专利名称：：一种hbv基因的核苷酸突变位点的检测方法
技术领域：
：本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域，具体而言涉及HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法。
背景技术：
：自然界大多数生物体的遗传信息均包含在脱氧核糖核酸(DNA)中，人类全基因组中30亿个碱基，约4万个基因，分布在23对染色体上。每个基因通过转录、翻译，编码特异的蛋白质，调控生物体内特定的生化反应，发挥特异的生物学功能。DNA序列的改变，即基因突变，会导致蛋白质结构、功能的改变或缺失，进而引起相关的遗传疾病。基因突变包括DNA分子中发生碱基对的插入、缺失和改变(点突变)。研究表明许多疾病的发生，如血友病、地中海贫血、杜氏型肌营养不良、亨廷顿舞蹈症、老年痴呆症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病以及自身免疫等3000多个疾病与基因突变密切相关。另外，近年来人们逐渐认识到癌症的发生发展也是基因累积突变的结果。在人类基因组中，约90%的差异是以单个核苷酸的差异体现出来的，主要由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，这样的差异位点称作单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。在人群中，这种变异的发生频率至少要大于1%，否则被认为是点突变。SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式，并且在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。这些差异极有可能是造成个体差异的遗传因素，因此发现这些位点可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。目前检测SNP和基因突变的方法有许多种，如直接PCR测序、RFLP、基因芯片和荧光定量PCR等。其中，直接PCR测序最不敏感，只有耐药突变株达到20%以上才能被检测到；也不适用于大规模筛选；RFLP分析只能检测出在病毒总体中大于5%的突变株，但是对于每个感兴趣的突变，必须特别设计单独的核酸内切酶。针对某些突变的特异性内切酶可能并不存在，因此RFLP分析并不适用于所有的突变。基因芯片技术利用寡核苷酸微点阵，可以检测新发现的突变，但这种方法代价昂贵，没有得到广泛应用。总之，上述这些方法不是费时费力，灵敏度低，准确度低，就是成本高，不适合大规模筛查。乙型肝炎病毒(HBV)及其基因全球有超过350万人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，每年由于感染HBV死亡的人数有50万到120万，而约有75%的乙肝患者在亚洲。我国是HBV感染高发区，因此对乙肝的治疗刻不容缓。乙肝病毒是一种易高度变异的病毒，在其逆转录复制过程中因RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，可发生一个或多个核苷酸的变异。HBV-DNA可以在慢性持续性感染过程中自然变异，也可以在免疫压力下发生变异，甚至在各种抗病毒治疗药物诱导下变异。近年来，核苷类药物已成为乙型肝炎治疗的主要方法之一，目前最常用的核苷类药物是拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ENT)和替比夫定(LdT)。由于HBV病毒复制能力极强，因此也极易产生耐药，而一旦耐药可能会有爆发性肝炎的危险。因此对这四种核苷类药物耐药突变的检测应该有更加重要的临床意义。HBV基因的核苷酸突变位点的质谱检测目前本领域中已有使用质谱分析进行核苷酸突变位点检测的方法，但是在现有的方法中通常只是针对单个突变基因型进行检测，即每次质谱仅能检测单个位点的单个突变型。由于质谱分析成本较高，而HBV基因的突变位点及突变形式又比较多，所以进行多位点和多突变型的检测方法成本很高，操作程序也相应地繁琐复杂，费时费力。因此，本领域中亟需新的检测HBV基因的核苷酸突变位点的方法，从而实现对HBV基因的多个核苷酸突变位点和突变型的快速而简便的检测。
发明内容本发明的目的在于提供一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法，旨在解决现有HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法效率较低而成本较高的问题。在本发明的第一方面，提供了一种HBV病毒的核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤(1)针对待检核苷酸序列的突变位点，并确定突变位点在待检序列中的位置；(2)根据突变位点的位置和基因型设计扩增一对引物和至少一条延伸引物，其中扩增引物的长度为30-50bp，其5'端各含lObp的tag;延伸引物的长度为17-28bp，并且其3'末端碱基与突变位点3'端相邻的碱基完全匹配；(3)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；(4)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs;(5)通过延伸反应，在延伸引物的3'端连接一个碱基，且该碱基与突变位点上的碱基互补，延伸反应所使用的原料是以扩大分子量差异为目的进行过质量修饰的四种ddNTP分子；(6)采用树脂纯化延伸反应产物；(7)将纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发进行质谱检测，确定突变的基因型。其中所述步骤(2)所使用的扩增引物对为具有下列序列的多核苷酸的组合SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2，或SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:3;并且其中所述步骤(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDN0:4至SEQIDNO:12任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。在本发明的另一个优选实施方案中，所使用的延伸引物还包括具有SEQIDNO:13至SEQIDN0:16任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。在本发明的另一个优选实施方案中，使用本发明的方法检测的核苷酸突变位点为乙肝病毒逆转录酶区中的180、181、184、202、204、236和250位点中的一种或几种。在本发明的另一个优选实施方案中，使用本发明的方法检测的核苷酸突变位点的突变为rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一种或几种。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明方法还包括在反应中设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有1000拷贝/mlHBVDNA的血清，所述阴性对照为不含有HBVDNA的血清。另外，本发明还提供了用于上述检测方法的特异性引物和引物组合，以及该引物和引物组合用于检测HBV基因的核苷酸突变位点的用途。使用本发明的方法以及引物的组合，可以同时检测HBV基因的多个核苷酸突变位点和多种突变型，也就是在一次质谱分析中检测HBV基因的多个核苷酸突变位点和多种突变型，从而极大地提高了检测效率，简化了操作程序，还节约了时间和成本。图1A为本发明实施例1中，所得到的阴性对照A1的质谱图；图IB为本发明实施例1中，所得到的待测样本B1的质谱图；图IC是本发明实施例1中，所得到的待测样本Cl的质谱图；图2A为本发明实施例2中，所得到的待测样品A2的质谱图；图2B为本发明实施例2中，所得到的待测样本B2的质谱图；图2C是本发明实施例2中，所得到的待测样本C2的质谱图；图2D为本发明实施例2中，所得到的待测样本D2的质谱图；图2E是本发明实施例2中，所得到的待测样本E2的质谱图；图3A为本发明实施例3中，所得到的待测样本A3的质谱图；图3B至3E分别为图3A的局部放大图，其中图3B为本发明实施例3中，检测180位点的质谱图图3C为本发明实施例3中，检测204位点的质谱图；图3D为本发明实施例3中，检测250位点的质谱图；图3E为本发明实施例3中，检测184位点的质谱图。图4中各图为本发明实施例4中，所得到的各样本的质谱图；其中图4A表示rtL180M分析结果图；图4B表示rtAlglT分析结果图；图4C表示rtA181V分析结果图；图4D-4E表示rtT184G分析结果图；图4F表示rtS2021分析结果图；图4G表示rtM204V分析结果图；图4H-4I表示rtM204I分析结果图；图4J表示rtN236T分析结果图；图4K表示rtM250V分析结果图。图5为本发明的实施例4中，使用延伸引物236、181#1#1、181#2#1、202同时对测试样本进行检测的质谱结果。图6为使用延伸引物181#1#2、181#2#2、204#1、184#2同时对测试样本进行检测的结果。具体实施例方式本发明提供了一种核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤(1)针对待检核苷酸序列的突变位点，确定突变位点在待检序列中的位置；(2)根据突变位点的位置和基因型设计扩增一对引物和至少一条延伸引物，其中扩增引物的长度为30-50bp，其5'端各含10bp的tag;延伸引物的长度为17-28bp，并且其3'末端碱基与突变位点3'端相邻的碱基完全匹配；(3)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；(4)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs;(5)通过延伸反应，在延伸引物的3'端连接一个碱基，且该碱基与突变位点上的碱基互补，延伸反应所使用的原料是以扩大分子量差异为目的进行过质量修饰的四种ddNTP分子；(6)采用树脂纯化延伸反应产物；(7)将纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发进行质谱检测，确定突变的基因型。其中所述步骤(2)所使用的扩增引物对为具有下列序列的多核苷酸的组合SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2，或SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:3;其特征还在于，所述步骤(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO:4至SEQIDNO:12任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。下面具体描述本发明的多个优选实施方案，应该理解的是，这些实施方案旨在详细说明本发明，并不在任何方面构成对本发明范围的限制。，顿,点白勺石角g在本发明方法的步骤(1)中，针对待检核苷酸序列可能存在的突变位点，确定突变位点在待检序列中的位置。在人类基因组中，约90%的差异是以单个核苷酸的差异体现出来的，主要由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，这样的差异位点称作单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。在人群中，这种变异的发生频率至少要大于1%，否则被认为是点突变。SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式，并且在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。以乙肝病毒(HBV)为例，乙肝病毒是一种易高度变异的病毒，在其逆转录复制过程中因RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，可发生一个或多个核苷酸的变异。HBV-DNA可以在慢性持续性感染过程中自然变异，也可以在免疫压力下发生变异，甚至在各种抗病毒治疗药物诱导下变异。近年来，核苷类药物已成为乙型肝炎治疗的主要方法之一，目前最常用的核苷类药物是拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ENT)和替比夫定(LdT)。由于HBV病毒复制能力极强，因此也极易产生耐药，而一旦耐药可能会有爆发性肝炎的危险。因此对这四种核苷类药物耐药突变的检测应该有更加重要的临床意义。目前发现HBV基因耐药突变位点主要集中于其逆转录酶(rt)区域，可包括以下突变rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T和rtM250V，在本发明的方法中可以对上述位点的一种或几种进行检测。引物设计在本发明方法的步骤(2)中，根据突变位点的位置设计引物，其中包括一对扩增引物，每条引物长度为30-50bp，其5'端各含10bp的tag;以及延伸引物，其长度为17-28bp，并且其3'末端碱基与突变位点3'端相邻的碱基完全匹配。作为本发明的一个优选实施方式，所述延伸引物的3'末端至少有9个核苷酸与所述突变位点3'端相邻的核苷酸完全匹配。作为本发明的一个优选的实施方式，上述步骤(2)还可以包括按照引物间，引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计每条延伸引物的分子量相互间的差别要大于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量要在4500-8500Da之间。将多个检测位点的扩增引物与扩增引物混合，延伸引物与延伸引物混合。这样可以同时检测多个非连续的SNP位点，提高了效率，节省了成本。作为本发明的另一个优选的实施方式，还可以将连续多个突变位点标记在同一条核苷酸序列上，且共用一对扩增引物，两端的突变位点采取向左右两侧设计，左侧突变位点的延伸引物采取正向设计，右侧突变位点的延伸引物采取反向设计；位于中间的突变位点的延伸引物有多条，且包含其上游的突变位点可能存在的所有核苷酸情况。这样，可以同时检测连续突变的多个位点，节省了成本，縮短了周期，提高了效率。具体来讲，可以采用如下方法设计连续多个突变位点的引物若所述左侧突变位点为Snpl，中间的突变位点为Snp2，右侧突变位点为Snp3，Snpl/Snp2/Snp3所在序列为......TCAGCGATAT[C/T]C[G/A][T/G]AATTCGTACGATGATCGCTAGA......，贝USnpl[C/T]，右侧SNP位点，正向设计，延伸引物为......TCAGCGATATSnp3[T/G]，左侧SNP位点，反向设计，延伸引物为......TACGAATTSnp2[G/A]，中间SNP位点，简并引物，延伸引物为......AGCGATATCC和......AGCGATATTC。PCR扩增在本方法的步骤(3)中，对目的片段进行PCR扩增，扩增反应的条件为本领域技术人员所熟知，在本发明的实施例中也详细描述了示例性的反应条件。并且根据所使用的本发明引物的具体序列，对扩增反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。在本发明的扩增步骤中，使用的扩增引物对选自具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2或SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示序列的多核苷酸的组合。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的方法还包括在反应中设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有1000拷贝/mlHBVDNA的血清，所述阴性对照为不含有HBVDNA的血清，将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试，可以验证该次检测的有效性。SAP酶处理在本发明方法的步骤(4)中，对扩增产物进行SAP酶(虫下碱性磷酸酶)处理，除去所述扩增产物中含有的dNTP，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。延伸反应在本发明方法的步骤(5)中，对经过SAP处理的扩增产物进行延伸反应，在延伸反应中使用本发明的延伸引物，所得到的延伸产物与延伸引物的区别仅在于其3'端多了一个碱基(ddNTP)。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又能使整个系统的分辨率提高。在本发明的方法中使用经过质量修饰的ddNTP，进行质量修饰的主要目的是为了使各延伸产物之间的分子量差距加大，从而提高后续的质谱分析的分辨率。对ddNTP进行质量修饰的方法是已知的。7作为本发明的一个优选实施方式，四种ddNTP为购自美国Sequenom公司的市售产品，其分子量分别是ddATP，271.2Da，ddTTP327.1Da，ddCTP247.2Da，和ddGTP287.2Da;其中分子量差异在16Da以上。在本发明的方法中，所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO:4至SEQIDNO:12任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。在本发明的一个优选实施方案中，所使用的延伸引物还包括具有SEQIDN0:13至SEQIDN0:16任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。在本发明的具体实施方案中，在9微升的反应体系中进行延伸反应，可以根据待检测的位点而使用一种延伸引物或多种的延伸引物的组合，在反应体系中可能含有的各种延伸引物的浓度如下表1所示。表1:延伸反应中所用的延伸引物的浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>应该说明的是，在具体的延伸反应中可以使用上表所示引物的一种或多种，如果使用其中的几种引物，则所述引物在反应体系中的浓度如上表1所示。但是本领域技术人员能够理解，延伸引物的浓度并不是延伸反应的关键因素，完全可以对上表所示的引物浓度做出各种改变或变化，也同样能够实现延伸反应。J1H謹斤在本发明方法的步骤(7)中，对经过纯化的延伸产物进行质谱分析，从而确定各延伸产物的分子量。在本发明的优选实施方式中，质谱仪选择基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。该飞行时间质谱基因分型系统的反应体系为非杂交依赖性，不存在潜在的杂交错配干扰，也不需要引入各种标记物，因而准确性高。在所述方法中，将纯化产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发，由于基质分子经辐射吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。这样，采用质谱仪检测待检测突变位点不仅方便，而且灵敏度高、准确性高。与现有技术相比，本发明采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)系统进行检测，在质谱技术中使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂，反应可以在微量体系中进行，减少样品和各种消耗品的使用。由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)，直接确定碱基的类型，不需要经过任何形式的信号转换，理论上只要有一个拷贝的SNP片断被扩增即可识别，杜绝了假阴性发生的可能。此外质谱技术还有自动化、高通量检测特点。质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多个突变位点，PCR反应可以在微量体系中进行，结合DNA自动提取设备、多重PCR引物设计软件及数据分析软件，大大减轻了工作量，提高了检测通量。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及下述实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1:检测乙肝病毒逆转录酶区180位密码子的基因型(1)设计扩增乙肝病毒逆转录酶区180位密码子的引物乙型肝炎病毒(h印atitisBvirus,I-tBV)感染是严重的世界性卫生问题，每年约有近百万人死于乙肝病毒感染引起的各类疾病。目前治疗乙肝的药物主要是核酸类似物，包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等，这类药物在病毒DNA复制过程中替代正常dNTP，从而导致DNA合成终止。然而，长期服用某种药物会导致耐药性的产生，不仅达不到治疗的目的，反而导致反弹。如果对乙肝患者体内的耐药变异进行研究，即可揭示人群中不同个体对相同药物的敏感性差异的根本原因，也有助于研究者筛选更合适的药物。其中，乙肝病毒基因组逆转录酶区180位密码子C/TTG变成ATG，使得氨基酸由亮氨酸变为甲硫氨酸(L180M)，从而产生对抗病毒药物拉米夫定的耐药性。对于该突变位点的质谱检测，首先根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号NC_003977)，设计一对PCR引物和一条延伸引物，扩增引物为上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDN0:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3';(SEQIDNO:2);9延伸引物命名为引物180，序列为5'-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3'(SEQIDNO:4)。其中，小写字母部分表示10bp的tag。(2)扩增含有乙肝病毒逆转录酶区180位密码子的片段PCR反应片段长度大小为101bp，反应体系为5iil，其中含有4mMMg2+，1X缓冲液，100nM扩增引物，500iiMdNTP，0.5UHottarTaq酶(除扩增引物外，其余均购自美国Sequenom公司)；反应条件95。C15min;45个循环(94°C20s，56°C30s，72°Clmin);72。C3min。PCR反应后，乙肝病毒基因组DNA中带有突变位点的核苷酸序列的拷贝数得到了放大。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可直接用于后续的SAP处理。(3)SAP处理PCR反应产物经过SAP处理，去除多余的dNTPs。具体的SAP反应体系1XSAP缓冲液和0.5USAP酶(购自Fermentas公司)；反应总体积为7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR产物)。反应条件为37°C40min，85°C5min。SAP为虾碱磷酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在-201:保存数周，也可直接用于后续的延伸反应。(4)延伸反应延伸反应后得到一个片段大小为18bp的产物，它与延伸引物(17bp)的区别仅在于3'端多了一个碱基。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又能使整个系统的分辨率提高。延伸反应体系为9iU，缓冲液、ddNTPs(质量经过修饰)、iPLEX酶(均购自美国Sequenom公司)、延伸引物等各种试剂的反应浓度因反应次数的不同而不同(其中所使用的延伸引物180的浓度如表1所示)，反应总体积为9iil(2iil延伸反应混合物+7ii1SAP处理产物)。反应条件94°C30s;40个循环[94°C5s，5个小循环(52°C5s，8(TC5s)]，72°C3min。反应完成后的延伸产物可在4°C保存数天，也可在_201:保存数周，也可直接用于后续的树脂纯化。[OO98](5)树脂纯化在延伸反应的产物中加入6mg树脂(购自美国Sequenom公司，型号08040)，上下颠倒30min。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质谱检测。(6)质谱检测纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入Sequenom质谱仪的真空管中，然后用瞬时纳秒强激光激发，进行MALDI-TOF-MS分析。判定标准如下如果没有发生耐药突变，延伸产物的质谱结果为5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCC-3'或5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCT-3'，分子量分别为5335.5Da和5415.4Da;如果发生耐药突变，延伸产物的质谱结果为5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCA-3'，分子量为5359.5Da。检测结果如下其中样本1A为阴性对照样本，样本1B和1C为待测样本。对于阴性对照样本1A，由于其没有发生耐药突变，因此延伸产物的分子量为5415.4Da(见图1A);对于样本1B，质10谱检测到的分子量为5359.5Da，可以确定样本lB发生了耐药突变(见图1B);对于样本1C，质谱图上出现了两个峰，分别在5359.5Da和5415.4Da，可以推断该样本中存在野生株和突变株(见图1C)。实施例2:检测乙肝病毒逆转录酶区181位密码子的基因型(1)设计扩增乙肝病毒逆转录酶区181位密码子的引物乙肝病毒基因组逆转录酶区181位密码子GCT变成GTT或ACT，使得氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸或苏氨酸(A181V/T)，从而产生对抗病毒药物阿德福韦酯的耐药性。对于该突变位点的质谱检领"根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号NC_003977)，设计一对扩增引物和5条延伸引物，扩增引物为上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDNO:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3，；(SEQIDNO:2);其中，小写字母部分表示10bp的tag。由于181位点的上游180位点也容易发生突变，即C/TTG也会变成ATG，而下游184位点也会发生突变，由ACT变成GGT，所以针对181密码子的第一个碱基设计了3条简并延伸引物，分别为181#1#1:5'-TCAGTCCGTTTCTCTTG-3'(SEQIDNO:5);181#1#2:5'-TCAGTCCGTTTCTCCTG-3，(SEQIDNO:6);禾口181#1#3:5'-TCAGTCCGTTTCTCATG-3'(SEQIDNO:7)。针对其第二个密码子设计了2条简并延伸引物，分别为181#2#1:5，-ATGGCACTAGTAAACTGA-3'(SEQIDNO:8);禾口181#2#2:5'-TGGCACTACCAAACTGA-3(SEQIDNO:9)。(2)扩增含有乙肝病毒逆转录酶区181位密码子的片段PCR反应片段长度大小为98bp，反应体系为5iil，其中含有4mMMg2+，1X缓冲液，100nM扩增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除扩增引物外，其余均购自美国Sequenom公司)；反应条件95。C15min;45个循环(94。C20s，56。C30s，72。Clmin);72°C3min。PCR反应后，乙肝病毒基因组DNA中带有突变位点的核苷酸序列的拷贝数得到了放大。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在-2(TC保存数周，也可直接用于后续的SAP处理。(3)SAP酶处理PCR反应产物经过SAP处理，去除多余的dNTPs。具体的SAP反应体系1XSAP缓冲液和0.5USAP酶(购自Fermentas公司)，反应总体积为7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR产物)。反应条件为37°C40min，85°C5min。SAP为虾碱磷酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可直接用于后续的延伸反应。(4)延伸反应延伸反应后得到一个片段大小为18bp的产物，它与延伸引物的区别仅在于3'端多了一个碱基。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又能使整个系统的分辨率提高。延伸反应体系为9ii1，缓冲液、ddNTPs(质量经过修饰)、iPLEX酶(均购自美国Sequenom公司)、延伸引物等各种试剂的反应浓度因反应次数的不同而不同(其中所使用的各延伸引物的浓度如表l所示)，反应总体积为9iil(2iU延伸反应混合物+7iUSAP处理产物)。反应条件94t:30s;40个循环[94°C5s，5个小循环(52°C5s，8(TC5s)]，72°C3min。反应完成后的延伸产物可在4"保存数天，也可在-2(TC保存数周，也可直接用于后续的树脂纯化。(5)树脂纯化在延伸反应的产物中加入6mg树脂(购自美国Sequenom公司，型号08040)，上下颠倒30min。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质谱检测。(6)质谱检测纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入Sequenom质谱仪的真空管中，然后用瞬时纳秒强激光激发，进行MALDI-TOF-MS分析。分型结果依据分子量来判定，标准如下181#1#1，野生型为5405.5Da，突变型为5389.5Da;181#1#2，野生型为5390.5Da，突变型为5374.5Da;181#1#3，野生型为5414.6Da，突变型为5398.5Da;181#2#1，野生型为5818.8Da，突变型为5802.8Da;181#2#2，野生型为5450.6Da，突变型为5434.6Da。检测结果如下样本2A、2B、2C、2D和2E为临床待测样本。样本2A，由181#1#1检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5405.5Da禾口5389.5Da(见图2A);样本2B，由181#1#2检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5390.5Da和5374.5Da(见图2B);样本2C，由181#1#3检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5414.6Da和5398.5Da(见图2C);样本2D，由181#2#1检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5818.8Da和5802.8Da(见图2D);样本2E，由181#2#2检测到突变型，因此延伸产物的分子量为5434.6Da(见图2E)。实施例3:同时检测乙肝病毒逆转录酶区180、204、250和184位密码子的基因型(1)设计扩增乙肝病毒逆转录酶区180、204、250和184位密码子的引物乙肝病毒基因组逆转录酶区180位密码子TTG或CTG可突变成ATG，204位密码子ATG可突变成ATT，250位密码子ATG可突变成GTG，以及184位密码子ACT可突变成GCT，从而产生抗病毒药物耐药性。对于这些突变位点的质谱检测，根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号NC_003977)，设计1对扩增引物和4条延伸引物，扩增引物为上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDNO:1);下游5'-acgttggatgACCCCAACTTCCAATTACAT-3，(SEQIDNO:3);其中，小写字母部分表示lObp的tag。4条延伸引物分别对应4个检测位点，引物序列如下180位点5，-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3，(SEQIDNO:4);204位点5，-CCCCCAATACCACATCATC-3，(SEQIDNO:10);250位点5，-GGGCTACTCCCTTAACTTC-3'(SEQIDNO:11);禾口184位点5，-ACTGAACAAATGGCACTAC-3'(SEQIDNO:12)。(2)扩增含有乙肝病毒逆转录酶区181位密码子的片段PCR反应片段长度大小为293bp，反应体系为5iil，其中含有4mMMg2+，lX缓冲液，100nM扩增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除扩增引物外，其余均购自美国Sequenom公司)；反应条件95。C15min;45个循环(94°C20s，56。C30s，72。Clmin);72。C3min。PCR反应后，乙肝病毒基因组DNA中带有突变位点的核苷酸序列的拷贝数得到了放大。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可直接用于后续的SAP处理。(3)SAP酶处理PCR反应产物经过SAP处理，去除多余的dNTPs。具体的SAP反应体系1XSAP缓冲液和0.5USAP酶(购自Fermentas公司)，反应总体积为7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR产物)。反应条件为37°C40min，85°C5min。SAP为虾碱磷酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可直接用于后续的延伸反应。(4)延伸反应延伸反应后得到4个片段大小为18-29bp的产物，它与延伸引物的区别仅在于3'端多了一个碱基。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又能使整个系统的分辨率提高。延伸反应体系为9ii1，缓冲液、ddNTPs(质量经过修饰)、iPLEX酶(均购自美国Sequenom公司)、延伸引物等各种试剂的反应浓度因反应次数的不同而不同(其中所使用的各延伸引物的浓度如表1所示)，反应总体积为9iil(2iU延伸反应混合物+7iUSAP处理产物)。反应条件94t:30s;40个循环[94°C5s，5个小循环(52°C5s，80°C5s)]，72°C3min。反应完成后的延伸产物可在4"保存数天，也可在-2(TC保存数周，也可直接用于后续的树脂纯化。[OH7](5)树脂纯化在延伸反应的产物中加入6mg树脂(购自美国Sequenom公司，型号08040)，上下颠倒30min。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质谱检测。(6)质谱检测纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入Sequenom质谱仪的真空管中，然后用瞬时纳秒强激光激发，进行MALDI-TOF-MS分析。分型结果依据分子量来判定，标准如下180位密码子，野生型为5335.5Da，突变型为5359.5Da;204位密码子，野生型为5868.9Da，突变型为5892.9Da;250位密码子，野生型为5985.9Da，突变型为6001.9Da;184位密码子，野生型为6116.9Da，突变型为6037.0Da。检测结果如下样本3A为临床待测样本。从图中可以看出，通过这一次反应，实现了4个位点同时检测(图3A)。其中检测到180位点为野生型，分子量为5335.5Da(图3B);204位点为野生型，分子量为5868.9Da(图3C);250位点为野生型，分子量为5985.9Da(图3D);184位点为突变型，分子量为6037.ODa(图3E)。实施例4:同时检测乙肝病毒逆转录酶区的180、181、184、202、204、236和250位点的基因型在本实施例中，通过使用本发明的特异性引物，可以同时检测乙肝病毒逆转录酶区中的rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一种或几种突变。(1)引物设计根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号NCJ)03977)，设计了一对扩增引物，该扩增引物3'位置与基因组序列有12个碱基的完全匹配，且该扩增引物带了IO个碱基acgttggatg的标签序列；同时还设计了12条延伸引物，这些延伸引物的长度为17-28碱基，并与突变位点的3'端的至少9个碱基完全匹配；所述延伸引物与延伸产物之间，各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于9Da。扩增引物经过PAGE纯化，延伸引物经过HPLC纯化。所使用的扩增引物为上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDN0:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3，；(SEQIDNO:2);其中，小写字母部分表示10bp的tag。所用的延伸弓I物的序列参见表2表2:延伸引物的名称和序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(2)PCR扩增随机选择了11个临床血清样本(分别命名为4A至4K)，分别从血清中提取DNA进行测试，同时还在反应中设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为含有1000拷贝/mlHBVDNA的血清，阴性对照为不含有HBVDNA的血清。PCR反应片段长度大小为273bp，反应体系为5iil，其中含有4mMMg2+，lX缓冲液，100nM扩增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除扩增引物外，其余均购自美国Sequenom公司)；反应条件95。C15min;45个循环(94°C20s，56°C30s，72。Clmin);72°C3min。PCR反应后，乙肝病毒基因组DNA中带有突变位点的核苷酸序列的拷贝数得到了放大。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可直接用于后续的SAP处理。(3)SAP处理PCR反应产物经过SAP处理，去除多余的dNTPs。具体的SAP反应体系1XSAP缓冲液和0.5USAP酶(购自Fermentas公司)，反应总体积为7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR产物)。反应条件为37°C°C40min，85°C5min。SAP为虾碱磷酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在-201:保存数周，也可直接用于后续的延伸反应。(4)延伸反应延伸反应后得到ll个片段大小为18-29bp的产物，它与延伸引物的区别仅在于3'端多了一个碱基。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又能使整个系统的分辨率提高。延伸反应体系为9ii1，缓冲液、ddNTPs(质量经过修饰)、iPLEX酶(均购自美国Sequenom公司)、延伸引物等各种试剂的反应浓度因反应次数的不同而不同，反应总体积为9iil(2iil延伸反应混合物+7ii1SAP处理产物)(所使用的各延伸引物的浓度见表l)。反应条件94。C30s;40个循环[94。C5s，5个小循环(52。C5s，80。C5s)]，72。C3min。反应完成后的延伸产物可在4。C保存数天，也可在_20°C保存数周，也可直接用于后续的树脂纯化。在本实施例中，还使用了如下所述的各引物组合进行延伸反应和随后的质谱测序(l)将180、204、250、184组合用于一个延伸反应体系并将反应产物同时置于质谱仪的一个well中进行检测；(2)将236、181#1#1、181#2#1、202组合用于一个延伸反应体系并将反应产物同时置于质谱仪的一个well中进行检测；(3)将181#1#2、181#2#2、204#1、184#2组合用于一个延伸反应体系并将反应产物同时置于质谱仪的一个well中进行检测。(5)采用树脂纯化延伸反应产物。在延伸反应的产物中加入6mg树脂(购自美国Sequenom公司，型号08040)，上下颠倒30min。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4t:保存数天，也可在_201:保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质谱检测。(6)质谱检测纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入Sequenom质谱仪的真空管中，然后用瞬时纳秒强激光激发，进行MALDI-TOF-MS分析。从而确定待检测HBV基因耐药突变位点的基因型。15质谱检测的结果见图4A-4K和图5样本4A，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K为临床待测样本，样本4A，由180检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5415.4Da和5359.5Da(见图4A);样本4B，由181#1#1检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5405.5Da和5389.5Da(见图4B);样本4C，由181#2#1检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5818.8Da和5802.8Da(见图4C);样本4D，由184#1检测到突变型，因此延伸产物的分子量为6116.9Da(见图4D);样本4E，由184#2检测到突变型，因此延伸产物的分子量为5747.8Da(见图4E);样本4F，由202检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5767.7Da禾口5807.6Da(见图4F);样本4G，由204#1检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5972.8Da和5892.9(见图4G);样本4H，由204检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5868.9Da禾口5908.9Da(见图4H);样本41，由204检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5868.9Da和5892.9(见图41);样本4J，由236检测到突变型，因此延伸产物的分子量分别为6512.2Da(见图4J);样本4K，由250检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5985.9Da和6001.9Da(见图4K).图5为使用延伸引物236、181#1#1、181#2#1、202同时对测试样本进行检测的结果。对样本的检测结果显示，所述样本的181#1#1位点的延伸产物分子量为5405.5Da，因此该位点为野生型，；181#2#1位点的延伸产物分子量为5818.8Da，因此该位点为野生型；202位点的延伸产物分子量为5767.7Da，因此该位点为野生型；236位点的延伸产物分子量为6536.2Da，因此该位点为野生型。图6为使用延伸引物181#1#2、181#2#2、204#1、184#2同时对测试样本进行检测的结果。对样本的检测结果显示，所述样本的181#1#2位点的延伸产物分子量为5390.5Da，因此该位点为野生型，；181#2#2位点的延伸产物分子量为5450.6Da，因此该位点为野生型；204#1位点的延伸产物分子量为5972.8Da，因此该位点为野生型；184#2位点的延伸产物分子量为5787.8Da，因此该位点为野生型。从上述结果可以看出，使用本发明的方法和引物检测HBV病毒的耐药性突变位点，可以在一次质谱检测中同时检测多个突变位点的多种突变型，这与现有技术相比，极大地提高了检测效率，并降低了检测成本。以上所述仅为本发明的优选和具体的实施方案，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表〈110〉深圳华大基因科技有限公司〈120〉一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法〈130>CP1091109/CB〈160>16〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1acgttggatgaagattcctetgggagtggg30〈210>2〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2acgttggatgagccctacgaaccactgaac30<210>3〈211〉30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3acgttggatgaccccaacttccaattacat30〈210>4〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gcctcagtccgtttctc17〈210>5〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5tcagtccgtttctcttg17〈210>6〈211>17〈212>DNA<213>人工序列<400>6tcagtccgtttctcctg17〈210>7〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tcagtccgtttctcatg1717〈210>8〈211〉18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8atggcactagtaaactga18〈210>9〈211〉17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9tggcactaccaaactga17〈210>10〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10cccccaataccacatcatc19〈210>11〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉11gggctactcccttaacttc19〈210>12〈211>19<212〉DNA〈213〉人工序列〈400>12actgaacaaatggcactac19〈210>13〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13gtctttgggtatacatttaa〈210>14〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>14cccactgtttggctttca〈210>15〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>15cccaataccacatcatcca〈210>16〈211>18〈212>醒<213>人工序列〈400>163ctg朋c朋3tggcacte权利要求一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤(1)针对待检核苷酸序列的突变位点，确定突变位点在待检序列中的位置；(2)根据突变位点的位置和基因型设计一对扩增引物和至少一条延伸引物，其中，扩增引物的长度为30-50bp，其5’端各含10bp的tag；延伸引物的长度为17-28bp，并且其3’末端碱基与突变位点3’端相邻的碱基完全匹配；(3)使用所述扩增引物进行PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；(4)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs；(5)使用所述延伸引物进行延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，且该碱基与突变位点上的碱基互补，延伸反应所使用的原料是以扩大分子量差异为目的进行过质量修饰的四种ddNTP分子；(6)采用树脂纯化延伸反应产物；(7)将纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发进行质谱检测，确定突变的基因型；其中所述步骤(2)所使用的扩增引物对为具有下列序列的多核苷酸的组合SEQIDNO1和SEQIDNO2，或SEQIDNO1和SEQIDNO3；并且其中所述步骤(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO4至SEQIDNO12任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(5)中所使用的延伸引物还包括了具有SEQIDNO:13至SEQIDNO:16任一项所示序列的多核苷酸的一种或多种。3.如权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸突变位点为乙肝病毒逆转录酶区中的180、181、184、202、204、236和250位点中的一种或几种。4.如权利要求3所述的方法，其中所述核苷酸突变位点的突变为rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一种或几种。5.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在反应中设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有IOOO拷贝/mlHBVDNA的血清，所述阴性对照为不含有HBVDNA的血清。6.—种多核苷酸，具有SEQIDN0:1至SEQIDNO:16任一项所示的核苷酸序列。7.具有SEQIDNO:l至SEQIDNO:16任一项所示序列的多核苷酸用于检测HBV基因的核苷酸突变位点的用途。8.—种用于HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法中的引物组合，包括选自具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2或SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示序列的一对多核苷酸作为扩增引物，以及选自具有SEQIDNO:6至SEQIDNO:16任一项所示序列的一种或多种多核苷酸作为延伸引物。全文摘要本发明提供了一种检测基因突变位点的方法，包括如下步骤(1)确定HBV基因逆转录酶区的耐药突变位点；(2)根据这些突变位点设计出扩增引物和每个突变位点的延伸引物；(3)PCR扩增；(4)SAP酶处理；(5)延伸反应；(6)采用树脂纯化延伸反应产物；(7)质谱检测，确定待检测HBV基因耐药位点。采用本发明提供的方法，解决了现有检测方法灵敏度低、准确率有限，以及通量低，成本高的问题。本发明还提供了检测HBV基因的耐药性突变位点的方法。此外，本发明还提供了用于上述方法的特异性引物及其用于上述检测方法的用途。文档编号C12R1/93GK101760566SQ200910178449公开日2010年6月30日申请日期2009年9月29日优先权日2009年9月29日发明者刘兴旺,华桑,叶葭,吕芳,吴平,喻爽,张俊青,张秀芝,易吉,易鑫,朱德琴,朱江阳,李国宏,李晶晶,杨玲,王威,田超,聂喜芳,韦清,高扬申请人:深圳华大基因科技有限公司