl-U-M均能诱导机体产生抗体，与 空载体组相比差异显著(P < 0. 05)，但是抗体水平较低，且两免疫组之间未见差异。三免之 后小鼠产生的抗体水平明显升高，且两免疫组之间差异显著(P < 0. 05)，且质粒免疫组与 空载体免疫组相比差异极显著(P < 0. 01)。四免之后的抗体水平继续升高，两质粒免疫组、 空载体免疫组之间差异极显著(P < 0. 01)。而且在使用rWR-PRRSV-M剌激后，抗体水平再 次升高，两质粒免疫组之间差异显著(P < 0. 05)，而空载体免疫组在使用WR株牛痘病毒剌 激后抗体水平无明显变化。这进一步说明本研究所构建的质粒DNA及重组病毒在免疫后均 能机体诱导良好的免疫反应(见图15)。
2. 11小鼠脾淋巴细胞的制备、体外剌激及流式检测 小鼠脾淋巴细胞经剌激物剌激后，流式检测结果表明阳性对照组可见有明显分泌 IFN- y的CD3+CD8+T淋巴细胞。而且，经短肽K93FITSRCRL与F57GMTFVHF剌激的细胞也见 有分泌IFN- y的CD3+CD8+T淋巴细胞(组图16)。同时对所有免疫小鼠的流式检测结果进 行数据统计，结果表明经短肽K93FITSRCRL、 F57GMTFVHF及PMA和IONO组合剌激的小鼠脾 淋巴细胞孔均能分泌IFN-y ，而不经剌激的小鼠脾淋巴细胞与经不相关肽剌激的小鼠脾淋 巴细胞却检测不到IFN- y 。这说明短肽K93FITSRCRL、 F57GMTFVHF均能有效的剌激记忆性 的CD3+CD8+T淋巴细胞增殖分化并分泌IFN- y (图17)。方差分析结果表明，小鼠脾淋巴细 胞经短肽K93FITSRCRL、F57GYMTFVHF剌激后，分泌IFN- y的CD3+CD8+T淋巴细胞数量与其它肽段所剌激的结果相比较差异极显著(P < 0. 01)。
2. 12酶联免疫斑点试验(ELISPOT) 分离小鼠脾淋巴细胞后，按照BD公司BDTMELISPOT SET说明书进行酶联免疫斑 点试验，以检测IFN-Y的分泌细胞.从而进一步验证CTL表位.实验结果表明，经短肽 K93FITSRCRL、 F57GYMTFVHF及PMA和Ionomycin组合剌激的小鼠脾淋巴细胞孔均能分泌 IFN-Y，而不经剌激的小鼠脾淋巴细胞与经不相关肽剌激的小鼠脾淋巴细胞却检测不到 IFN- Y (图18)。方差分析结果表明，小鼠脾淋巴细胞经短肽K93FITSRCRL、 F57GMTFVHF剌 激后的斑点统计结果与其它肽段所剌激的结果相比较差异极显著(P < 0. 01)。
权利要求
一株重组牛痘病毒，其微生物保藏号是CGMCC NO.3206。
2. —种构建权利要求1所述重组牛痘病毒的方法，包括以下步骤将猪繁殖与呼吸综 合征病毒M基因克隆到pSCll上得到重组牛痘病毒转移载体pSCll-PRRSV-M ;将WR株牛痘 病毒液稀释后接种于TK—143细胞，37t:感作1 2h ;将转移重组质粒pSCll-PRRSV-M转染 到已感染病毒的单层TK—143细胞上；筛选，鉴定，即得。
3. 权利要求1所述重组牛痘病毒在制备诊断、预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒药 物中的用途。
4. 猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白针对BALB/c小鼠的CTL细胞表位，其特征在于其氨 基酸序列分别为K93FITSRCRL、 F57GMTFVHF。
5. 权利要求4所述CTL细胞表位在制备诊断、预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒药 物中的用途。
全文摘要
本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CTL细胞表位及其应用。本发明将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株M蛋白基因与小鼠泛素基因进行融合并克隆构建DNA疫苗，同时构建了表达M蛋白的WR株牛痘病毒的重组病毒；按照Priming-Boosting策略免疫BALB/c小鼠，然后分离小鼠脾淋巴细胞，用生物信息学方法预测、合成的CTL短肽进行体外培养刺激，借助流式细胞技术与酶联免疫斑点技术鉴定出K93FITSRCRL与F57GYMTFVHF两个CTL表位，PRRSV M蛋白CTL表位的鉴定将为PRRS细胞免疫机制及新型表位肽疫苗的研究奠定一定的理论基础，同时对PRRS防控技术的理论研究具有指导意义。
文档编号C12Q1/70GK101696399SQ20091018031
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月22日 优先权日2009年10月22日
发明者刘霓红, 吴东来, 张维军, 杨涛, 林燕, 王群, 白宇, 童铁钢 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;