D型人m1叉头蛋白异构体及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的D型人M1叉头蛋白异构体——FOXM1D，编码FOXM1D的多核苷酸序列以及FOXM1D蛋白序列。本发明还公开了FOXM1D的多核苷酸和蛋白的用途，包括FOXM1D具有诱导肿瘤出现上皮?间质转化并促进肿瘤细胞侵袭的功能，故FOXM1D可用于临床诊断标志物以及治疗靶点。
【专利说明】
D型人M1叉头蛋白异构体及其编码基因
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种D型人Ml叉头蛋白异构体蛋白 (Forkhead box protein M1D，F0XM1D)及其编码的多核苷酸序列。
【背景技术】
[0002] 目前，恶性肿瘤仍是危害人类健康的全球卫生问题之一。在我国，随着人口老龄化 进程、工业化、不良生活方式及环境污染等原因，恶性肿瘤病人每年呈递增趋势。肿瘤转移 是患者死亡的关键原因，是决定治疗和预后的重要指标。外科手术及辅助治疗能够治愈界 限清晰的原位肿瘤，而肿瘤转移灶由于其特殊的系统特征导致绝大多数不可治愈 (Valastyan and Weinberg,2011)。因此，大于90%的癌症死亡是由转移导致的(Gupta and ]\&88&8116,2006;3七668,2006;\^1&8七5^11&11(1?6；[油6坪，2011)。此外，临床上60%以上的恶 性肿瘤患者在发现时已经转移。基于此，对于恶性肿瘤转移的机制阐明将为治疗恶性肿瘤 提供重要的理论基础。
[0003] 肿瘤转移分为如下几步复杂的过程:原发肿瘤发展为侵袭性肿瘤，肿瘤细胞侵袭 床头基底膜，肿瘤细胞进入淋巴系统及血液循环系统，在循环系统中的肿瘤细胞转运到靶 器官，肿瘤细胞穿出血管形成微小转移灶，肿瘤血管新生及在继发灶定居生长等这几个阶 段。上皮间质转换(EMT，epi the lial-mesenchymal transit ion)是在协助肿瘤转移中至关 重要的细胞学事件，这种细胞表型转换允许肿瘤细胞摆脱细胞与细胞间连接而更具有侵袭 性。EMT的发生是一个复杂的动态过程，涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，而其 具体调控机制并未完全阐明。
[0004] Ml叉头蛋白（F0XM1，Forkhead box protein Ml)属于一个庞大的转录因子家族， 因其包含共有的叉头DNA结合域而得名（Halasi and Gartel，2013;Katoh et al. ,2013; Wierstra，2013a;Wierstra，2013b)。目前，F0XM1 已有三种可变剪切体，即F0XM1A，F0XM1B和 FOXMIGFOXMIB及F0XM1C作为转录活性分子，而F0XM1A则作为转录抑制因子发挥作用。
[0005] 此外，Kim YH报道了一个新的F0XM1转录本--F0XM1 Δ C，在多种肿瘤细胞中存在 (Kim et al.，2013)。研究发现，F0XM1在几乎所有肿瘤中均异常表达。通过控制一系列在细 胞周期进程相关基因，F0XM1作为诱导有丝分裂及特异调控增殖的癌基因发挥作用。近来的 一些研究显示F0XM1在侵袭及血管生成等方面发挥重要作用。F0XM1同样能够上调L0X及 Slug的表达水平，进而减少E-cadherin的表达。综上，F0XM1是EMT及肿瘤转移的关键调控分 子。但是，对于F0XM1调控肿瘤转移的详细机制还需进一步阐述。
[0006] 随着近年来免疫治疗和生物治疗的发展，恶性肿瘤的治疗取得了突破性进展。但 是对于晚期转移肿瘤病人，其生存期及生活质量仍是目前恶性肿瘤治疗面临的严峻问题。 因此，对于肿瘤转移患者的早期诊断和治疗仍是肿瘤领域亟待解决的问题，而缺乏合适的 诊断标志物和有效的药物治疗靶点是重要原因。
【发明内容】
[0007]为了解决上述肿瘤治疗中的问题，本发明利用分子生物学手段发现了 F0XM1的一 个新的异构体一一F0XM1D，并发现了其在诱导EMT、促进肿瘤转移等方面的显著功能。
[0008] -方面，本发明通过GeneRace的手段发现了上述的异构体，经GeneRace后获得的 核苷酸序列如SEQ ID勵:3所示，其中包含了？(《110的1￥、￥、￥1、￥11、￥11&的外显子序列，该 异构体F0XM1D能够通过其外显子IV-V-VI-VII-VIIa编码的蛋白或多肽与R0CK1/2的 coiled-coil结构域相互作用进而调控细胞骨架及EMT，促进肿瘤转移，该蛋白质在大肠癌 病人的组织中显示出与预后的显著相关性。
[0009] 进而，本发明提供了一种D型人Ml叉头蛋白F0XM1D，该蛋白选自下组：
[0010] (a)具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的蛋白；
[0011] (b)将SEQ ID NO: 1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸参加的取代、缺失或添加而 形成的，且具有促进肿瘤细胞侵袭迀移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽；
[0012] (c)与SEQ ID NO: 1氨基酸序列有2 95%同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭迀移功 能的由(a)衍生的蛋白或多肽。
[0013] 进一步，本发明提供了上述人F0XM1D蛋白的编码基因，该基因具有如SEQ ID N0:2 所示的多核苷酸序列，该序列的845-1332位对应于SEQ ID NO: 3,其中包含了F0XM1D特有的 IV、V、VI、VII、VIIa 外显子序列。
[0014]进而，本发明提供了一种核酸，该核酸具有：
[0015] (a)如SEQ ID N0:2所示的多核苷酸序列；或
[0016] (b)与SEQ ID N0:2所示的多核苷酸序列互补的序列。
[0017]更进一步，本发明提供了一种核酸，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋 白；优选地，上述核酸具有：
[0018] (a)如SEQ ID N0:2所示的序列中845-1332位的序列；或
[0019] (b)如SEQ ID N0:2所示的序列中1-2361位的序列。
[0020] 另一方面，本发明提供了一种蛋白或多肽的制备方法，包括步骤：
[0021] 1)构建含有如下(a)或(b)所述的核酸的载体：
[0022] (a)具有如SEQ ID N0:2所示多核苷酸序列的核酸；
[0023] (b)具有与SEQ ID N0:2所示多核苷酸序列互补序列的核酸；
[0024] 2)将构建的载体转染入宿主细胞；
[0025] 3)在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞；
[0026] 4)从培养物中分离出具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的全长蛋白或部分片段的多 肽；
[0027] 5)人工合成具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的全长蛋白或部分片段的多肽。
[0028]进而，本发明提供了一种载体，其含有如下(a)或(b)所述的核酸：
[0029] (a)具有如SEQ ID N0:2所示多核苷酸序列的核酸；
[0030] (b)具有与SEQ ID N0:2所示多核苷酸序列互补序列的核酸。
[0031 ]进一步，本发明还提供了一种遗传工程化细胞，其含有上述的载体。
[0032]更进一步，本发明还提供了一种过表达具有如SEQ ID N0:2所示序列的核酸的细 胞，以及一种敲减具有如SEQ ID N0:2所示序列的核酸的细胞。
[0033]第三个方面，本发明还提供了 D型人Ml叉头蛋白F0XM1D作为预后肿瘤病人的一种 标志物的应用，以及作为肿瘤治疗靶点进行药物设计的应用。
[0034] 上述的应用的一种优选实施方式表现为一种能与所述D型人Ml叉头蛋白全长或部 分片段特异性结合的抗体、化合物或其他物质；另一种优选实施方式表现为一种药物组合， 其含有安全有效量的所述D型人Ml叉头蛋白的拮抗剂或激动剂，以及药学上可接受的载体； 又一种优选实施方式表现为一种用于药物测试的动物模型，该模型通过基因工程方法外源 性转入包含具有SEQ ID N0: 2核苷酸序列其互补序列的核酸，并外源性表达所述D型人Ml叉 头蛋白；再一种优选实施方式表现为一种检测方法，检测具有SEQ ID N0:2核苷酸序列或其 互补序列的核酸和/或所述D型人Ml叉头蛋白在不同组织或体液中的含量。
[0035] 进一步，本发明还提供了一种确定测试化合物或抗体是否是人F0XM1D蛋白的拮抗 剂或激动剂的方法，其包括步骤：
[0036] 1)将测试化合物或抗体加入体外培养细胞的培养体系作为测试组，并将体外培养 的相同细胞作为对照组，其中所述的细胞来自于哺乳动物，并且表达所述D型人Ml叉头蛋 白；
[0037] 2)观察测试组和对照组中细胞的迀移程度，如果测试组的细胞迀移程度大于对照 组，则表示测试化合物或抗体是人F0XM1D蛋白的激动剂;如果测试组的细胞迀移程度小于 对照组，则表示测试化合物是人F0XM1D蛋白的拮抗剂。
[0038] 鉴于与R0CK1/2相互作用而改变细胞的形态，参与细胞的运动是F0XM1D发挥功能 的分子机制之一，因此，本发明还提供了以F0XM1D作为靶点在高血压、糖尿病和生殖系统相 关等疾病中的诊断和药物设计的分子标记物以及药物靶点的应用。
[0039] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0040] 图1为钓取的F0XM1D基因的电泳结果；
[0041] 图2为钓取的F0XM1D基因的测序鉴定结果；
[0042]图3为F0XM1D在蛋白水平的鉴定结果；
[0043] 图 4为 SW-480-control 及 F0XM1D 过表达细胞株的 E-cadher in、N_cadherin及 Vimentin蛋白水平鉴定结果；
[0044] 图 5为He la-contro 1 及F0XM1D过表达细胞株的E-cadher in、N-cadherin及 Vimentin蛋白水平鉴定结果；
[0045] 图 6为LoVo-shcontrol 及shFOXMlD 细胞株的E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 蛋白水平鉴定结果；
[0046] 图 7为SW-480-control 及 F0XM1D 过表达、LoVo-shcontrol 及shFOXMlD 细胞株 Transwell实验检测侵袭能力的结果；
[0047] 图8为SW-480-control及F0XM1D过表达组小鼠肠癌足垫转移检测结果；
[0048] 图9为SW-480-control及F0XM1D过表达组小鼠肠癌远处转移检测结果；
[0049] 图10为LoVo-shcontrol及shFOXMlD组小鼠肠癌足垫转移检测结果；
[0050] 图11为LoVo-shcontrol及shFOXMlD组小鼠肠癌远处转移检测结果；
[0051 ] 图12为正常组和肿瘤未转移组F0XM1D的mRNA水平检测结果；
[0052] 图13为肿瘤非转移组和转移组F0XM1D的mRNA水平检测结果。
【具体实施方式】
[0053] 实施例1F0XM1D基因的鉴定、钓取及质粒构建 [0054] 1.仪器与材料
[0055] Mastercycler pro-Eppendorf PCR仪（德国Eppendorf公司），DK_8D型电热恒温水 槽(上海精宏实验设备有限公司），IQ350凝胶成像系（美国GE Healthcare公司），C02细胞培 养箱（美国Thermo Scientific公司），FR-980A生物电泳图像分析系统（复日科技公司）、 NanoVue RNA/DNA浓度/纯度检测仪（德国 IKA公司），GeneRacer Kit(美国 Invitrogen公 司），pMD-19T载体(大连Takara公司），ImageQuant LAS 4000化学发光成像仪(美国GE公司） 抗体订制(上海睿星基因科技公司）。
[0056] 2.实验方法
[0057] 2.1 GeneRace 及基因钓取
[0058] Trizol法（Invitrogen)提取 Hela、293T或K562 细胞的总RNA，按照GeneRacer 试剂 盒说明书将总RNA去磷酸化、去帽子、加接头oligo,反转录为cDNA(Promega)，进行两轮PCR 扩增。 ACT_：3,。将第一轮PCR产物回收后进行第二轮PCR扩增，引物如下：5，_ AGAACTCCATCCGCCACAACC-3 ' ； 5 ' -TAAACAAAGAAAGATAAAATTAAAC-3 '。将第二轮PCR产物回收 后连入PMD-19T载体，测序后得到含有F0XM1外显子V、VI、VII和Vila的片段。
[0060] 再以原CDNA为模板，通过第三次PCR扩增后连入PMD-19T载体，引物如下：5'_ ATGAAAACTAGCCCCCG-3 ' ； 5 ' -CTACTGTAGCTCAGGAAT-3 '。通过挑取单克隆，得到含有F0XM1D全 长的克隆。
[0061 ] 2.2蛋白水平鉴定F0XM1D表达
[0062] 针对F0XM1D第五六外显子衔接处及Vila外显子所编码蛋白序列设计表位多肽，免 疫兔子制备特异多克隆抗体。多肽序列如下：CPll(DQVFKQQKRP)及CP12(FSGDLRDFGTP)。理 论上CPI 1识别F0XM1B及F0XM1D，而CP12识别F0XM1A及F0XM1D，而由于F0XM1A异构体在组织 及细胞中存在较少，因此CP12被认为主要识别F0XM1D。将F0XM1D片段构建入pEGFP-Nl载体， 在Hela细胞中用Lipo2000瞬时转染pEGFP-Nl-FOXMlD载体，36小时后收取细胞总蛋白，进行 western blot检测。
[0063] 3.实验结果
[0064] 结果显示，F0XM1D基因被成功钓取（图1和图2)，并且CP12及商业化F0XM1抗体 (santacruz，K-19)均能够检测到F0XM1D在细胞中的明显表达(图3)。
[0065] 实施例2F0XM1D在EMT及肿瘤转移中的功能检测 [0066] 1.仪器与材料
[0067] siRNA片段合成（genepharma公司），G418及puromycin抗生素（德国Merck公司），E_ cadherin，N_cadherin，Vimentin抗体(Abeam公司），Transwell小室（BD公司），24孔细胞培 养板（Corning公司），BioRAD Mini protein Tera system(美国BioRAD公司）， ImageQuantLAS 4000化学发光成像仪（美国GE公司），C02细胞培养箱（美国Thermo Scientific公司），Matrigel基质胶（BD falcon公司），BALB/c裸鼠（上海SLAC公司）， Luciferin(美国Perkin Elmer公司），小动物体内成像仪(In-Vivo MS FX PRO,Bruker)。
[0068] 2.实验方法
[0069] 2.1 F0XM1D过表达及敲减细胞株的获得
[0070] 将F0XM1D构建入pLVX-IRES-Neo慢病毒载体，抽提质粒后合并其余两个包装质粒 用Lip〇2000转染入293FT细胞株中包装病毒，收取病毒上清后感染SW-480细胞株以及Hela 细胞株，在G418筛选两轮后得到稳定过表达F0XM1D细胞株;敲减细胞株的获得与上述过表 达细胞株相似，将合成的两条siRNA片段煮沸后退火，连入pLKO.l载体，其余步骤同上述 (puromycin抗生素筛选）。
[0071] 2.2免疫印迹检测稳转细胞株EMT指标
[0072] 将 SW-480-control 及F0XM1D过表达细胞株、Hela-control 及F0XM1D过表达细胞 株、LoVo-shcontrol及shFOXMlD细胞株收取细胞总蛋白，定量后取50yg蛋白总量上样，进行 western blot，分别孵育E-cadherin、N-cadherin及Vimentin抗体，过表达细胞株的检测结 果如图4-6所示。
[0073] 2.3 Transwell实验检测稳转细胞株侵袭能力
[0074]取Matrigel按照1:3稀释铺入24孔细胞板，置于37°C细胞培养箱过夜凝胶。第二 日，将SW-480-control及F0XM1D过表达、LoVo-shcontrol及shFOXMlD细胞株消化后计数，用 无血清培养基稀释后分别均取5X104细胞每孔进行铺板，置于37°C细胞培养箱。48小时后 用4%多聚甲醛固定后，结晶紫染色后拍照，然后计算各组的细胞数，其结果如图7所示。 [0075] 2.4小动物体内成像检测F0XM1D对于肠癌转移的功能测定
[0076]将 SW-480-control 及 F0XMlD、LoV〇-shcontrol 及 shFOXMlD 细胞株按照 1 X 106 细 胞/只小鼠进行皮下种植肿瘤，约两周后取出皮下肿瘤，切成1mm3小块，将肿块种植在BALB/ c裸鼠盲肠部位。大概40天后，将各组小鼠麻醉后腹腔注射luciferin底物后，进行小动物体 内成像监测肿瘤转移情况，结果如图8-11所示。
[0077] 3.实验结果
[0078] 免疫印迹结果显示在过表达F0XM1D后E-cadherin显著下降，N-cadherin及 Vimentin蛋白水平显著上调，在F0XM1D敲减后结果相反，上述指标提示F0XM1D诱导EMT发生 (图4-6) Jranswell实验显示F0XM1D显著促进肿瘤细胞的侵袭能力（图7)。而肠癌原位模型 上，小动物体内实验显示F0XM1D驱动肿瘤细胞在小鼠体内的转移，敲减F0XM1D后，肿瘤的转 移能力极显著降低（图8-11)。
[0079] 实施例3 F0XM1D在肠癌病人组织中mRNA水平测定
[0080] 1.仪器与材料
[0081 ] ABI 7900HT型高通量实时荧光定量PCR仪（美国Life Technology公司），Trizol RNA抽提试剂（美国Life Technology公司），PowerS:YBR?Green Master Mix(美国Life Technology公司），肠癌病人组织标本(来自于复旦大学附属肿瘤医院组织库保存），384孔 板(美国Life Technology公司），反转录试剂盒(美国Promega公司）。
[0082] 2.实验方法
[0083]将从复旦大学附属肿瘤医院组织库得到的标本(储存于RNAlater中）进行研磨，按 照Trizol法抽提总RNA，进行反转录获得cDNA。以F0XM1D特异引物进行荧光定量PCR，引物序 列如下：F-primer: 5 ' -CAGGTGTTTAAGCAGCAGA-3 ' ； R-primer: 5 ' -GGTGATGGGTGTACCAAAAT- 3' J0XM1D mRNA相对表达水平根据如下公式得到：2 -AAGt( Δ Δ Ct= Δ Ct肿観-Δ (^正離或Δ Δ Ct = Δ Ct繼-Δ Ct機紐)。
[0084] 3.实验结果
[0085] 荧光定量PCR结果显示，在转移肠癌病人组织中F0XM1D的mRNA水平显著高于未转 移组(n = 24，P〈0.001)，提示了F0XMlD作为生物标志物预测肿瘤转移的应用前景（图12- l3)o
[0086]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的 技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种D型人Ml叉头蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组： (a) 具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的蛋白； (b) 将SEQ ID NO: 1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸参加的取代、缺失或添加而形成 的，且具有促进肿瘤细胞侵袭迀移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽； (c) 与SEQ ID NO: 1氨基酸序列有2 95%同源性，且具有促进肿瘤细胞侵袭迀移功能的 由（a)衍生的蛋白或多肽。2. -种核酸，其特征在于具有： (a) 如SEQ ID N0:2所示的多核苷酸序列;或 (b) 与SEQ ID N0:2所示的多核苷酸序列互补的序列。3. -种核酸，其特征在于，其编码氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白。4. 如权利要求3所述的核酸，其特征在于，该核酸具有： (a) 如SEQ ID N0:2所示的序列中845-1332位的序列;或 (b) 如SEQ ID N0:2所示的序列中1-2361位的序列。5. -种载体，其特征在于，其含有如权利要求2所述的核酸。6. -种遗传工程化细胞，其特征在于，其含如有权利要求5所述的载体。7. -种蛋白或多肽的制备方法，其特征在于，包括步骤： 1) 构建含有如权利要求5所述的载体； 2) 将构建的载体转染入宿主细胞； 3) 在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞； 4) 从培养物中分离出具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的全长蛋白或部分片段的多肽； 5) 人工合成具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的全长蛋白或部分片段的多肽。8. -种过表达或敲减具有如SEQ ID N0:2所示序列的核酸的细胞。9. 一种能与如权利要求1所述的D型人Ml叉头蛋白全长或部分片段特异性结合的抗体 或化合物。10. -种药物组合，其特征在于含有安全有效量的如权利要求1所述的D型人Ml叉头蛋 白的拮抗剂或激动剂，以及药学上可接受的载体。11. 一种用于药物测试的动物模型，其特征在于，通过基因工程方法外源性转入包含权 利要求2中的核酸并外源性表达如权利要求1所述的D型人Ml叉头蛋白。12. -种检测方法，其特征在于，检测如权利要求2所述的核酸和/或如权利要求1所述 的D型人Ml叉头蛋白在不同组织或体液中的含量。13. -种确定测试化合物或抗体是否是人F0XM1D蛋白的拮抗剂或激动剂的方法，其特 征在于，包括步骤： 1) 将测试化合物或抗体等加入体外培养细胞的培养体系作为测试组，并将体外培养的 相同细胞作为对照组，其中所述的细胞来自于哺乳动物，并且表达权利要求1所述的D型人 Ml叉头蛋白； 2) 观察测试组和对照组中细胞的迀移程度，如果测试组的细胞迀移程度大于对照组， 则表示测试化合物或抗体是F0XM1D蛋白的激动剂；如果测试组的细胞迀移程度小于对照 组，则表示测试化合物是F0XM1D蛋白的拮抗剂。14. 如权利要求1所述的D型人Ml叉头蛋白作为肿瘤、高血压、糖尿病和生殖系统相关疾 病诊断的一种标志物，以及作为肿瘤、高血压、糖尿病和生殖系统相关疾病治疗靶点进行药 物设计的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105837678SQ201610284798
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】胡维国, 张鑫
【申请人】复旦大学附属肿瘤医院