用于从含水生物转化混合物中分离链烷醇的方法

专利名称：用于从含水生物转化混合物中分离链烷醇的方法
用于从含水生物转化混合物中分离链烷醇的方法 本发明涉及从含水生物转化混合物中分离链烷醇的方法。已知将借助于分离的酶或者在细胞中存在的酶通过生物技术-化学合成有机-化学化合物称作“生物转化”。在生物转化期间，进行底物，即非天然的(异生)化合物至有价值的产物的酶促转化。 生物转化的特征在于高化学_、区域-和立体特异性，即使在复杂底物和混合物的情况下。结合该方法的高的空间-时间产率、相对低的成本、可再生的原料，以及通常更好的环境相容性，这些优点导致用于エ业的生物转化方法的数量大量増加。应用该技术的焦点在于旋光产物的制备。WO 2006/53713描述了在具有某种多肽序列的醇脱氢酶(ADH)的存在下，通过还原丁-2_酮制备(S)-丁-2-醇的方法。优选地，在还原剂，例如葡萄糖或者甲酸盐的存在下，进行用ADH的对映选择性还原，所述还原剂在还原期间再生被氧化的辅因子。为了再生辅酶，可以加入第二脱氢酶，例如葡糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶。WO 2005/108590公开了制备旋光链烷醇的方法，其中在包含烷酮的介质中，在还原当量的存在下，温育选自脱氢酶、醛还原酶和羰基还原酶种类的酶(E)，在所述温育期间，借助于酶(E)，通过将牺牲醇反应成对应的牺牲酮，再次再生反应期间消耗的还原当量。从文献中已知从微生物的培养液中处理生物转化产物的多种方法。此处的处理方法必须适合于生物转化的某些细节，例如，特别地，在培养液中有价值产物的大量稀释和/或细胞组分的污染物。在反应期间使用解吸气(stripping gas),可以从培养液中除去挥发性或者蒸汽-挥发性化合物。例如在US 2005/089979中描述了此类方法中的ー种。然而，该方法仅适合于起始底物并不具有值得注意的挥发性的情況。在许多情况下，在生物转化后，将含粗产物的培养液蒸发至干燥，然后使用有机溶剂萃取生物转化产物。在全细胞生物转化的情况下，根据需要，在浓缩前例如通过离心、过滤等进行细胞分离步骤。在这些方法中，生物转化产物受亲脂性细胞组分相当大程度的污染，所述污染需要复杂的纯化操作。根据现有技术，在大多数情况下使用热纯化方法(蒸馏)以便从亲脂性细胞组分中分离想要的产物。对于蒸汽-挥发性化合物，用该方法有时会观察到高的损失率。备选地，用有机溶剂例如醚从含水培养基中萃取生物转化产物。为此，通常需要将I至10倍过量的有机溶剂加入到水相中。萃取期间的ー个问题是，当将有机溶剂加入到培养基中吋，出现凝胶和粘液形成现象。这些现象有时相当大地阻碍了生物催化制备的化合物的分离，并极大地降低了产率。用有机溶剂萃取期间的凝胶形成和粘液形成归因于细胞悬浮液中或者无细胞培养基中乳化剂的存在。萃取期间乳化剂的存在在待分离的产物的量和纯度方面降低了萃取的效率。同时，乳化剂的存在导致凝胶或粘液的形成，所述凝胶或粘液可稳定数周或者数月。
已经将所称作的生物乳化剂鉴定为这些乳化剂的组分。尽管已知可以通过添加水解酶破坏这些生物乳化剤，但用于酶促破乳化的水解酶极大地増加了该方法的复杂性和成本。因此，本发明的目的是提供用于从含水生物转化培养基中分离链烷醇，特别地旋光链烷醇的方法，所述方法适合于在生物转化培养基中有价值产物的大量稀释，并且在用有机溶剂萃取期间，有可能不需要长的相分离时间。通过从含水生物转化培养基中分离链烷醇的方法实现该目的，其中a)通过从含水生物转化培养基中馏出链烷醇/水共沸混合物，得到第一链烷醇相，如果共沸混合物是非均相共沸混合物，那么相分离共沸混合物并分离出水相，b)通过以下步骤得到第二链烷醇相(i)用作为萃取剂的溶剂液体/液体萃取第一链烧醇；或者(ii)在作为共沸剂的溶剂的存在下，共沸干燥第一链烷醇相，并且(C)分馏第二链烷醇相以产生纯的链烷醇馏分。第一链烷醇相具有第一含水量，第二链烷醇相具有第二含水量。第二含水量低于第一含水量。此处理解含水量指的是基于链烷醇馏分的水的量。可以不连续地(分批步骤)或者连续地进行步骤c)中的分馏。在本文的情况下，理解生物转化指的是通过分离的酶或酶系统、固定化酶或酶系统、酶粗提取物、全细胞、静息细胞和/或破坏的细胞，催化底物的转化。此处还包括发酵。当生物转化完成吋，即只要已经达到了想要的转化(例如90%及以上的转化)，进行根据本发明的处理方法。根据本发明的方法具有这样的优点，其不需要对生物转化培养基进行复杂的机械分离或者纯化操作，例如通过离心或过滤分离生物质。在该方法的第一歩中，进行有价值产物的显著浓缩，減少了必须在后续步骤中处理的体积。因此，例如，2- 丁醇和水的共沸混合物具有按重量计约72%的2- 丁醇含量。在大气压下，共沸混合物的沸点为约87°C，其显著低于水和2- 丁醇的沸点，所述水和2- 丁醇的沸点在任何情况下为约100°C。理论上，可以将该方法应用于分离任何想要的通过生物转化制备的链烷醇，所述链烷醇与水形成共沸混合物。共沸混合物可以是均相共沸混合物或者非均相共沸混合物。链烷醇包括C2-C8-链烷醇，特别地C4-C8-链烷醇，所述链烷醇的烷基链可以是直链或者分支的链，并且所述链烷醇可以是伯醇、仲醇或者叔醇。优选地，链烷醇选自旋光链烷醇，特别地旋光2-链烷醇。特别优选的实例是S-2- 丁醇、S-2-戊醇和S-2-己醇。在第一歩中，从含水生物转化培养基中馏出链烷醇/水共沸混合物。可以以多种构型在装置中实施蒸馏。可以在任一想要的可加热容器，例如具有加热夹套的搅拌釜反应器或者蒸发器中将生物转化培养基加热至沸腾。为此，在装置方面，可以以固有模式或者強制循环模式使用搅拌釜蒸发器、降膜式蒸发器、薄层蒸发器、強制减压循环蒸发器和其他蒸发器。然而，由 于生物转化培养基中的某些组分可能导致蒸发器快速结垢，所以蒸发器的使用是较不优选的。在ー个便利的实施方案中，当生物转化完成时，在反应容器中直接加热生物转化培养基。加热到沸腾温度的加热速率优选地至少为20K/分钟。在更缓慢加热的情况下，存在非期望的副反应的风险，在旋光醇的情况下，特别地是外消旋化的风险。
可以将蒸馏设定为简单蒸馏(即在上升的蒸汽和回流的冷凝物之间基本上不存在质量传递)或者精馏。对于后者，例如在下文中说明的蒸馏塔或者精馏塔的全部已知设计都是合适的。在压カ和温度的合适条件下蒸馏出链烷醇/水共沸混合物。根据需要，可以在降低的压カ下实施蒸馏。总之，在装置方面，考虑到更低的花费，优选的是在环境压カ下运作。包含链烷醇/水共沸混合物的蒸汽至少是部分冷凝的。为此，对于此目的合适的是任ー想要的热交換器或者冷凝器，其可以是空气冷却或者水冷却的。如果链烷醇与水形成均相的共沸混合物，那么可以将获得的作为冷凝物的第一链烷醇相返回到进ー步的处理中。可以将ー些冷凝物作为回流物加入到精馏塔中。如果链烷醇与水形成非均相共沸混合物，那么将冷凝物分解成水相和有机相，其可以在合适的相分离容器或者滗析器中被互相分离。可以将水相回料到蒸发容器中，例如 作为回流物回料到精馏塔中。在相分离期间，得到作为有机相的第一链烷醇相。考虑到水的溶解度，第一链烷醇相包含溶解的水。因此在进一步蒸馏纯化之前，必须干燥第一链烷醇相。在一个实施方案中，使用作为萃取剂的溶剂，通过液体/液体萃取，进行第一链烷醇相的干燥。合适的萃取剂是溶剂，其中水仅具有极小的溶解度或者基本上不溶。由于萃取剂的存在(所述萃取剂降低了水在待纯化的链烷醇中的溶解度)，水被分离出来，并形成可分离出去的自身相。对于液体/液体萃取，该方法方便地涉及将第一链烷醇相与溶剂紧密接触，并通过滗祈，分离水相，产生第二链烷醇相。对于强烈彻底地混合合适的是合适的装置，例如搅拌釜、离心萃取器、逆流萃取器
坐寸ο然后将溶剂相和水相互相分离。然后，产生作为溶剂相的第二链烷醇相，其包含溶解于溶剂中的链烷醇，具有显著減少的水级分。备选地，可以在作为共沸剂的溶剂存在的情况下，将第一链烷醇相进行共沸干燥。在共沸干燥期间，溶解的水作为水/溶剂共沸混合物被除去。对于共沸干燥，该方法方便地涉及在溶剂存在下在蒸馏容器中加热第一链烷醇相，和作为水/溶剂共沸混合物除去水，使第二链烷醇相留在蒸馏容器中。将包含水/溶剂共沸混合物的蒸汽馏出，并至少部分冷凝，将冷凝物分离成水相和溶剂相，并将溶剂相返回到蒸馏容器中。适合作为萃取剂或共沸剂的溶剂选自，例如脂族烃，如戊烷、己烷、庚烷、环己烷、甲基环己烷；芳香烃，如苯、甲苯、ニ甲苯；卤代烃，如ニ氯甲烷、三氯甲烷、ニ氯こ烷、氯苯。脂族烃，特别地例如正己烷，由于它们的相对无毒性以及能容易地从链烷醇中分离，是特别优选的。然后分馏第二链烷醇相，以产生纯的链烷醇馏分。在分馏期间，链烷醇从添加的溶齐U、未反应的底物、残留水、副产物等中释放出来。在装置方面，可以以多种结构实施蒸馏。全部已知的蒸馏塔或者精馏塔的设计都是合适的。“精馏塔”包含有效分离的内部构件，例如塔盘、不规则填充物和/或规则填充物。为了改进塔中的分离效率，通常将冷凝物的部分蒸汽再次回料到塔中。在典型的板式塔中，安装了液体流经的筛板、泡罩板或浮阀塔板。蒸汽通过特定的槽或孔，以形成泡沫层。在这些板的每ー个上都建立了新的蒸汽平衡。具有不规则填充物的塔可以被不同形状的不规则填充物填充。表面积的增加与优化的受热和质量传递相关，并因此増加塔的分离能力。此类不规则填充物的典型实例是腊希环、鲍尔环、Hiflow环、英特洛克斯鞍形填料、贝尔鞍形填料和hedgehogs。可以将不规则填充物以有序的方式或者另外地以不规则的方式引入到塔中(作为床)。合适的材料是玻璃、陶瓷、金属和塑料。规则填充物是有序的不规则填充物的进ー步发展。它们具有规则的形状结构。存在多种规则填充物的实例，例如织物填充物或者金属片填充物。可以使用的材料是金属、塑料、玻璃和陶瓷。与板式塔比较，具有规则填充物的塔中具有非常少量的液体。这通常对于精馏是有利的，因为其降低了物质热解的风险。在一个实施方案中，从侧面将第二链烷醇相引入分馏柱中，将纯的链烷醇馏分分离为侧流，从塔顶馏出物分离沸点低于链烷醇馏分的馏分，并在底部分离沸点高于链烷醇·馏分的馏分。在另ー实施方案中，不连续地蒸馏第二链烷醇相，连续地产生了沸点低于链烷醇馏分的馏分、纯的链烷醇馏分和沸点高于链烷醇馏分的馏分。沸点低于链烷醇馏分的馏分包含大多数所使用的溶剤，并可以有利地作为溶剂至少部分地返回到步骤b)中。通过将底物转变成链烷醇的任一想要的生物转化方法，获得在根据本发明的方法中所使用的含水生物转化培养基。其包括链烷醇的发酵制备以及链烷醇的酶促制备。在发酵制备中，通过产链烷醇微生物，在可发酵的碳源的代谢过程中产生链烷醇。理解酶促制备(狭义地，生物转化)指的是通过酶，将确定纯度的物质(原料)选择性化学转化成产物，其中所述酶可以在活的、静息的或破坏的细胞中存在或者可以是富集的或者分离的。a)链烷醇的发酵制备从现有技术中已知链烷醇的发酵制备。因此，例如，2008/137403描述了通过发酵制备2-丁醇的方法。用于发酵制备的合适的天然或者重组原核或真核微生物的实例是那些在需氧或厌氧条件下适合于发酵产生想要的链烷醇的微生物。特别地，应当提及选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(pseudomonadaceae)、芽抱杆菌科(Bacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、Rhodococcaceae、红环菌科(Rhodocyclaceae)和诺卡氏菌科(Nocardiaceae)细菌的细菌。合适的属的实例特别包括埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)和芽抱杆菌属(Bacillus)。本领域技术人员，在其一般专业知识的框架内，可以建立合适的发酵条件、培养基、发酵罐等。为此，可以使用例如合适的专业文献中的详细说明，例如Rehm等人，Biotechnology,第 3 卷 Bioprocessing,第 2 版，(Verlag Chemie, Weinheim)。因此，可以在回收生物质和不回收生物质的情况下连续地培养微生物，或者以分批方法(分批培养)或者以补料分批(进料方法)或者重复补料分批方法(重复进料方法)不连读地培养微生物。可以在搅拌发酵罐、泡罩塔和回路反应器中实施发酵。可以在Chmiel (Bioproze β technikI. Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology I.Introductionto bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,1991))或者Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheralequipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))的教科书中发现已知培养方法的概述。为此，制备了无菌培养基并用合适量的新鮮预培养微生物接种，所述无菌培养基包含一种或多种基质，以及任选的对于微生物的生长和产物形成所需的其他添加剤，例如碳源和/或氮源、微量元素等。所使用的培养基必须适合于满足特定菌株的要求。对于多种微生物的培养基的说明包含于美国细菌学协会的手册' “Manual of Methods for GeneralBacteriology”(Washington D. C.,美国，1981)中。根据本发明使用的那些培养基一般包含ー种或ー种以上的碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。 优选的碳源是糖，例如单糖、ニ糖或多糖。非常好的碳源例如是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。还可以通过复杂化合物如糖蜜或者糖精制的其他副产物，将糖加入到培养基中。添加不同碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子脂、脂肪酸，例如软脂酸、硬脂酸或者亚油酸、醇，例如甘油、甲醇或者こ醇，以及有机酸，例如こ酸或者乳酸。氮源通常是有机的或者无机的氮化合物或者包含这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气或者铵盐，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或者硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或者复杂氮源，例如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏以及其他。可以单独地或者作为混合物使用氮源。在培养基中存在的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钥、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。可以使用的硫源是无机含硫的化合物，例如硫酸盐、亚硫酸盐、连ニ亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，以及有机硫化合物，例如硫醇和硫醇类。可以使用的磷源是磷酸、磷酸ニ氢钾或磷酸氢ニ钾或者相应的含钠盐。可以将螯合剂加入到培养基中，以维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包括ニ羟基酚，例如儿茶酚或者原儿茶酸，或者有机酸，例如柠檬酸。通常使用的发酵培养基还包含其他生长因子，例如维生素或生长促进剂，其包括例如，生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸(panthothenate)和吡哆醇。生长因子和盐通常来源于复杂培养基组分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外，可以将合适的前体加入到培养基中。培养基化合物的精确组成主要取决于特定的实验，并基于每ー特定情况单独决定。可以在教科书“Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach”(编辑P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997)第 53-73 页，ISBN0199635773)中发现有关培养基的优化信息。还可以从商业供应商，例如Standard I (Merck)或者BHI (Brain heartinfusion, DIFC0)等获得生长培养基。通过加热(在I. 5巴和121°C，20分钟)或者通过过滤除菌对全部的培养基组分灭菌。可以一起或者，根据需要，単独地对组分灭菌。可以在培养的ー开始就存在全部培养基组分或者任选地可以连续地或者分批地加入培养基组分。培养的温度通常在15°C至45°C之间，优选地在25°C至40°C之间，并且可以在实验期间保持恒定或者被改变。培养基的PH应当是在5-8. 5的范围，优选地是7. O左右。在培养期间可以通过加入碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或者酸性化合物例如磷酸或者硫酸控制培养的pH。为了控制泡沫的产生，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚こニ醇酷。为了维持质粒的稳定性，可以将合适的选择性作用物质，例如抗生素加入到培养基中。为了维持需氧条件，将氧气或者含氧气的气体混合物，例如环境空气引入到培养物中。培养温度通常为20°C至45°C。持续培养，直到形成了最大量的想要产物。通常在10小时至160小时内达到该目标。取决于生产菌株，可能需要用空气、氧气、ニ氧化碳、氢气、氮气或者相应的气体混合物充气以实现高的产率。 当发酵完成时，可以将包含链烷醇的发酵培养液直接转到根据本发明的进ー步处理。然而，优选地，首先通过例如离心或者过滤分离生物质，并根据需要，洗涤，并将洗液与链烷醇相合并。在根据本发明的方法进ー步处理发酵液之前，可以预处理发酵液；例如，可以从发酵液中分离生物质。分离生物质的方法是本领域技术人员已知的，例如过滤、沉降和浮选。因此，可以例如使用离心机、分离器、滗析器、过滤器或者在浮选装置分离生物质。为了最完全地分离可能的有价值产物，通常推荐，例如以渗滤的形式洗涤生物质。方法的选择取决于发酵液中的生物质级分和生物质的性质，以及生物质与有价值的产物的相互作用。在ー个实施方案中，可以灭菌或者巴氏杀菌发酵液。b)链烷醇的酶促制备在优选的实施方案中，在醇脱氢酶存在的情况下，通过还原链烷酮进行链烷醇的制备。在一个特别优选的实施方案中，在醇脱氢酶(ADH) (EC I. I. I. I)存在的情况下，通过还原丁 -2-酮得到含2- 丁醇的生物转化培养液。脱氢酶将酮或醛转化成相应的仲醇或伯醇；理论上，反应是可逆的。它们催化对映选择性氢化物转移至羰基化合物的前手性碳原子上。此处的氢负离子来源于辅因子，例如NADPH或NADH(还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或者还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。由于这些辅因子是非常昂贵的化合物，因此仅以催化量将其加入到反应中。通常在反应期间通过同时发生的二次氧化还原反应再生被还原的辅因子。ADH例如选自来自梭菌属、链霉菌属或埃希氏菌属的微生物的脱氢酶。可以以纯化的或者部分纯化的形式或者以微生物自身的形式使用ADH。获得和纯化来自微生物的脱氢酶的方法是本领域技术人员已知的，例如来自K. Nakamura & T. Matsuda,“Reduction ofKetones”在 K. Drauz 和 H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,果頂卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中。产生脱氢酶的重组方法同样是已知的，例如来自ff. Hummel,K. Abokitse,K. Drauz, C. Rollmann 和 H. Groger5 Adv. Synth. Catal. 2003, 345，No. 1+2，第 153-159 页。
优选地，在合适的辅因子存在的情况下进行用ADH的还原。通常用于酮的还原的辅因子是NADH和/或NADPH。此外，可以将ADH用作本来就包含辅因子的细胞系统，或者添加备选的氧化还原介体(A. Schmidt, F. Hollmann 和 B. Biihler “Oxidation of Alcohols”在 K. Drauz 和 H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,弟 III 巷，991-1032，ffiley-VCH, Weinheim 中)。特别地，该反应与转化期间消耗的辅因子的再生同时或者交错地进行。为此，再生可以以自身已知的方式酶促地、电化学地或者电酶促地(electroenzymatically)进打(Biotechnology Progress,2005,21,1192 ；Biocatalysis ana Biotransformation,2004,22,89 ；Angew. Chem Int.Ed Engl.,2001,40,169 ；Biotechnol Bioeng,2006,96,18 ；Biotechnol Adv.,2007,25,369 ；Angew. Chem Int. Ed Engl.,2008,47,2275 CurrentOpinion in Biotechnology,2003,14,421 ；Current Opinion in Biotechnology,2003,14,583)。 优选地，在合适的还原剂存在的情况下，进行用ADH的还原，所述还原剂再生在还原期间被氧化的辅因子。合适的还原剂的实例是糖、特别地是己糖，例如葡萄糖、甘露糖、果糖，以及甲酸盐、亚磷酸盐或者分子氢。取决于整个反应的热力学和动力学条件，可以将可氧化的醇，特别地こ醇、丙醇或者划算的仲醇类，例如异丙醇(称为“牺牲醇(sacrificialalcohols)”)作为反应的最终氢供体。为了还原剂的氧化，以及与其相关的，和辅因子的再生，可以加入再生酶，例如第ニ脱氢酶，例如当将葡萄糖用作为还原剂时的葡糖脱氢酶(GDH) (EC I. I. I. 47)，当将甲酸盐用作为还原剂时的甲酸脱氢酶(EC 1.2. 1.2或EC 1.2.1.43)或者当将亚磷酸盐用作为还原剂时的亚磷酸盐脱氢酶(EC1. 20. I. I)。当使用牺牲醇时，通常通过相同的生物催化剂实施酮还原和牺牲醇氧化。可以将再生酶作为游离的酶或者固定化的酶使用或者以游离的细胞或者固定化的细胞的形式使用。可以在(重组的)脱氢酶菌株中単独地或者通过共表达进行再生酶的制备。含水反应介质优选地是缓冲液，其通常具有5-8，优选地6-8的pH。此外，除水外，水性溶剂还可以包含至少ー种与水部分混溶的有机化合物，例如异丙醇、正丁醇。合适的缓冲液为，例如铵、碱金属或者碱土金属磷酸缓冲液或者碳酸盐缓冲液，或者TRIS/HC1缓冲液，其以约IOmM至0. 2M的浓度使用。通常在低于所使用的脱氢酶的失活温度，并且在-10°C以上进行酶促还原。特别优选地是0-100°C，特别的是15-60°c，并且更特别的是20-40°C的范围，例如约30°C。可以在搅拌反应器、泡罩塔和回路反应器中实施生物转化。包括搅拌器的型号和几何设计的可能的配置的详细概述见于“Chmiel Bioprozesstechnik Einfiihrung indie Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology Introduction to Dioprocesstechnology]，第I卷”中。为了实施该方法，通常可以利用本领域技术人员已知的或者例如在“Chmiel, Hammes und Bailey Biochemical Engineering” 中说明的以下变型，例如分批、补料分批、重复补料分批或者在回收和不回收生物质的情况下的连续发酵。取决于生产菌株，为了实现高的产率，可以/必须进行用空气、氧气、ニ氧化碳、氢气、氮气或者相应的气体混合物通气。实施酶促反应可以以文献中已知的方式，如上对于发酵所述，同样地连续或者不连续地进行。本领域技术人员可以直接測定底物、酶、还原当量和“牺牲化合物”的最佳浓度。因此，例如，WO 2006/53713描述了在具有某种多肽序列的醇脱氢酶(ADH)存在的情况下，通过还原丁-2-酮制备(S)-丁-2-醇的方法。优选地，在还原剂，例如葡萄糖或者甲酸盐存在情况下，进行用ADH的对映选择性还原，所述还原剂产生了在还原期间氧化的辅因子。为了再生辅酶，可以加入第二脱氢酶，例如葡糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶。在酶促还原中，优选地以O. lg/Ι至500g/l，特别优选地以lg/Ι至50g/l的浓度使用丁 -2-酮，并且可以连续地或者非连续地注满丁 -2-酮。
对于该方法，例如，可以将丁-2-酮和ADH、溶剂和任选地辅因子，根据需要，用于再生辅因子的第二脱氢酶和/或另外的还原剂引入为初始进料，并例如通过搅拌或者振荡，彻底混合该混合物。然而，还可以在反应器，例如在塔中固定脱氢酶，并使包含丁-2-酮和任选地辅因子和/或共底物通过反应器。为此，可以将混合物循环经过反应器，直到产生想要的转化。在该方法中，丁-2_酮的酮基团被还原生成OH基团，基本上产生了醇的(S)对映异构体。通常，基于混合物中存在的丁 -2-酮，将进行还原，直到至少70%，特别优选地至少85%和特别地至少95%的转化。可以通过常规方法，例如气相层析或者高压液相层析监测反应的进展，即酮的顺次还原。WO 2005/108590公开了旋光链烷醇的制备方法，其中，在含链烷酮的培养基中，在还原当量存在的情况下，温育选自脱氢酶、醛还原酶和羰基还原酶种类的酶(E)，其中通过借助酶(E)，将牺牲醇反应生成相应的牺牲酮，又再生了在反应期间消耗的还原当量。可以通过WO 2005/108590中描述的方法制备包含S-2-戊醇的生物转化培养液。c)酶或微生物的固定化可以将用于链烷醇制备的酶以游离形式或者以固定化形式用于本文中所述的方法。理解固定化酶指的是固定到惰性支持体上的酶。从EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-0S100193773，以及本文中所引用的文献參考中已知合适的支持体材料以及在其上固定化的酶。在这方面，以其整体引用这些文件的公开。合适的支持体材料包括，例如黏土、黏土矿物，例如高岭土、硅藻土、珍珠岩、ニ氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交換材料、合成聚合物，例如，聚苯こ烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烃，例如聚こ烯和聚丙烯。支持体材料通常用于以细碎的颗粒形式产生支持的酶，优选多孔形式。支持体材料的颗粒大小通常不超过5mm,特别地不超过2mm (筛线(sieve line))。类似地，当使用脱氢酶作为全细胞催化剂时，可以选择游离形式或者固定化形式。支持体材料为例如，藻酸钙和角叉菜胶。还可以将酶，如细胞与戊ニ醛直接交联(与CLEAs交联)。例如，在 J. Lalonde 和 A. Margolin “Immobilization of Enzymes” 在 K. Drauz和 H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,第 III 卷，991-1032，Wiley-VCH, Weinheim中描述了相应的和另外的固定化方法。用于实施根据本发明的方法的生物转化和生物反应器的其他信息还可以见于Rehm等人(编辑)Biotechnology，第二版，第 3 卷,第 17 章，VCH, Weinheim 中。以下实施例更详细地说明了本发明。实施例I
酶促还原在16m3反应器中实施2_ 丁酮至S-2- 丁醇的酶促还原。为此，引入70001的水，43. 5kg的磷酸氢ニ钾，34kg的磷酸ニ氢钾和2. 4kg的六水合氯化镁。接通搅拌器后，引入另外10001的水，并将反应器加热至25°C。I小时后，控制pH。pH应当为6. 3-6. 7，所以，根据需要，取决于PH，然后将75%強度的磷酸或者48%強度的氢氧化钾溶液计量在内。在调整pH后，加入901kg的葡萄糖、溶解于水的1.31^辅因子應0、5001的ADH生物催化剂、4001的葡糖脱氢酶制备物和361kg的2- 丁酮。当添加完成时，在25°C的内部温度下，再搅拌反应器内容物24小时。在这期间，通过添加20%强度的NaOH，将pH维持在pH6. 3-6. 7。如果24小时后，转化为90%或者更多，则终止反应；如果转化低于90%，则在25°C再搅拌反应溶液2小吋。共沸蒸僧
在大气压下，在16m3搅拌反应器中，将酶促还原的反应排出物加热至约100°C的内部温度。在单级蒸馏中，通过分相器，分离约400kg含有价值产物的上层相，而将水相返回到搅拌器中。该步骤的终止标准为馏出液的两相性质结束。达到该标准后，另外馏出约IOOkg的单相馏出液，以实现从反应排出物中完全分离s-2- 丁醇。该步骤的产率为90%以上。共沸干燥+己烷蒸僧将来自共沸蒸馏的4个馏分合井，并通过正己烷共沸干燥。为此，在16m3搅拌反应器中，将来自共沸蒸馏的约2000kg馏出液作为初始进料引入，并与1600kg正己烷混合。在大气压下，将反应内容物加热至约60°C。在单级蒸馏中，通过分相器除去约600kg的含水低层相。将有机上层相返回到搅拌反应器中。该步骤的终止标准是馏出液的两相状态结束。达到该标准后，通过附着柱(attached column)懼出约1300kg的残留正己烧,并且然后将反应器内容物冷却至室温。该步骤的产率为95%以上。通过蒸馏纯化在连续塔期间，通过蒸馏纯化来自共沸干燥的粗制的S-2- 丁醇。该塔具有50mm的直径，由8个局部部分组成，每一局部部分都安装了 O. 5m的规则的织物填充物(SulzerCY) ο在大气压下实施蒸馏。在3m填充高度下，以液体形式引入粗制的排出物，并且将更容易沸腾的馏分，例如己烷、2-丁酮和残留的水从塔顶馏出物中馏出。将传递顔色的、更高沸点组分经底部分离。在O. 5m的填充高度通过蒸汽侧面的取出(vaporous side),分离纯的馏分。S-2- 丁醇以99%以上的纯度存在，通过蒸馏连续纯化的产率为90%以上。实施例2酶促还原在41小型エ厂反应器中实施2-丁酮至S-2-丁醇的酶促还原。为此，引入26001的水，15g的磷酸氢ニ钾、Ilg的磷酸ニ氢钾和Ig六水合氯化镁。接通搅拌器后，将反应器加热至25°C。I小时后，控制pH。pH应当为6. 3-6. 7，根据需要，取决于pH，将75%强度的磷酸或者48%强度的氢氧化钾溶液计量在内。在调整pH后，加入300g的葡萄糖、溶解于水的O. 5g辅因子NAD、170ml的ADH生物催化剂、130ml的葡糖脱氢酶制备物和120g的2-丁酮。当添加完成时，然后在25°C的内部温度下，再搅拌反应器内容物24小吋。在这期间，通过添加20%强度的NaOH，将pH维持在pH6. 3-6. 7。如果24小时后，转化为90%或者更多，则终止反应；如果转化低于90%，则在25°C再搅拌反应溶液2小吋。共沸蒸僧在大气压下，在41小型エ厂反应器中，将酶促还原的反应排出物加热至约100°C的内部温度。在单级蒸馏中，通过分相器，分离约140g含有价值产物的上层相，而将水相返回到搅拌器中。该步骤的终止标准为馏出液的两相状态结束。达到该标准后，另外馏出约30kg的单相馏出液，以实现从反应排出物中完全分离S-2- 丁醇。该步骤的产率为90%以上。P1烷萃取在500ml分液漏斗中，将来自共沸蒸馏的含水S_2_ 丁醇馏分与约IOOml的正己烷混合，并在室温萃取。相分离产生了约60ml的含水低层相和约240ml的有机上层相。由于己烷萃取，上层相的水含量降低到了 5%以下。该步骤的产率为95%以上。己烷蒸馏+通过蒸馏纯化将来自两次己烷萃取的有机上层相合并在具有附着柱(填充长度约30cm、填充物3mm金属网线环(mesh wire ring))的11小型エ厂反应器中，并在大气压下通过分批蒸懼并用可变的回流比分离。在由己烷、2-丁酮、S-2-丁醇和水组成的低沸点馏分后，分离到了具有99%以上纯度以及90%以上产率的有价值产物馏分。高沸点、传递颜色的组分留在反 应器的底部。
权利要求
1.用于从含水生物转化培养液中分离链烷醇的方法，其中 a)通过从含水生物转化培养液中馏出链烷醇/水共沸混合物获得第一链烷醇相，并且如果所述共沸混合物是非均相共沸混合物，那么相分离所述共沸混合物并分离出水相， b)通过下列步骤获得第二链烷醇相 (i)用作为萃取剂的溶剂液体/液体萃取所述第一链烷醇相；或者 (ii)在作为共沸剂的溶剂存在下，共沸干燥所述第一链烷醇相，和 (C)分馏所述第二链烷醇相以产生纯的链烷醇馏分。
2.根据权利要求I的方法，其中所述链烷醇选自旋光2-链烷醇。
3.根据权利要求2的方法，其中所述链烷醇选自S-2-丁醇、S-2-戊醇和S-2-己醇。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述溶剂选自脂族烃。
5.根据权利要求4的方法，其中所述溶剂是正己烷。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，对于所述液体/液体萃取，将所述第一链烷醇相与所述溶剂紧密接触，并分离水相，产生所述第二链烷醇相。
7.根据权利要求I至5中任一项的方法，其中对于所述共沸干燥，在所述溶剂存在的情况下在蒸馏容器中加热所述第一链烷醇相，并将水作为水/溶剂共沸混合物除去，在所述蒸馏容器中留下所述第二链烷醇相。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，对于所述分馏，将所述第二链烷醇相从侧面连续引入到分馏塔中，将所述纯的链烷醇馏分分离为测流，从塔顶馏出物分离沸点低于所述链烷醇馏分的馏分，并在底部分离沸点高于所述链烷醇馏分的馏分。
9.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中，对于所述分馏，不连续地蒸馏所述第二链烷醇相，连续地产生了沸点低于所述链烷醇馏分的馏分、纯的链烷醇馏分和沸点高于所述链烷醇馏分的馏分。
10.根据权利要求8或9的方法，其中将所述沸点低于所述链烷醇馏分的馏分作为溶剂至少部分地返回到步骤b)中。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物转化培养液包含活细胞、静息细胞或者被破坏的细胞。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过在醇脱氢酶存在下还原链烷酮获得所述生物转化培养液。
13.根据权利要求12的方法，其中通过在醇脱氢酶存在下还原2-丁酮获得所述生物转化培养液。
全文摘要
本发明涉及从含水生物转化混合物中分离链烷醇，其中a)通过从含水生物转化混合物中馏出链烷醇/水共沸混合物，获得第一链烷醇相，并且如果共沸混合物是非均相共沸混合物，那么相分离共沸混合物并分离出水相，b)通过以下步骤获得第二链烷醇相(i)使用溶剂作为萃取剂液体/液体萃取第一链烷醇；或者(ii)在作为载体剂的溶剂存在下，共沸干燥第一链烷醇相，和(c)分馏第二链烷醇相，产生纯的链烷醇馏分。例如，在醇脱氢酶存在下通过还原链烷醇获得生物转化混合物。该方法适合于生物转化混合物中有价值产物的大量稀释，并且当通过有机溶剂萃取时，可以在不需要长的相分离时间的情况下进行。
文档编号C07C31/125GK102712560SQ201080061923
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者B·豪尔, J·道韦尔, M·布罗伊尔 申请人:巴斯夫欧洲公司