专利名称：改造基因OsbZIP46CA1在控制水稻抗旱性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及(I)通过基因操作改造了水稻bZIP家族基因0sbZIP46，克隆到一种能够提高水稻对干旱耐受能力的基因0sbZIP46CAl，(2)基因0sbZIP46CAl在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用基因改造的方法，克隆了水稻bZIP家族基因0sbZIP46缺失内部297个碱基后的片段0sbZIP46CAl，实验证明0sbZIP46CAl具有强转录激活活性，通过转基因技术超量表达0sbZIP46CAl基因后增强了水稻抗旱的能力，证实了该基因的功能及应用途径。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，随着环境问题日益严重，水稻生产也面临许多新的挑战，其中非常重要的一个就是各种非生物逆境对水稻生长发育的影响。水资源短缺以及土壤盐溃化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球很多耕地为干旱、半干 旱地区，而且很多受到盐害威胁。在自然条件下，由于环境胁迫而严重影响了水稻等作物生长发育，其遗传潜力难以发挥，造成作物减产，并使生态环境日益恶化。因此，提高水稻的抗旱、耐盐能力已经成为现代植物研究工作中急需解决的关键问题之一。通过转基因技术对水稻品种进行抗逆性遗传改良显得越发重要，寻找水稻中可真正用于抗逆性遗传改良的基因是其中的关键。植物对逆境有着复杂的应答系统，涉及的基因有非常多的种类，包括调节基因和一些下游的功能基因等。转录因子对植物逆境反应有非常重要的调控作用，其中很重要的一类就是bZIP家族(Jakoby等，2002)，bZIP转录因子含有碱性亮氨酸拉链结构域，通过依赖于ABA的途径广泛参与植物对非生物逆境的应答。非生物逆境以及外源ABA能诱导植物体内ABA的合成，bZIP蛋白也随之被激活并与ABA应答元件ABRE (ABA responsiveelement)结合，启动下游基因的表达(Choi等，2000)。拟南芥中和水稻中都已鉴定了一些参与逆境应答的bZIP转录因子，包括ABFl/2/3、ABI5、0sbZIP23等。其他转录因子家族(如DREB, NAC, Zinc finger等)也鉴定了许多逆境相关的成员，例如拟南芥中的CBF1/2/3，水稻中的SNACUDST1等。这些转录因子通过感受上游逆境信号之后，直接结合到下游靶基因的启动子区，调控这些下游基因的表达，从而控制植物对逆境的适应能力。在鉴定逆境应答基因得过程中，发现许多基因直接参与逆境应答的调控，也有许多基因自然状态下的形式并不能参与逆境应答或不能完全表现出它的功能，需要经过一定的人工修饰后才能完全体现出调控逆境应答的能力，这些基因在植株体内的作用过程可能需要一些依赖逆境调控的对基因的加工，或需要对基因表达产物进行相关修饰、构象变化。如拟南芥的转录因子DREB2A全长形式表现出较弱的转录激活活性，超表达DREB2A并不能显著诱导下游基因的表达，超表达植株的抗逆性也无显著改变，而当将DREB2A中间的一个NRD(negative regulatory domain)区段缺失后,表现出很强的转录激活活性,对其超表达后显著增强了下游基因的表达，增强了转基因植株的抗旱性(Yoh Sakuma等，2006)。本发明涉及的0sbZIP46基因是水稻中bZIP家族成员之一。0sbZIP46全长形式并没有转录激活活性，将0sbZIP46基因全长超表达水稻并没有提高转基因植株的抗旱性。申请人通过基因改造的方法，克隆了 0sbZIP46缺失内部297个碱基后的片段0sbZIP46CAl，实验证明0sbZIP46CAl具有强转录激活活性，通过转基因技术超量表达0sbZIP46CAl基因后增强了水稻抗旱的能力，因此本发明建立一种能显著增强水稻抗旱性的0sbZIP46基因的新形式0sbZIP46CAl，对于水稻抗旱遗传改良具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的涉及一个bZIP转录因子家族成员0sbZIP46的新形式基因0sbZIP46CAl在控制水稻抗旱性改良中的应用。申请人克隆了水稻bZIP转录因子0sbZIP46缺失第361位至第657位碱基(共297个碱基，涉及编码99个氨基酸的部分)后的片段，将该基因命名为0sbZIP46CAl (0sbZIP46Constitutive Activeform)。本发明克隆和应用一种包含0sbZIP46CAl基因的DNA片段，该片段赋予水稻在干旱胁迫条件下抗旱性增强的能力。其中，所述的含有0sbZIP46CAl基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO :1所示，序列长度为678bp，它对应的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，其氨基酸序列为225个。 携带有本发明0sbZIP46CAl基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411—463 ;Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition))。可使用包括本发明的0sbZIP46CAl基因的表达载体转化宿主(包括水稻在内多种植物)，培育抗旱植物品种。本发明基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达基因，提高植物抗旱性。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
序列表SEQ ID N0:1是本发明改造、克隆的包含有0sbZIP46CAl基因编码区的核苷酸序列，序列长度为678bp，它对应的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，氨基酸序列为225个。图I. 0sbZIP46CAl蛋白转录激活活性研究。根据序列分析，0sbZIP46转录因子的转录调控区含a-d四个保守区域，其中缺失d区域的蛋白(dC5，dC6，CAl)具有强转录激活活性。图2. 0sbZIP46CAl超表达载体示意图及超表达植株的转基因表达量检测，WT为野生型对照。图3. 0sbZIP46CAl的超表达植株干旱胁迫下的表型，0X1、0X7为超表达家系，ZHl I
为野生型。图4. 0sbZIP46CAl的超表达植株干旱胁迫下的存活率统计，0X1、0X7为超表达家系，ZHll为野生型。图5. 0sbZIP46CAl的超表达植株离体叶片失水速率测定，CAlU-I OX, CA1U-3 OX为超表达家系，CA1U-4 NOX为转基因阴性家系，ZHll为野生型对照。
图6. 0sbZIP46CAl 的超表达植株渗透胁迫表型，0sbZIP46CAlU_l，0sbZIP46CAlU_5为0sbZIP46CAl超表达家系，0sbZIP46U-15为0sbZIP46全长的超表达家系(作为对照)，ZHll为野生型对照。图7. 0sbZIP46CAl的超表达植株渗透胁迫下株高统计，15_0X、2_0X为超表达家系，15-NCK.2-NCK为分离出来的转基因阴性家系。图8. 0sbZIP46CAl超表达植株中下游基因的诱导情况，CA10X-2，CA10X-5为0sbZIP46CAl超表达家系，FL0X-9, FLOX-15为0sbZIP46全长的超表达家系(作为对照)，ZHll为野生型对照。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离、克隆包含有0sbZIP46CAl基因完整编码区段的DNA片段，以及验证0sbZIP46CAl基因功能的方法。根据以下的描述的全部或部分实施步骤，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。l、0sbZIP46CAl蛋白转录激活活性研究申请人:的发明人用 ProQuest Two-Hybrid System(Invitrogen, Carlsbad, CA,USA)在酵母中做了 0sbZIP46CAl蛋白质的转录激活活性分析。首先通过PCR得到了 0sbZIP46基因的全长以及一系列缺失片段。通过查找在水稻基因组注释网站 TIGR (http: //rice, plantbiology. msu. edu/) 0sbZIP46 基因的注释号L0C_0s06gl0880,与 KOME (http://cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/) 0sbZIP46基因的注释号AK103188，在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建的明恢63全生育期平衡化cDNA文库(Chu等，2003)中检索到一个含有0sbZIP46基因编码区5 ’部分序列的cDNA克隆(克隆号BI 103-013)(该文库对外公开的网址http: //redb. ncpgr. cn/modules/redbtools/),从文库中挑取该克隆，抽提质粒，利用通用引物SP6(5’ -AITTAGGTGACACTATA-3’)、T7(5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’ )从两端进行了测序验证，测序工作在本室ABI7500仪器上完成。然后与KOME数据库中的0sbZIP46基因的全长cDNA进行序列比较，确定克隆BI 103-013包含0sbZIP46基因的完整开放阅读框。利用上述克隆为模板，使用正向引物 0sbZIP46p32Fl_attBl (5’-ggacaagtttgtacaaaaaagcaggctTGGAGITGCCGGCGGATG-3’)，和下列的I个反向引物分别进行PCR扩增，0sbZIP46p32Rl_attB2(5’-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCAGCATGGACCAGTCAGTG-3 ’),0sbZIP46p32R2_attB2(5’-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCMGTGATTCTCTCCATGAC-3 ’),0sbZIP46p32R4_attB2(5’-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACTCGACGGTAGGGCCCTTC-3，)，0sbZIP46p32R5_attB2 (5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACAGCATCCCGTTGGCGAGC-3，)，0sbZIP46CA0R-attB2(5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACATGTCCTCCCGCACGAC-3’),0sbZIP46p32R6_attB2(5’-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACGCAGCCGCCGCCGCCGCGGGGTC-3’)，0sbZIP46p32R7_attB2(5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCACGCCGCCGGCGCTATGGCCTG-3，)，反应条件为94°C 预变性5min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，32 个循环;72°C延伸 5min。得到的片段分别命名为 FL, dCl，dC3，dC4, dC4. 5，dC5, dC6，分别指代 0sbZIP46 全长、缺失 0sbZIP46 的 3，端 19、85、144、175、204、264个氨基酸的片段。0sbZIP46CAl的克隆使用交错延伸PCR的方法，仍以上述克隆 BI 103-013 为模板，分别用两对引物 0sbZIP46p32Fl-attBl(5’_ggacaagtttgtacaaaaaagcaggctTGGAGTTGCCGGCGGATG-3’)/0sbZIP46CuActRl(5’-CGCAGCCGCCGCCGCCGCGGGGTC-3，)和 0sbZIP46CuActFl(5， -GACCCCGCGGCGGCGGCGGCTGCGTCGCCGGTGCCTTACCCA-3， )/0sbZIP46p32Rl_attB2 (5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCAGCATGGACCAGTCAGT6_3，)进行 PCR 扩增，反应条件为:94°C预变性 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，32 个循环；72°C延伸5min。再以将上轮PCR反应的两个PCR产物混合作为为模板，以引物0sbZIP46p32Fl_attBl(5，-ggacaagtttgtacaaaaaagcaggctTGGAGTTGCCGGCGGATG-3，)/0sbZIP46p32Rl-attB2 (5，-ggaccactttgtacaagaaagctgggtTCAGCATGGACCAGTCAGTG-3，)进行第二轮 PCR 扩增，反应条件为:94°C预变性 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，35 个循环；72°C延伸5min,弓丨物再第8个循环时加入，PCR扩增得到的片段命名为0sbZIP46CAl，即缺失0sbZIP46第361位至第657位碱基(涉及编码0sbZIP46的第121至219位氨基酸的部分)。然后将这些片段克隆到相应的载体中去并转化酵母进行转录活性研究，具体步骤如下扩增片段通过BP反应进入中间载体pD0NR221(购自Invitrogen公司)，分别命名为 FL/dCl/dC3/dC4/dC4. 5/dC5/dC6/0sbZIP46CAl_p221 并测序验证，然后通过 LR 重组反应到酵母GAL4-DB融合表达载体pDEST32 (购自Invitrogen公司)，分别命名为FL/dCl/dC3/dC4/dC4. 5/dC5/dC6/0sbZIP46CAl-p32。然后转化酵母菌株May203 (购自 Invitrogen 公司，生态型为 MATa，leu2_3，112，trpl-901，his3 A200,ade2-101, gal4A , gal80A , SPALlO::URA3, GALl::lacZ, HIS3UAS GALl::HIS30LYS2，canlR, cyh2R)。经和 Colony-lift filter 检测 3-Galactosidase 酶活性，以酵母是否显蓝色确定报告基因LacZ的表达，从而确定基因是否具有转录激活功能(具体步骤参照Invitrogen公司操作手册)(图I)。试验结果显示，0sbZIP46全长和缺失3’端19、85、144、175个氨基酸的片段都无转录激活活性，而缺失3’端204个氨基酸(dC6)、缺失3’端264个氨基酸(dC7)或缺失第121至219位氨基酸(0sbZIP46CAl)的片段都表现出很强的转录活性，推论0sbZIP46的第120至149位氨基酸之间存在一段负调控0sbZIP46转录激活活性的区段，而0sbZIP46CAl为人工改造的去除了中间的负调控区段、具有强转录激活活性的0sbZIP46新形式，同时它也包含了 DNA结合和寡聚化所必需的bZIP (碱性亮氨酸拉链区)结构域，所以0sbZIP46CAl作为一种0sbZIP46的组成性活性形式，将成为本发明的主要研究对象(图I)。2、0sbZIP46CAl基因超量表达载体的构建和遗传转化超量表达载体的构建为了研究0sbZIP46CAl基因的抗逆功能，申请人将其在水稻中超量表达，期望从转基因植株的表型来研究该基因的功能。超量表达载体构建方法如下上述试验我们已获得了 0sbZIP46CAl的克隆0sbZIP46CAl_p32，以此克隆为模板，用引物 0sbZIP46-F-Kpnl (5，-ATAggtaccATGGAGITGCCGGCGGATG-3，)/0sbZIP46-R_BamHl (5’-ATAggatccTCAGCATGGACCAGTCAGTG)进行 PCR扩增，PCR产物用 KpnI 和 BamHI 双酶切；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pCAMBIA1301U(pCAMBIA1301U是在国际上常用的植物遗传转化载体PCAMBIA1301基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体)，酶切完毕，用氯仿异戊醇(体积比为24 I)抽提，纯化酶切产物。用包含0sbZIP46CAl基因的酶切片段和酶切的PCAMBIA1301U载体做连接反应，其后转化大肠杆菌DHlO ^ (该大肠杆菌DHlOP菌株购自Promega公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为0sbZIP46CAl-1301U(图 2A)。遗传转化步骤通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述超表达载体0sbZIP46CAl-1301U转入到水稻品种“中花11”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hi ei等,Efficient transformationof rice,Oryza sativa L. ,mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA,Plant J,6 :271-282,1994)基础上改良进行。本实施例的具体遗传转化步骤如下(I)电转化用1800v电压，将最终超表达目标载体0sbZIP46CAl_1301U电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。(2)愈伤组织诱导将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用70%的乙醇处理I分钟；0. 15%氯化汞(HgCl2)表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1°C。(3)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1°C。(4)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1°C。(5)农杆菌培养在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105 (来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的超表达载体0sbZIP46CAl_1301U)两天，培养温度28V ;将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)，28°C摇床上培养2-3小时。(6)农杆菌侵染将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至0D_ 0. 8-1. 0 ;将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20°C。(7)愈伤洗漆和选择培养灭菌水洗漆愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm,潮霉素浓度250ppm)。(8)分化将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7天；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照(35001uX)下培养，温度26°C。(9)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C。(10)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
培养基组分及其配方(I)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA (6-BenzyIaminoPurine, 6-节基腺嘌呤)；CN (Carbenici 11 in,羧节青霉素)；KT (Kinetin,激动素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_aceticacid, 口引哚乙酸)；2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone,乙酸丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚讽)；N6max (N6 大量成分溶液);N6mix (N6微量成分溶液);MSmax (MS大量成分溶液);MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(IOX)]的配制
硝酸钾(KNO3)28.3 g
磷酸二氢钾(KH2PO4)4.0 g
硫酸铵((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸镁(MgSO4IH2O)1.85 g
氯化钙(CaCl2 OH2O)1.66 g逐一溶解,然后室温下定容至1000ml。2) N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制
碘化钾(KI)0.08 g
硼酸(H3BO3)0.16 g
硫酸锰(MnSO4MH2O)0.44 g
硫酸锌(ZnS04.7H20)0.15 g室温下溶解并定容至1000ml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制
烟酸(Nicotinicacid)0.1 g
维生素BI (Thiamine HCD0.1 g
维生素B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氨酸(Glycine)0.2 g
肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存备用。5)MS培养基大量元素母液(IOX)的配制硝酸铵(NH4NO3)16.5 g
硝酸钾19.0 g
磷酸二氢钾1.7 g
硫酸镁3.7 g
氯化钙4.4 g室温下溶解并定容至1000ml。6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
碘化钾0.083 g
硼酸0.62 g
硫酸锰0.86 g
钼酸钠(Na2MoO4JH2O)0.025 g
硫酸铜(CuSCV5H20)0.0025 g室温下溶解并定容至1000ml。7)2,4-D|C存液(lmg/ml)的配制称取2，4-D lOOmg，用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至IOOml,于室温下保存。8)6-BA|C存液(lmg/ml)的配制称取6-BA IOOmg,用ImllN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。9)萘乙酸(NAA)贮存液(lmg/ml)的配制称取NAA IOOmg,用ImllN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至IOOml，4°C保存备用。10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(lmg/ml)的配制称取IAA lOOmg，用ImllN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4°C保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4 *7H20)2. 78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水用。11)葡萄糖贮存液(0. 5g/ml)的配制称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。12) AS贮存液的配制称取AS 0. 392g, DMSO 10ml，分装至I. 5ml离心管内，4°C保存备用。13) IN氢氧化钾贮存液称取氢氧化钾5. 6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方I)诱导培养基N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素IC存液(100X)IOml
2，4-D 贮存液2.5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 g
CH0.6 g
鹿糖(Sucrose)30g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
2,4-D 贮存液2.0 ml
脯氨酸0.5 g
CH0.6 g
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素存液(100X)2.5 ml
2,4-D 贮存液0.75 ml
CH0.15 g
蔗糖5 g
琼脂粉(Agarose)1.75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u I AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2.4-D贮存液0.75 ml CH0.2 g 蔗糖5g 琼脂粉1.75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u I AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)0.5 ml
维生素贮存液(100X)I ml
2,4-D 贮存液0.2 ml
CH0.08 g
蔗糖2 g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入Iml葡萄糖贮存液和100 u I AS贮存液。6)选择培养基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
2.4-D存液0.625 ml CH0.15 g
蔗糖7.5 g
琼脂粉1.75 g加蒸馏 水至250ml，调节pH值到6. 0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 U IHN和400ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/皿)。7)预分化培养基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5 ml
维生素贮存液(100X)2.5 ml
6-BA贮存液0.5 ml
KT贮存液0.5 ml
NAA贮存液50 nl
IAA C存液50 pi
CH0.15 g
蔗糖7.5 g
琼脂粉1.75 g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 u IHN和200ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/ M )。 8)分化培养基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
6-BA贮存液2 ml
KT贮存液2 ml
NAA贮存液0.2 ml
IAA贮存液0.2 ml
CHIg
蔗糖30 g
Phytagel3 g 加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6. O。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。9)生根培养基
MSmax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)5 ml
维生素贮存液(IOOX)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。3、0sbZIP46CAl超表达植株的表达量鉴定本发明采用荧光实时定量PCR方法对上述第2步获得的转基因水稻植株中0sbZIP46CAl基因的表达进行检测。总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照TRIZOL试剂说明书，利用反转录酶SSIII (购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为65°C 5min,50°C 60min,70°C IOmin0以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物 (0sbZIP46rtNTterminalF :5’ -AAGCGCCGAGAAGGATTTC-3’ 和 0sbZIP46rtNTterminalR :5，-CCGCCGTCCAGATGTTG-3，)对0sbZIP46CAl基因进行特异的PCR扩增。同时用引物(actin76F :5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3，和 actin76R :5，-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3，)对水稻Actinl基因(登录号X16280)做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为95°C IOsec ；95°C 5sec，60°C 34sec，45个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。表达量检测结果显示，大部分转基因植株中0sbZIP46CAl基因的表达量相对于野生型显著提高(图2B)。4、0sbZIP46CAl超表达植株的干旱胁迫表型鉴定为了验证0sbZIP46CAl超表达植株的抗旱性，我们对超表达植株进行了干旱胁迫表型鉴定，将两个超表达家系(0X7，0X1)和野生型家系(ZHll)种子去壳消毒(浓度为70%酒精处理lmin，0. 15%氯化汞处理lOmin，无菌水清洗数次)，在含有100mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，中花Il(ZHll)家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，4-5天后挑选发芽好且长势一致的植株种到小圆桶中，每桶种转基因植株和野生型对照各25株。试验用的土壤为泥土与粗沙按体积比为2 3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。植株生长到三至四叶期时对每个小红桶中进行断水处理。断水至叶片全卷，叶尖开始发白(一般6-10天，具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5-7天，观察表型并统计植株的存活率。结果显示，在干旱胁迫过程中，野生型对照的叶片卷曲，失绿，萎蔫的速度要快于超表达植株。在复水并恢复生长一段时间之后，野生型对照几乎都枯死而超量表达家系大部分植株仍然活着，且能很快恢复生长新的绿叶。进一步统计存活率发现野生型对照存活率低于10%，而超表达植株的存活率显著高于同桶种植的野生型对照(在50%以上)。与野生型对照相比，超表达植株对干旱胁迫表现出更强的抗性，说明0sbZIP46CAl超表达后提高了植株的抗旱性(图3和图4)。5、0sbZIP46CAl离体叶片失水速率测定为了进一步验证0sbZIP46CAl超表达植株的抗旱性，我们对超表达植株进行了离 体叶片失水速率的测定，将分蘖期植株的部分叶片剪下，置于室温条件下，分别在不同的时间点称量叶片的重量，统计其失水速率的快慢。失水率的计算公式为失水率y(%)=(XO-Xn)/XOX 100，XO为开始时植株的重量，Xn为某时间点植株的重量。结果显示，超表达植株(CA1U-1 OX, CA1U-3 OX)的叶片失水速率显著低于转基因阴性对照(CA1U-4 NOX)和野生型对照(ZHll)(图5)。6、0sbZIP46CAl超表达植株在渗透胁迫下的表型本实施例选取两个超表达家系(0sbZIP46CAlU-l，0sbZIP46CAlU_5)和野生型家系(ZHll)以及一个0sbZIP46全长超表达家系(0sbZIP46U-15)种子去壳消毒(浓度为70%酒精处理lmin，0. 15%氯化汞处理lOmin，无菌水清洗数次)，在含有100mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，中花Il(ZHll)家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有或不含150mM甘露醇的1/2MS培养基中继续生长。7天后拍照并调查植株的株高。因为在不含甘露醇培养基上超量表达植株与对照的长势不一致，用相对株高(甘露醇培养基上生长植株的株高除以正常培养基上生长植株的株高)来衡量植株对渗透胁迫的抗性。0sbZIP46CAl超量表达植株的相对株高显著高于野生 型和0sbZIP46全长超表达家系(图6和图7)，说明超表达0sbZIP46CAl基因提高了转基因植株抗渗透胁迫的能力。7、0sbZIP46CAl超表达植株下游基因的诱导情况采用荧光实时定量PCR方法(方法同第3步所述)对0sbZIP46CAl超表达植株中的三个下游基因及0sbZIP46基因本身表达量进行了检测，选取两个0sbZIP46CAl超表达家系(CA10X-2，CA10X-5)为检测对象，两个0sbZIP46全长的超表达家系(FL0X-9，FLOX-15)以及野生型(ZHll)为对照，实验结果表明，两个0sbZIP46CAl超表达家系和两个0sbZIP46全长的超表达家系的0sbZIP46基因或0sbZIP46CAl基因超表达量基本相当，但0sbZIP46CAl超表达家系中的下游基因相比野生型对照受到强烈的诱导，而0sbZIP46全长的超表达家系中的下游基因相比野生型对照诱导很微弱或基本不诱导，而这些下游基因大都是参与抗旱应答的。说明超表达0sbZIP46CAl相比超表达0sbZIP46全长更能提升植株的抗旱应答响应(图8)。
权利要求
1.人工改造的0sbZIP46CAl基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
2.人工改造的0sbZIP46CAl基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
3.人工改造的0sbZIP46CAl基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的编码的蛋白质缺失了 0sbZIP46蛋白的负调控区域且具有组成型转录激活活性。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种人工改造的OsbZIP46CA1基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用。所述的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，该基因的编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。本发明采用基因改造的方法，克隆了水稻bZIP家族基因OsbZIP46缺失内部297个碱基后的片段OsbZIP46CA1，实验证明OsbZIP46CA1具有强转录激活活性，通过转基因技术超量表达OsbZIP46CA1基因后增强了水稻抗旱的能力，证实了该基因的功能及应用途径。
文档编号C07K14/415GK102747098SQ20111009968
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者唐宁, 熊立仲 申请人:华中农业大学