专利名称：一种改良戊二醛法制备高偶联率铅抗原的方法
技术领域：
本发明涉及一种改良戊二醛法制备高偶联率铅抗原的方法，属于免疫化学及残留 分析生物技术领域。
背景技术：
铅是一类具有积蓄性的对环境永久有害的物质，其不能通过化学或生物修复过程 转变为无害物质。长期以与土壤结合或沉积物的形式存在，经生物积累、通过食物链进入人 体，损伤人体神经、肾脏、造血、消化、内分泌等系统，直接危害人类健康。被铅污染的地区， 必须进行定期检测。现用于铅等重金属污染物的方法主要有原子吸收分光光度法、荧光光谱法、极谱 法、电感耦合等离子体法，这些仪器均能准确检测样品中铅总量，但其价格昂贵、样本检测 周期长等缺点，成为广泛实施环境中铅污染物检测的瓶颈。免疫分析测定技术的出现为铅 的检测提供了一种快速、廉价、易于操作、合理便捷，同时具有高灵敏度和特异性的方法，实 现铅的免疫分析测定技术关键在于合成的铅抗原以获得相应抗体。铅抗原的制备，常规方法是采用双功能螯合剂先与蛋白结合得到蛋白螯合剂复合 物，再向其中加入铅离子一次螯合制得抗原，在螯合反应一步中，由于蛋白质很容易在大量 铅离子存在的液体环境下变性沉淀，铅离子反应浓度必须低于其致蛋白变性的浓度，因此， 一次螯合制备抗原的方法，由于铅离子的反应浓度低，所制备的铅抗原，偶联率低，免疫效^^^ ο
发明内容
针对铅与蛋白快速大量结合后易导致蛋白变性这一特点，本发明旨在解决现有方 法抗原偶联率低，免疫效果差的问题，提供制备高偶联率，高免疫原性的铅抗原的方法。实现本发明的技术方案如下利用分2 5次螯合反应加以制备，在制备的过程中 加入的铅离子要足量，以保证抗原偶联率达到一定量；铅离子反应浓度要低于其致蛋白变 性的浓度，以保证所制备抗原中蛋白的活性。为此，应分批加入铅离子，制备高偶联率高活 性的铅抗原。本发明的工艺步骤是(1)将蛋白螯合剂复合物置于离心管中，向其中振荡滴加铅盐溶液，如Pb(NO3)2， 要求加入的铅离子与蛋白螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋白螯合剂复 合物)=10 1000 1，每1 7min滴加一滴，得溶液A ；(2)将溶液A在30°C避光恒温反应14h 20h，反应完毕得溶液B ；(3)N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液(HBS)透析溶液B，时间为1 3天，得 溶液C即低偶联率铅抗原；(4)将第1次加入铅离子螯合反应得到的溶液C取出置于离心管中重复上述步骤 (1) (3)1 4次，每次加入铅量应减少为第1次加量的80%，最后一次透析得到的溶液
3D，即为高偶联率的铅全抗原。本发明的有益效果是本发明采用低浓度多次螯合反应，所制备的铅抗原，经原子 吸收与紫外分光光度计检测，蛋白与铅偶联率是一次螯合法的两倍以上。经小鼠免疫试验 证明，所制备高偶联率的铅抗原，其免疫原性好，方法重复性高，简单易行。
附图为本方法的反应过程图。图中GA为蛋白质交联剂戊二醛；1 为一种双功能螯合剂(p-NH2-Bn-CHX-A，，-DTPA)；2 为蛋白螯合剂复合物 BSA-GA-p-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA ；3为偶联上铅铅离子的全抗原BSA-GA-p-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA-Pb。
具体实施例方式实施例11、溶液的配制用0. 1M，pH7. 3的N_2_羟乙基哌嗪-N_2_乙磺酸(HBS)溶液作为 缓冲体系，配制双功能螯合剂P-NH2-Bn-CHX-A"-DTPA 10mg/ml，牛血清蛋白(BSA) 2. 5mg/ml 及Pb (NO3)2溶液。 2、蛋白交联反应取P-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA溶液300 μ 1与2mlBSA溶液混合，将 300 μ 125%戊二醛缓慢滴加到双功能螯合剂与BSA混合溶液中，进行蛋白交联反应，得蛋 白螯合剂复合物BSA-GA-p-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA，并于HBS缓冲液中进行透析2天。3、铅离子的螯合取出透析完毕的蛋白螯合剂复合物，振荡加入ρΗ2的Pb(NO3)2 溶液，加入的铅离子与蛋白螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋 白)=40 1，控制滴加速度为5min/滴，滴加完毕后30°C恒温箱中反应20h，反 应完毕，置于HBS缓冲液中透析1天，得到一次螯合结合上的较低偶联率的铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A ” -DTPA。4、铅离子的第2次螯合取出第1次螯合铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A" -DTPA-Pb溶液，振荡加入Pb (NO3) 2溶液，其加入的铅离子与蛋白 螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋白)=32 1，每5min滴加一滴，滴 加完毕后30°C恒温箱中反应14h，反应完毕，放入HBS缓冲液中透析3天，得较高偶联率的 铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA。5、铅抗原偶联率鉴定BCA法构建浓度检测标准曲线，检测样品蛋白浓度；铅的含 量测定参照国标GB/T 5009. 12-2003，用石墨炉原子吸收光谱法检测抗原中铅的浓度；根 据两者浓度确定二者铅离子与蛋白的结合比为22 1。实施例21、溶液的配制用0. 1M，pH7. 3的N_2_羟乙基哌嗪-N_2_乙磺酸(HBS)溶液作为 缓冲体系，配制双功能螯合剂P-NH2-Bn-CHX-A"-DTPA 10mg/ml，牛血清蛋白(BSA) 2. 5mg/ml 及Pb (NO3)2溶液。2、蛋白交联反应取P-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA溶液300 μ 1与2mlBSA溶液混合，将300 μ 125%戊二醛缓慢滴加到双功能螯合剂与BSA混合溶液中，进行蛋白交联反应，得蛋 白螯合剂复合物BSA-GA-p-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA，并于HBS缓冲液中进行透析2天。3、铅离子的螯合取出透析完毕的蛋白螯合剂复合物，振荡加入ρΗ3的Pb(NO3)2 溶液，加入的铅离子与蛋白螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋 白)=40 1，控制滴加速度为5min/滴，滴加完毕后30°C恒温箱中反应20h，反 应完毕，置于HBS缓冲液中透析1天，得到1次螯合结合上的较低偶联率的铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A ” -DTPA。4、铅离子的第2次螯合取出第1次螯合铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A" -DTPA-Pb溶液，振荡加入Pb (NO3) 2溶液，其加入的铅离子与蛋白 螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋白)=32 1，每5min滴加一滴，滴 加完毕后30°C恒温箱中反应14h，反应完毕，放入HBS缓冲液中透析3天，得较高偶联率的 铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A ” -DTPA。5、铅离子的第3次螯合取出第2次螯合的铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A" -DTPA-Pb溶液，振荡加入Pb (NO3) 2溶液，其加入的铅离子与蛋白 螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋白)=32 1，每5min滴加一滴，滴 加完毕后30°C恒温箱中反应14h，反应完毕，放入HBS缓冲液中透析3天，得3次螯合的铅 抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A ” -DTPA-Pb。6、铅抗原偶联率鉴定BCA法构建浓度检测标准曲线，检测样品蛋白浓度；铅的含 量测定参照国标GB/T 5009. 12-2003，用石墨炉原子吸收光谱法检 测抗原中铅的浓度；根 据两者浓度确定二者铅离子与蛋白的结合比为27 1。实施例31、溶液的配制用0. 1M，pH7. 3的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HBS)溶液作为 缓冲体系，配制双功能螯合剂P-NH2-Bn-CHX-A"-DTPA 10mg/ml，牛血清蛋白(BSA) 2. 5mg/ml 及Pb (NO3)2溶液。2、蛋白交联反应取P-NH2-Bn-C HX-A“ -DTPA溶液300 μ 1与2mlBSA溶液混合， 将300 μ 125%戊二醛缓慢滴加到双功能螯合剂与BSA混合溶液中，进行蛋白交联反应，得 蛋白螯合剂复合物BSA-GA-p-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA，并于HBS缓冲液中进行透析2天。3、铅离子的螯合取出透析完毕的蛋白螯合剂复合物，振荡加入ρΗ4的Pb(NO3)2 溶液，加入的铅离子与蛋白螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋 白)=40 1，控制滴加速度为5min/滴，滴加完毕后30°C恒温箱中反应20h，反 应完毕，置于HBS缓冲液中透析1天，得到1次螯合结合上的较低偶联率的铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A ” -DTPA。4、铅离子的第2次螯合取出第1次螯合铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A" -DTPA-Pb溶液，振荡加入Pb (NO3) 2溶液，其加入的铅离子与蛋白 螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋白)=32 1，每5min滴加一滴，滴 加完毕后30°C恒温箱中反应14h，反应完毕，放入HBS缓冲液中透析3天，得较高偶联率的 铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA。5、铅离子的第3次螯合取出第2次螯合的铅抗原 BSA-GA-p-NH2-Bn-CHX-A”-DTPA-Pb溶液，振荡加入Pb (N03) 2溶液，其加入的铅离子与蛋白螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋白)=32 1，每5min滴加一滴，滴 加完毕后30°C恒温箱中反应14h，反应完毕，放入HBS缓冲液中透析3天，得3次螯合的铅 抗原 BSA-GA-p-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA-Pb06、铅离子的第4次螯合取出第3次螯合得到的较高偶联率的铅抗原 BSA-GA-P-NH2-Bn-CHX-A" -DTPA-Pb溶液，振荡加入Pb (NO3) 2溶液，其加入的铅离子与蛋白 螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋白)=32 1，每5min滴加一滴，滴 加完毕后30°C恒温箱中反应14h，反应完毕，放入HBS缓冲液中透析3天，得4次螯合的铅 抗原 BSA-GA-p-NH2-Bn-CHX-A” -DTPA-Pb07、铅抗原偶联率鉴定BCA法构建浓度检测标准曲线，检测样品蛋白浓度；铅的含 量测定参照国标GB/T 5009. 12-2003，用石墨炉原子吸收光谱法检测抗原中铅的浓度；根 据两者浓度确定二者铅离子与蛋白的结合比为29 1。
权利要求
一种改良戊二醛法制备高偶联率铅抗原的方法，包括蛋白与双功能螯合剂通过交联剂反应结合，制备蛋白螯合剂复合物，蛋白螯合剂复合物与铅离子进行螯合反应，其特征是采用2～5次分步螯合反应，制备偶联率高免疫原性好的铅抗原。
2.根据权利要求1所述的一种改良戊二醛法制备高偶联率铅抗原的方法，其特征是 铅盐浓度低于致蛋白变性浓度，铅盐溶液PH2 4。
3.根据权利要求1所述的一种改良戊二醛法制备高偶联率铅抗原的方法，其特征是， 2 5次螯合反应的步骤为(1)将蛋白螯合剂复合物置于离心管中，向其中振荡滴加铅盐溶液，要求加入的铅离 子与蛋白螯合剂复合物中蛋白的物质的量之比η(铅)η(蛋白螯合剂复合物)=10 1000 1，每1 7min滴加一滴，得溶液A ；(2)将溶液A在30°C避光恒温反应14h 20h，反应完毕得溶液B；(3)N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液(HBS)透析溶液B，时间为1 3天，得溶液 C即低偶联率铅抗原；(4)将第1次加入铅离子螯合反应得到的溶液C取出置于离心管中重复上述步骤 (1) (3)1 4次，每次加入铅量应减少为第1次加量的80%，最后一次透析得到的溶液 D，即为高偶联率的铅全抗原。
4.根据权利要求2所述的一种改良戊二醛法制备高偶联率铅抗原的方法，其特征是， 所述铅盐为Pb(NO3)21全文摘要
一种改良戊二醛法制备高偶联率铅抗原的方法，是采用多次分步螯合反应，将铅离子分多次低浓度与蛋白螯合剂复合物螯合制备抗原。所得抗原偶联率高免疫原性好，方法重复性高，简单易行，可用于多种重金属全抗原的合成。
文档编号C07K14/765GK101921333SQ20101025755
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者严杰琳, 刘成梅, 涂宗财, 罗舜菁, 陈发荣, 陈婷婷, 陈臣, 高鹏 申请人:南昌大学