水稻GT转录因子家族基因OsGTγ-1在控制水稻耐盐性中的应用的制作方法

专利名称：水稻GT转录因子家族基因OsGTγ-1在控制水稻耐盐性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离克隆一个能够提高高盐耐受能力的 水稻GT转录因子家族基因OsGT γ -1，并通过功能验证实现其在水稻抗逆性遗传改良中的 应用。本发明利用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，分离克隆到控制水稻耐盐性的基 因OsGT γ -1，一方面通过共分离检测验证该突变体与高盐敏感表型紧密连锁，另一方面通 过超量表达OSGT Y-I基因提高了转基因水稻对高盐的耐受能力，证实了该基因的功能。
背景技术：
植物的生长发育过程不仅取决于其遗传背景，还会受到诸多环境因素的影响。植 物生长的环境并非总是适宜的，在自然界条件下，由于不同的地理位置、气候条件以及人类 活动等多方面原因，常常会造成各种对植物生长和生存不利的环境，致使植物受到伤害甚 至死亡。对农业生产来说，各种不良环境是影响作物产量和品质的最直接、最重要的因素， 也是制约许多地区农业发展的瓶颈。如何利用现代分子生物学手段研究抗逆相关基因的功 能和调控机制，利用这些基因提高作物的抗逆性从而培育出具有优良抗逆性的作物品种， 是植物功能基因组研究的重要内容，也是农业科学技术研究的主要目标之一。干旱、低温和土壤盐碱化一直是制约农作物生长发育和增产增收的主要逆境因 子。干旱可以导致植物细胞失水，造成细胞膨压完全丧失，甚至死亡；冻害可能造成植物 细胞的机械伤害，引起细胞膜的膜脂相变而失水；盐害除渗透胁迫外，同时还伴有离子毒 害，造成植物细胞内酶类的伤害、植物生长受抑制等。植物感受外界逆境信号后通过信号 转导过程调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，进而调整自身的生理状态或形态来适应不利环 境，维持基本的生存活动。植物感应到逆境胁迫后经过一系列的信号传导和转录调控，启 动下游大量与胁迫应答相关靶基因的表达，产生一些使细胞免受胁迫伤害的物质(如LEA 类蛋白、渗调蛋白、抗冻蛋白、通道蛋白等)，进而增强植物对胁迫的耐受能力(Valliyodan B, Nguyen H Τ. Understandingregulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants. Curr Opin Plant Biol, 2006，9 :189—195)。目前已经从 植物中分离克隆了数十种编码与提高逆境胁迫抗性相关蛋白的基因，根据基因编码产物的 功能，可将它们分成两大类一类是编码直接保护细胞免受逆境胁迫伤害的功能蛋白的功 能基因，包括一些编码膜蛋白(如水通道蛋白、转运子)的基因；细胞质和叶绿体中的一 些蛋白酶基因；编码大分子保护蛋白(如分子伴侶、LEA蛋白)的基因；编码渗透调节物质 (如脯氨酸、甜菜碱、糖醇等)合成酶的基因；编码毒性物质降解酶(如谷胱甘肽S转移酶、 超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及抗坏血酸过氧化物酶等)的基因。人们将与提高逆境胁迫 抗性相关的功能基因进行遗传转化，使转基因植物的抗逆性有了不同程度的提高。另一类 是逆境胁迫下信号传导及转录调控有关的基因，包括抗逆相关的转录因子基因(bZIP转 录因子、WRKY转录因子、MYC、MYB类及DREB类转录因子等)；感应及转导胁迫信号的蛋白激 酶(MAPK、CDPK、S6K、受体蛋白激酶、核糖体蛋白激酶等)；信号传导中起重要作用的蛋白酶(如磷酸酯酶、磷脂酶C等)。 传统育种实践表明，想通过品种间和种间杂交等传统遗传育种手段提高作物对 逆境胁迫的抗性很难奏效，利用单个功能基因来对作物的抗逆性进行改良也难以获得理 想的效果。近年来发现一些逆境相关的转录因子可以调控多个逆境相关基因的表达，利 用转录因子可以有效实现对植物抗逆性的改良。转录因子是指能够与基因启动子区域中 顺式作用元件发生特异相互作用的DNA结合蛋白，也称反式作用因子，能够通过它们之间 以及与其它相关蛋白之间的相互作用在mRNA转录水平上实现对基因的表达调控(Xiong 等.Transcription factors in rice :a genome-wide comparative analysis between monocots and eudicots. Plant Mol Biol，2005，59 :191_203)。实践证明，在植物体内对 某些转录因子基因进行超量表达能够有效提高植物对非生物胁迫的耐受能力。例如超表 达DREBlA的转基因拟南芥可表现出对干旱、高盐和冻害的抗性，而对DREB2A进行超表达 能在非胁迫条件下诱导低温胁迫相关基因的表达，并能提高转基因植株对低温胁迫的耐 受性(Liu 等，Two transcription factors，DREBl and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separatetwo cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell，1998，10 :1391_1406)。Tsil(Park 等，Overexpression of the tobacco Tsilgene encoding an EREBP/AP2~type transcription factor enhances resistance against pathogen attack and osmoticstress in tobacco. Plant Cell，2001，13 1035-1046)Λ 番茄JERFl以及JERF3在转基因烟草中的超表达能提高烟草的耐盐性(Wang等，Ectopic overexpression of tomato JERF3 in tobacco activates downstream geneexpression and enhances salt tolerance.Plant Mol Biol,2004,55 :183-192 ;Zhang 等，The ethylene-, jasmonate-, abscisic acid—and NaCl-responsive tomato transcription factor JERFl modulates expression of GCCbox-containing genes and salt tolerance in tobacco. Planta，2004，220 :262-270)。在水稻中超量表达SNACl基因显著提高了 转基因植株的抗旱性和耐盐性(Hu等，Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC(NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103 :12987-12992)。由于转录因子的超量表达能够激活 多个与同类性状相关的基因的表达，因此与导入或改良个别功能基因来提高作物某种抗性 的传统方法相比，对关键的转录因子进行改良或增强其调控能力，可以通过调控一个转录 因子而激活多个功能基因发挥作用，为作物抗逆性分子育种提供更为有效的方法和途径。作为一种重要的粮食作物和模式植物，水稻品质的改良和产量的提高一直是人们 努力的目标。通过研究水稻中与逆境相关的转录因子从而提高水稻抗逆性是培育抗逆水稻 品种的一条有效途径。在我们的前期研究中分离到一个受多种逆境诱导的基因，序列分析 表明它属于植物特有的一类转录因子GT家族的成员。已有的研究表明这个家族的成员参 与包括植物光应答在内的一些生理反应，并能与相应GT元件特异结合或与其它转录因子 之间发生相互作用从而实现对多种不同基因的转录调控。水稻GT-2和拟南芥GT-I可在体 内激活转录(Le等，Transcriptional activation by Arabidopsis GT-I may be through interaction withTF II A-TBP-TATA complex. Plant J. 1999，18:663_668 ;Ni 等，GT-2 : in vivo transcriptional activation activityand definition of novel twin DNAbinding domains with reciprocal target sequence selectivity. Plant Cell. 1996, 8 :1041-1059)，拟南芥 PTL 参与调节花器官的发育(Brewer 等，PETAL LOSS, a trihelix transcription factor gene, regulates perianth architecture in the Arabidopsis flower. Development. 2004，131 :4035_4045)，但这个家族是否参与植物的逆境应答尚无报 道。因此。从水稻中分离克隆该家族的基因并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能， 对于培育抗逆水稻新品种具有十分重要的意义。

发明内容
本发明的目的在于从水稻中分离克隆一个包含该功能蛋白同源基因完整编码区段的DNA片段(在本发明中所述“DNA片段”与“核苷酸序列”同义，下同)，利用这个基因 提高水稻对高盐胁迫的耐受能力，实现该基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用。对这个基 因编码的蛋白序列进行分析表明它与拟南芥中的GT-3a和GT-3b蛋白有一定的同源性，系 统进化分析的结果表明该基因属于GT转录因子家族中一个新的亚家族GT γ中的成员，因 此被命名为OsGTy-I基因。本发明涉及分离和应用一种包含OsGT γ -1基因的DNA片段，该片段赋予植物对高 盐胁迫耐受性增强的能力。其中，所述的OsGT Y-I基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQ NO 1中第475-1707位所示的DNA序列；或2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列；或3) 1)和2)所包含的亚片段。可以采用已经克隆的OsGT γ -1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本 发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因 组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsGT γ -1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同 源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsGT γ-1基因的序列，将这一序列与任何 一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得耐盐性增强的转基因 植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一 种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅 读框相同，以保证整个序列的翻译。携带有本发明OsGT γ -1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接 DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition)。可使用包括本发明的OSGTY-I基因的表达载体转化的宿主是包括水稻在内多种 植物，培育耐盐的植物品种。本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱 导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提 高植物对高盐胁迫的抗性。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。


序列表SEQ ID NO :1显示的是本发明分离克隆的包含有OsGT Y-I基因编码区的 核苷酸序列。图1 采用MrBayes 3. 0版软件(公开使用软件)依据水稻和拟南芥中GT家族成 员和部分其他植物物种中已报道的GT因子蛋白序列进行系统进化分析的结果。图2(包含图2a-图2c)用Real-time PCR检测OsGT γ _1基因在各种逆境胁迫 条件下、水稻不同组织中和在不同激素处理下的表达水平。4种非生物逆境胁迫依次是S， 高盐；D，干旱；C，低温；w，伤害。高盐、干旱、低温胁迫取样时间点为0、1、3、6小时，伤害胁 迫取样时间点为0、1、10、30分钟。13个组织器官依次是1，分蘖期的根；2，拔节期的茎；3， 4叶期的叶片；4叶期的叶鞘；5，穗(0. 5-lcm) ；6，穗(3-5cm) ；7，穗(大于IOcm) ；8，开花前 的穗顶端分生组织；9，雄蕊；10，雌蕊；11，发芽1天的苗；12，发芽3星期的苗；13 ；3星期的 黄花苗。7种激素处理依次是A，脱落酸(ABA) ；I，生长素(IAA) ；G，赤霉素(GA) ；K，细胞分 裂素(KT) ;J，茉莉酸(JA) ；E，乙烯利(Eth) ；S，水杨酸(SA)。喷施激素处理的浓度分别为 26. 43mg/L、10mg/L、40mg/L、100mg/L、21. 03mg/L、43. 35mg/L、138. 12mg/L，处理后按不同时 间点取样，ABA、IAA、GA、KT激素处理取样时间点为0,0. 5、1、3小时，JA、Eth、SA激素处理 取样时间点为0、1、2、4小时。图3 :0sGT Y-I蛋白的亚细胞定位结果。OsGTy-I :GFP融合载体和pU1391GFP空 载体分别转化水稻，在激光共聚焦显微镜下对转基因植株的根进行观察。G，GFP荧光图像； PI，用碘化丙啶染色的荧光图像；M，合成图像。图4(包含图4a-图4e)水稻osgt Y-I突变体的鉴定。a，突变体中T-DNA插入 位置示意图；b，根据插入位点设计引物验证共分离的PCR结果。F表示在插入位点上游设 计的引物，R表示在插入位点下游设计的引物，VP表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在 T1代植株中，纯合突变体只有R和VP配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入F与R配对的 产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有F和R配对可以得 到产物，杂合植株则R和VP配对以及F和R配对时都可以扩增得到产物。其中泳道3，4， 13，15，18 为 T-DNA 纯合；1，2，5，6，7,9,10，11，12，14，16，17 为 T-DNA 杂合；8，9 为 T-DNA 阴 性；c，用Real-time PCR检测正常生长条件和高盐胁迫下OSGT γ _1基因在5个纯合突变体 家系(Μ1-Μ5)和野生型对照家系(CK)中的表达水平；d，正常生长条件和150mM NaCl高盐 胁迫下一周后5个纯合突变体家系(M1-M5)和野生型对照家系(CK)的生长情况；e，正常生 长条件和150mM NaCl高盐胁迫下一周后5个纯合突变体家系(M1-M5)和野生型对照家系 (CK)地上部分长度统计结果。图5(包含图5a_图5d)超量表达OsGT γ _1基因能够提高转基因植株的耐盐性。 a, OsGTy-I基因超量表达载体构建示意图；b，用Real-time PCR检测OsGT γ _1基因在5 个独立超量表达转基因家系(01-05)和野生型对照家系(CK)中的表达水平；c，正常生长条 件和150mMNaCl高盐胁迫下一周后5个超量表达家系(01-05)和野生型对照家系(CK)的 生长情况；d，正常生长条件和150mM NaCl高盐胁迫下一周后5个超量表达家系(01-05)和 野生型对照家系(CK)地上部分长度统计结果。图6 超量表达实验所用PCB2004H载体图。图7 亚细胞定位实验所用pU1391cGFP载体图。
具体实施例方式OsGT Y -1基因的全长cDNA是从日本水稻全长数据库(http //cdnaOl. dna. affrc.go.jp)中J013022H04质粒中扩增所得。OsGT γ-1是一个抗逆相关基因。主要依 据有以下几个方面(1)利用Real-time PCR方法对其进行逆境条件下的表达谱分析(图 2a)，发现在胁迫处理(干旱、高盐、低温胁迫和ABA处理)的过程中，OsGTY-I的表达量明 显上升。组织表达谱分析结果(图2b)表明OsGT γ -1在不同组织中均有一定程度的表达， 在叶片、叶鞘和幼穗中的表达量较高。(2)通过生物信息学方法预测该基因是水稻GT转录 因子家族的成员，OsGT Y-I蛋白的亚细胞定位分析表明其定位于细胞核中(图3)。(3)该 基因的T-DNA插入水稻突变体中OsGT γ -1表达受到抑制，纯合突变体对高盐胁迫的敏感性 增强(图4)。(4)将其全长基因在水稻中超量表达，转基因植株对高盐胁迫的耐受能力大 大增强(图5)。这些结果都表明OsGT γ -1基因是一个逆境相关调控基因，参与植物对逆境 的调控。以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆 包含有OsGT γ -1基因完整编码区段的DNA片段以及验证OsGT γ -1基因功能的方法。根据 以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本 发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条 件。实施例1 对水稻GT家族进行生物信息学分析并分离克隆包含有OSGT γ _1基因 区段的DNA片段基于已报道的植物GT 蛋白质序列在 NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih. gov), TIGR(The Institute for Genomic Research, http://www. tigr. org)禾口 TAIR(TheArabidopsis Information Research, http://www. arabidopsis. org)数据库中进行BLAST搜索的结果，收集GT转录因子家族成 员序列，手动除去重复序列。采用MrBayes 3. O版软件(公开使用软件)对水稻和拟南芥中 GT家族成员和部分其他植物物种中已报道的GT因子蛋白序列进行系统进化分析(结果见 图1)，结果发现亚家族GT γ中的成员均尚未被报道过，挑选这个亚家族中的成员OsGT γ -1 作为研究对象。该基因对应日本水稻全长数据库(http://Cdna01. dna. affrc. go. jp)中的 cDNA克隆J013022H04(登录号为AK065397)。根据该克隆序列，设计引物0E07F(5' -GTTG GTACCAGGTTTTTAGGCGTGG-3 ‘，序列特异引物外加接头 KpnI 位点)和 0E07R(5 ‘ -GAACTGCA GTGACCGATTGCAGTTAG-3'，序列特异引物外加接头PstI)，将该克隆的序列从日本水稻全长 数据库(http://cdna01. dna. affrc. go. jp)中的 cDNA 克隆 J013022H04 质粒中扩增出来。 扩增产物对应本发明中SEQ ID NO 1显示序列的391-1850bp。PCR反应条件为94°C预变 性 3min ；94°C 40sec，55°C 40sec，72°C 2min，32 个循环；72°C延伸 IOmin0 将扩增获得的 PCR 产物连入pGEM -T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因， 该克隆命名为pGEM-OsGT Y-I0 本发明所涉及的序列来源于NCBI(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)， TIGR(http://www. tigr. org), KOME(http://cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/),定位的基 因的位置信息以 “TIGR Rice Annotation Release 5” 为准。
实施例2 分析水稻内源基因OSGT γ -1的组织和逆境表达谱
以水稻品种“珍汕97” ( 一个中国大面积公开推广应用的水稻品种)为材料，在3 叶期分别进行干旱、冷害和高盐胁迫以及伤害处理。干早处理是将幼苗断水，高盐胁迫是将 幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中，低温处理是将幼苗置于4°C生长箱，在0、1、3、和6 小时四个时间点取样，伤害胁迫取样时间点为0、1、10、30分钟。喷施激素处理所用的7种 激素依次是A，脱落酸(ABA) ；I，吲哚乙酸(IAA) ；G，赤霉素(GA3) ；K，细胞分裂素(KT) ;J， 茉莉酸(JA) ；E，乙烯利(Eth) ；S，水杨酸(SA)。浓度分别为:26.43mg/L、10mg/L、40mg/L、 100mg/L、21. 03mg/L、43. 35mg/L、138. 12mg/L，处理后按不同时间点取样，ABA、IAA、GA、KT 激 素处理取样时间点为0、0. 5、1、3小时，JA、Eth、SA激素处理取样时间点为0、1、2、4小时。总 RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明 书)。由于该基因本底表达较低，表达谱分析是利用Real-time PCR完成的，利用反转录酶 SSII(购自Invitrogen公司)将RNA样品反转录合成cDNA第一链(方法根据反转录酶试剂 说明书)，反应条件为65°C5min，42°C50min，70°C lOmin。利用反转录酶(购自Invitrogen 公司)。以上述反转录合成的cDNA为模板，利用引物H04F 5，-ATCTGGTGGTCCAACTGCTGA-3， 和 H04R :5，-CGGCGTTT-TTCAAGTCGAAT-3，扩增 OsGT Y _1 基因特异片段，以 OsActinl 基因作为内对照(利用弓丨物 ActinlF :5，-TGGCATCTCTAGCACATTCC-3，和 ActinlR 5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’扩增OsActinl基因特异片段)进行荧光实时相对定量分 析。反应条件为95°C 5min ；95°C 10sec，60°C 5sec，72°C 34sec，45 个循环。结果表明，本 发明克隆的基因OsGTY-I能被干旱、高盐、低温和ABA诱导表达，但不受伤害胁迫和其它 激素处理诱导(如图2a和图2c所示)，是一个受逆境诱导的转录因子。以水稻品种“明恢 63”(一个中国大面积公开推广和应用的水稻品种)为材料，提取不同生长时期的组织的 RNA用Reai-time PCR检测OsGT γ -1基因的表达水平。选取的13种组织器官分别是1，分 蘖期的根；2，拔节期的茎；3，4叶期的叶片；4叶期的叶鞘；5，穗(0. 5-lcm) ；6，穗(3-5cm)； 7，穗(大于IOcm) ；8，开花前的穗顶端分生组织；9，雄蕊；10，雌蕊；11，发芽1天的苗；12， 发芽3星期的苗；13 ；3星期的黄花苗。结果表明=OsGTY-I基因在所选取的组织中均有一 定量的表达，但以叶片、叶鞘和幼穗中的表达量较高(如图2b所示)。实施例3 =OsGTy-I蛋白的亚细胞定位利用水稻稳定转化体系，我们将包含预测为OsGTY-I核定位序列的cDNA片段 同报告基因GFP融合，通过玉米里的一个强启动子Ubiquitin的驱动在水稻植株中表达， 对阳性转基因植株的根在激光共聚焦显微镜下进行观察的结果说明OsGTY-I蛋白定位 于细胞核内(如图3所示)。融合载体构建方法如下0sGTY-1部分cDNA序列(对应除 去3'-末端5个氨基酸和终止密码子的编码区序列)通过引物5' -CTAGGTACCGAGCTT CTCTTTGGAATTTGTG-3‘(序列特异引物外加接头 KpnI 位点)和 5' -TAACCCGGGCTTTGGTT TGATACCCATCTC-3 ‘(序列特异引物外加接头SmnaI位点)进行PCR扩增，产物对应本发 明中SEQ ID NO :1显示序列的391-1850bp。以日本水稻全长数据库Knowledge-based OryzaMolecular biological Encyclopedia (http://cdna01. dna. affrc. go. jp)中该基 13 对应的cDNA克隆J013022H04(登录号AK065397)质粒为模板扩增获得目的片段。PCR反 应体系为质粒DNA模板0. 3μ 1(约lOOng)，IOmM引物各1 μ 1，IXrTaq聚合酶反应缓冲 液(购自 TaKaRa 公司)，25mM MgCl2 5 μ 1，IOmM dNTP 1 μ 1，rTaq 聚合酶(5U/ μ 1)(购自TaKaRa 公司)0· 25 μ 1，加 ddH20 至 50 μ 1。PCR 反应条件为94°C预变性 3min ；94°C 40sec, 50°C 40sec, 72°C 2min, 32 个循环；72°C延伸 lOmin。通过 KpnI 和 SmaI 将 OsGT γ -1 的上述 cDNA序列酶切纯化后连接到常用于植物蛋白亚细胞定位的载体pU1391cGFP(由华中农业 大学作物遗传改良国家重点实验室已毕业的代明球博士改造，载体图见图7)中的GFP报告 基因前面，转化大肠杆菌DHlO β (菌株购自Irwitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获 得转化载体。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(如下述具体步骤)将以上载体 (PU1391cGFP-0sGTy-l)导入到水稻品种中花11 (中国水稻研究所提供的一个公开使用的 水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、 移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人 艮 白勺方夕去(Hiei等,Efficient transformation ofrice,Oryza sativa L. ,mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J,6 271-282,1994)基础上改良进行(如下述具体步骤)。
具体遗传转化步骤如下(1)愈伤组织诱导将成熟的水稻种子中花11 (中国水稻研究所提供的一个公开 使用的水稻品种)去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯化汞(HgCl2)种子 表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见 后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25士 1°C。(2)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分 见后)上黑暗下培养2周，温度25士 1°C。(3)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗 下培养2周，温度25士 1°C。(4)农杆菌培养在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌 EHA105 (来源于CAMBIA，商用菌株)两天，培养温度28°C ；将所述的农杆菌转移至悬浮培养 基(成分见后)里，28°C摇床上培养2-3小时。(5)农杆菌侵染将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液 至OD6J). 8-1. 0 ；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干； 然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20°C。(6)愈伤洗涤和选择培养灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧 苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培 养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次 以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。(7)分化将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转 移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照下培养，温度26°C。(8)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3 周，温度26°C。(9)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初 的几天保持水分湿润。培养基组分及其配方(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin， 羧节青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)； IAA(Indole-3-acetic acid,喷哚乙酸)；2，4-D (2，4-Dichlorophenoxyaceticacid， 2，4- 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁 香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲 基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)； MSmix (MS微量成分溶液)。 (2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(IOX)]的配制硝酸钾(KNO3)28. 3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4. Og硫酸铵((NH4)2SO4)4. 63g硫酸镁(MgSO4· 7H20)1. 85g氯化钙(CaCl2· 2H20)1. 66g逐一溶解，然后室温下定容至IOOOml。2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制碘化钾(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸锰(MnSO4· 4H20)0. 44g硫酸锌(ZnSO4· 7H20)0. 15g室温下溶解并定容至1000ml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H20) 3. 73 克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制烟酸(Nicotinic acid)0. Ig维生素Bl (Thiamine HCl)0. Ig维生素B6(Pyridoxine HCl) 0. Ig甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存备用。5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制硝酸铵(NH4NO3)16. 5g硝酸钾19. Og磷酸二氢钾1.7g硫酸镁3. 7g氯化钙4. 4g室温下溶解并定容至1000ml。6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
碘化钾0. 083g硼酸0. 62g硫酸锰0. 86g钼酸钠(Na2MoO4· 2H20)0. 025g硫酸铜(CuSO4· 5H20)0. 0025g室温下溶解并定容至1000ml。7) 2,4-D贮存液，6_BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液均为lmg/mlο8)葡萄糖贮存液0· 5g/ml。9) AS 贮存液的配制秤取 AS 0. 392g，DMSO 10ml。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)愈伤组织诱导培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素C存液(100X)IOml2，4_D 贮存液2.5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0. 6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素贮存液(100X)IOml2，4_D 贮存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基N6max 母液(IOX)12. 5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2. 5ml
维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 15g蔗糖5g琼脂粉(Agarose)1. 75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热熔解培养 基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ 1 AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 2g蔗糖5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热熔解培养 基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ 1 AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基N6max 母液(IOX)5mlN6mix 母液(100X)0.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)0.5ml维生素贮存液(100X)Iml2，4-DC存液0.2mlCH0. 08g蔗糖2g加蒸馏水至IOOml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口灭菌。使 用前加入Iml葡萄糖贮存液和100 μ 1 AS贮存液。6)选择培养基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.625mlCH0. 15g蔗糖7. 5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前熔解培养基，加入250 μ 1HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml6-BA 贮存液0.5mlKT C存液0.5mlNAA C存液50 μ 1IAA C存液50 μ 1CH0. 15g蔗糖7. 5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。使用前熔解培养基， 加入250 μ 1 HN和200ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/皿)。8)分化培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素贮存液(100X)IOml6-BA 贮存液2mlKT C存液2mlNAA C存液0.2mlIAA 贮存液0.2mlCHIg蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。9)生根培养基MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)5ml维生素贮存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分装到 生根管中(25ml/管)，封口灭菌。10) LA 培养基 LB (pH 7. 0) IL
TryptoneIOgYeast extracts5gNaClIOg琼脂粉15g加蒸馏水定容至1000ml，封口灭菌。使用前熔解培养基，加入相应抗生素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。实施例4 鉴定OSGT γ -1水稻T-DNA插入突变体为研究OsGTy-I的功能，用该基因的基因组序列(包含其启动子区IOOObp)在 华中农业大学室作物遗传改良国家重点实验室的水稻突变体数据库(http://rmd. ncpgr. cn/，一个向国内外公开开放的公共数据库，数据库所涉及的水稻突变体材料公众可以向持 有人中国湖北省武汉市的华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室免费索取)中进行 BLAST检索，发现了一个水稻T-DNA插入突变体(03Z11BT07)。本发明所涉及的序列来源 T NCBI(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/), TIGR(http://www. tigr. org), KOME(http:// cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以 “TIGR Rice Annotation Release 5” 为准。根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，可以确定插入位点，在插入位点的两边 设计一对引物F和R，及T-DNA上设计一条引物VP，如图4a，F表示在插入位点上游设计 的引物，R表示在插入位点下游设计的引物，VP表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在 T1代植株中，T-DNA纯合植株只有R和VP配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入F与R 配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有F和R配 对可以得到产物，杂合植株则R和VP配对以及F和R配对时都可以扩增得到产物。根 据插入位点设计的引物序列为F (引物)5 ‘ -GGCACGTCATGGTTGGTAC-3 ‘，R (引物) 5' -AACAAAAGCGGCGGTAATG-3‘，VP(弓丨物)5' -AATCCAGATCCCCCGAATTA-3‘。PCR 反应 体系为水稻突变体小样DNA模板0. 5 μ 1 (约50ng)，IOmM引物各0. 2 μ 1，1 XrTaq聚合酶 反应缓冲液，25mM MgCl2 2 μ 1, IOmM dNTP 0· 2 μ 1，rTaq 聚合酶(5U/μ 1) 0. 1 μ 1，加 ddH20 至 20 μ 1。反应程序为94°C 3min ；94°C 40sec,55°C 40sec,72°C lmin，30 个循环；72°C延 伸IOmin0 PCR结果如图4b所示，其中泳道3，4，13，15，18为T-DNA纯合；1，2，5，6，7，9， 10，11，12，14，16，17为T-DNA杂合；8，9为T-DNA阴性。结果表明T_DNA(左边界)插入在 OsGT γ -1基因的启动子区(离转录起始位点约500bp)。选取5个已鉴定基因型的纯合突变体家系和野生型家系进行高盐胁迫实验。利用 Real-time PCR的方法检测正常条件下和高盐胁迫条件下纯合突变体家系和野生型家系中 OSGTy-I基因的表达量，结果表明OSGTy-I基因在纯合突变体中的表达均受到抑制(如 图4c所示)。高盐胁迫实验具体步骤如下将纯合突变体家系和野生型家系种子去壳消毒 (75 %酒精处理3min，0. 15 %氯化汞处理IOmin，无菌水清洗5次)，在MS培养基上发芽，2-3 天后挑选发芽好且长势一致的种子分别转移到含有Ommol/L和150mmol/L的NaCl的MS培 养基上，在光照培养室生长7-8天后观察表型和测量植株的株高。每个家系的每种处理不 少于15棵植株，实验设置3次重复。结果表明纯合突变体植株在正常条件下的生长与对 照没有明显差异，但纯合突变体植株在高盐胁迫处理条件下的生长显著(t测验P < 0. 05) 劣于对照，说明抑制OSGT γ -1基因的表达会使植株对高盐胁迫的敏感性增强(见图4)。该实验设置的3次生物学重复结果一致，说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。为了验 证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代即T2代。将T1代收获的 种子播种得到T2代纯合，杂合和野生型种子。同样进行上述胁迫实验，结果一致。实施例5 =OSGT γ -1基因超量表达载体的构建、转化及转基因植株耐盐性型鉴定为了更好地阐明OSGTy-I基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达，由转基因 植株的表型研究该基因的功能。
超量表达载体构建方法如下首先通过查找日本水稻全长数据库 Knowledge-based Oryza Molecularbiological Encyclopedia(http//cdnaOl. dna. affrc. go. jp)，找到其所对应的cDNA克隆J013022H04 (登录号AK065397)，并购买其全长 cDNA。以该全长 cDNA 为模板，用引物 0E07F(5' -GTTGGTACCAGGTTTTTAGGCGTGG-3 ‘，序列 特异引物外加接头 KpnI 位点)和 0E07R(5 ‘ -GAACTGCAGTGACCGATTGCAGTTAG-3 ‘，序列特 异引物外外加接头PstI)扩增出包含OSGT Y-I全长的DNA片段。PCR反应条件为94°C 预变性 3min ；94°C 40sec，50°C 40sec，72°C 2min，32 个循环；72°C延伸 IOmin0 将该扩增片 段亚克隆到pGEM -T载体(购于Promega公司)上，筛选阳性克隆并进行测序验证，再用引 物 ALLF(5‘-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AAT ACG ACT CACTAT AGG G) 禾口 ALLR (5‘ -GGG GAC CAC TIT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TTT AGG TGA CAC TATAG)从 带有该片段的pGEM -T载体上扩增出一条可供重组到pCB2004H载体上的片段，PCR条件 同上。按Invitrogen公司提供的重组克隆试剂盒说明书进行重组反应后转化大肠杆菌 DHlO β (大肠杆菌DHlOii菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转 化载体。PCB2004H是已公开发表的用于超量表达载体构建的载体(Hou等，A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cellviability and stress tolerance, Proc Natl Acad Sci USA，2009，106 :6410_6415)(载体图见图 6)。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(如下述具体步骤)将上述超量表达载体 (pCB2004H-0SGT γ -1)导入到水稻品种中花11 (中国水稻研究所提供的一个公开使用的水 稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗、移 栽，得到转基因植株。具体遗传转化步骤同实施例3中所述。本实施例利用Real-time PCR的方法鉴定Ttl代转基因植株中OSGT γ _1基因的表 达量，选取了 5个OSGT Y-I超量表达T2家系(如图5b所示)进行高盐胁迫实验。具体步 骤如下将超量表达转基因家系和野生型家系种子去壳消毒(75%酒精处理3min，0. 15% 氯化汞处理lOmin，无菌水清洗5次)，在含有50mg/L潮霉素的MS培养基上发芽，野生型对 照家系晚一天播于不含潮霉素的MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子分别 转移到含有Ommol/L和150mmol/L的NaCl的MS培养基上，在光照培养室生长7_8天后观察 表型和测量植株的株高。每个家系的每种处理不少于15棵植株，实验设置3次重复。结果 表明在正常条件下OSGTy-I超量表达转基因植株的生长与对照没有明显差异，但在高盐 胁迫处理下生长要显著(t测验P<0.01)优于对照(图5)，说明本发明的OSGTY-I基因 的表达可以缓解高盐胁迫造成的植株生长受阻，增强转基因植物对高盐胁迫的耐受性(如 图5)。序列表<110>华中农业大学
<120>水稻GT转录因子家族基因OsGT γ _1在控制水稻耐盐性中的应用<130><141>2009-12-15<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1998<212>DNA<213> 水稻(Oryza sativa)<220><221>gene<222>(1). . (1998)<223><220><221>CDS<222>(475). . (1707)<223><400>1gattcttcct ttctctgtgt ttgtttgttt ccagttgcca ctaaccagcc agagccccgg 60gggggagaag agcgagagag gaggagaaat cttgcagcaa tccctcgctt agattcgcca 120ttaccgccgc ttttgttccc accaagatta ccaccccctc ctcctcctgt gctcgagcgc 180tcgcatcgca tttcaggctg cttcttgatt ctgcgaggag gttgaaatct ctcgtgattg 240caacagctgc catccgttcg ttccggtgga gtgcacccct tcatcaccaa ggaggagaaa 300aagctgtaat cttcggccgt ttctgccttt ctgcagcaaa cggttgaaga aaagccgcgt 360cttttgggcg gatttcgcgg aggccgcttg aggtttttag gcgtggttcg tgtgagcttc 420tctttggaat ttgtggggga aagagtgagg gagggaggga gctcagtggg agag atg 477Met1gag ggg aat ttg ccg ccg aga gga gcc ctt gtc cat ggc cat ggc ggc 525Glu Gly Asn Leu Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val His Gly His Gly Gly51015ggc gtc ggc gcc ttc gat ctg gag gcg acg atg cag ccg ccg ccg ccg 573Gly Val Gly Ala Phe Asp Leu Glu Ala Thr Met Gln Pro Pro Pro Pro202530ttc cac ttc gcc cag gat ccg cac ctc cac cac cac cag ggc atg gtc 621Phe His Phe Ala Gln Asp Pro His Leu His His His Gln Gly Met Val354045ccc gtc cgc ggg aac ccg atg ctg gat ttg ggc aat gtg gtc aag acc 669Pro Val Arg Gly Asn Pro Met Leu Asp Leu Gly Asn Val Val Lys Thr
50556065tcg ccg age gac gag gag gac gtg gat gac ggc cac cac cat ggt ggc 717Ser Pro Ser Asp Glu Glu Asp Val Asp Asp Gly His His His Gly Gly707580ggc ggc ggc age ggt aag gag gcc tcc cag tgg cac egg gtg aag tgg 765Gly Gly Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ser Gln Trp His Arg Val Lys Trp859095ate agt ggc atg gtc aag ctg ctg gtg tcc gcc gtg gcc tac ate gac 813lie Ser Gly Met Val Lys Leu Leu Val Ser Ala Val Ala Tyr lie Asp100105110gag gac gtc gac atg gac tac ggc acg ggc age gcc gcg agg agg aag 861Glu Asp Val Asp Met Asp Tyr Gly Thr Gly Ser Ala Ala Arg Arg Lys115120125cac gcc atg ctg aag agg aag ggg aag tgg agg ctc gtc tcc gcg gcg 909His Ala Met Leu Lys Arg Lys Gly Lys Trp Arg Leu Val Ser Ala Ala130135140145atg acc gag agg ggc ttc ccg gtg tcg ccg cag cag tgc gag gac aag 957Met Thr Glu Arg Gly Phe Pro Val Ser Pro Gln Gln Cys Glu Asp Lys150155160ttc aac gat ctc aac aag agg tac aag agg atg acc gag ate ctt ggc 1005Phe Asn Asp Leu Asn Lys Arg Tyr Lys Arg Met Thr Glu lie Leu Gly165170175egg gga acg gcg tgc cag gtc gtc gag cac ccc gag ctt ctt gag ggg 1053Arg Gly Thr Ala Cys Gln Val Val Glu His Pro Glu Leu Leu Glu Gly180185190atg egg ctc tcg gga aag ctc aaa gag gag get agg aag cac ctg aac 1101Met Arg Leu Ser Gly Lys Leu Lys Glu Glu Ala Arg Lys His Leu Asn195200205tea aag cat ctg cac tat gag gag atg tgc tcg tac cat aac agg aac 1149Ser Lys His Leu His Tyr Glu Glu Met Cys Ser Tyr His Asn Arg Asn210215220225aaa atg tgt ctg ttt gat gat ccc gcc ctt cag aag tea ttg cgt ttg 1197Lys Met Cys Leu Phe Asp Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Leu Arg Leu230235240gcg ctt agg agt gga gag gag cgt gca aag aag aac ccg ttt ggg tat 1245Ala Leu Arg Ser Gly Glu Glu Arg Ala Lys Lys Asn Pro Phe Gly Tyr245250255gat gat gag gat ttt tct gac gat gac gac gaa gat gaa gaa ttc gat 1293Asp Asp Glu Asp Phe Ser Asp Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Phe Asp
260265270gat ctg gag gtc age get gaa gat cat cac cat gga att cat ggt gcc 1341Asp Leu Glu Val Ser Ala Glu Asp His His His Gly lie His Gly Ala275280285aag agg ctg aag cat gat cag gag gag acg cat ttt ggg tct aat ctg 1389Lys Arg Leu Lys His Asp Gln Glu Glu Thr His Phe Gly Ser Asn Leu290295300305tea gaa gtt get gtt att gac atg aac aaa atg ctc tct gag gga tct 1437Ser Glu Val Ala Val lie Asp Met Asn Lys Met Leu Ser Glu Gly Ser310315320ggt ggt cca act get gaa aag agt ccc tct acc cct ggt atg cgt gat 1485Gly Gly Pro Thr Ala Glu Lys Ser Pro Ser Thr Pro Gly Met Arg Asp325330335att cga ctt gaa aaa cgc cgc ctg aag ate aaa get cag atg ctg aaa 1533lie Arg Leu Glu Lys Arg Arg Leu Lys lie Lys Ala Gln Met Leu Lys340345350att gag cag aag cat ttc aag tgg ctg agg ttc age aag gag aag gac 1581lie Glu Gln Lys His Phe Lys Trp Leu Arg Phe Ser Lys Glu Lys Asp355360365agg gaa ttg gag aag atg aga ctg gag aat gaa aag atg aaa ctg gag 1629Arg Glu Leu Glu Lys Met Arg Leu Glu Asn Glu Lys Met Lys Leu Glu370375380385aat gag egg ttg gaa ttg gag ctg aag ctt aaa gaa ata gag atg ggt 1677Asn Glu Arg Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Glu lie Glu Met Gly390395400ate aaa cca aag aag att ttt agt gat tga agccttggaa tgatagaact1727lie Lys Pro Lys Lys lie Phe Ser Asp405410agaaatggtt agagttgctg gtgatccttt tgtcttttgc aggagcttgc agatttaggg 1787tcttatatat acattgatct gtgcccctgt ttgaatttta ccttagctaa ctgcaatcgg 1847tcaagtgaat ggctattcca gttgttaagt gtttaaactt ggtactagtt ggcctttcaa 1907atgataaatg tttaagccgt ccttgtacat gcctgctgtt aactttctgc agttgtttgt 1967gtgttgctat tgacctctga gtcttttttt t1998<210>2<211>410<212>PRT<213>7jC稻(Oryza sativa)<400>2Met Glu Gly Asn Leu Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val His Gly His Gly
151015Gly Gly Val Gly Ala Phe Asp Leu Glu Ala Thr Met Gln Pro Pro Pro202530Pro Phe His Phe Ala Gln Asp Pro His Leu His His His Gln Gly Met354045Val Pro Val Arg Gly Asn Pro Met Leu Asp Leu Gly Asn Val Val Lys505560Thr Ser Pro Ser Asp Glu Glu Asp Val Asp Asp Gly His His His Gly65707580Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Glu Ala Ser Gln Trp His Arg Val Lys859095Trp lie Ser Gly Met Val Lys Leu Leu Val Ser Ala Val Ala Tyr lie100105110Asp Glu Asp Val Asp Met Asp Tyr Gly Thr Gly Ser Ala Ala Arg Arg115120125Lys His Ala Met Leu Lys Arg Lys Gly Lys Trp Arg Leu Val Ser Ala130135140Ala Met Thr Glu Arg Gly Phe Pro Val Ser Pro Gln Gln Cys Glu Asp145150155160Lys Phe Asn Asp Leu Asn Lys Arg Tyr Lys Arg Met Thr Glu lie Leu165170175Gly Arg Gly Thr Ala Cys Gln Val Val Glu His Pro Glu Leu Leu Glu180185190Gly Met Arg Leu Ser Gly Lys Leu Lys Glu Glu Ala Arg Lys His Leu195200205Asn Ser Lys His Leu His Tyr Glu Glu Met Cys Ser Tyr His Asn Arg210215220Asn Lys Met Cys Leu Phe Asp Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Leu Arg225230235240Leu Ala Leu Arg Ser Gly Glu Glu Arg Ala Lys Lys Asn Pro Phe Gly245250255Tyr Asp Asp Glu Asp Phe Ser Asp Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Phe260265270Asp Asp Leu Glu Val Ser Ala Glu Asp His His His Gly lie His Gly275280285Ala Lys Arg Leu Lys His Asp Gln Glu Glu Thr His Phe Gly Ser Asn290295300Leu Ser Glu Val Ala Val lie Asp Met Asn Lys Met Leu Ser Glu Gly305310315320.
Ser Gly Gly Pro Thr Ala Glu Lys Ser Pro Ser Thr Pro Gly Met Arg325330335Asp lie Arg Leu Glu Lys Arg Arg Leu Lys lie Lys Ala Gln Met Leu340345350Lys lie Glu Gln Lys His Phe Lys Trp Leu Arg Phe Ser Lys Glu Lys355360365Asp Arg Glu Leu Glu Lys Met Arg Leu Glu Asn Glu Lys Met Lys Leu370375380Glu Asn Glu Arg Leu Glu Leu Glu Leu Lys Leu Lys Glu lie Glu Met385390395400Gly lie Lys Pro Lys Lys lie Phe Ser Asp405410
权利要求
一种能够提高盐胁迫耐受能力的OsGTγ-1基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用，该基因是序列表SEQ NO1中第475-1707位所示的DNA序列。
2.一种能够提高盐胁迫耐受能力的OsGTY-I基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用， 该基因编码的氨基酸序列如序列表SEQ NO 1第475-1707位所示。
3.权利要求2所述的基因在提高水稻盐胁迫耐受能力中的应用。
全文摘要
本发明涉及水稻基因工程技术领域。具体涉及一种GT转录因子家族基因OsGTγ-1基因在控制水稻耐盐性中的应用。通过功能分析和鉴定获得一个控制水稻耐盐性的基因OsGTγ-1，验证了该基因在水稻耐盐性抗逆遗传改良中的应用。所述的OsGTγ-1基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQ NO1中第475-1707位所示的核苷酸序列；或编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的核苷酸序列。将含OsGTγ-1基因的核苷酸序列与外源启动子连接后转入水稻，转基因水稻的耐盐性得到显著提高。
文档编号C07K14/415GK101812462SQ20091027324
公开日2010年8月25日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者方玉洁, 熊立仲 申请人:华中农业大学